用于关节内粘弹性补充的方案

摘要

本发明涉及用于关节内粘弹性补充的方案。具体地，本发明提供一种粘弹性补充装置，包括包含6、6.25、6.5、6.75、7、7.25、7.5、7.75、8、8.25、8.5、8.75、9、9.25、9.5、9.75或10ml的粘弹性补充剂的注射器，其中所述粘弹性补充剂是hylan G-F 20。本发明利用较少次注射提供了高于多次注射明显的优点，包括避免了副作用、降低了成本和较好的患者顺应性。

说明书

本申请是申请号为200580045353.2，申请日为2005年12月20日， 发明名称为“用于关节内粘弹性补充的方案”的中国专利申请的分案申 请。

技术领域

本发明涉及风湿病学和整形外科。更具体而言，本发明涉及通过 粘弹性补充(viscosupplementation)治疗软骨组织病症(例如骨关节炎)。

背景技术

骨关节炎(OA)为渐进性退化性疾病，特征为关节内软骨破坏、 关节连接中存在的滑液变质和伴有骨赘形成的软骨下骨质硬化。患有 OA的患者通常表现出严重的疼痛，其影响了它们日常生活的许多方 面。OA的流行随着年龄而增加，超过60％的60岁或更年长的那些人 可能患有某些软骨异常(Bjelle(1982)Scand.J.Rheumatol.Suppl., 43:35-48)。OA已经成为关节炎中花费最高的形式，总计占西方国家国 民生产总值达1-2.5％(Reginster(2002)Rheumatology,41(Suppl. 1):3-6)。

滑液润滑和保护关节内的关节面。该液体主要由高分子量的多糖 透明质烷(HA，透明质酸的钠盐，也称为透明质酸钠)。在正常人滑 膜关节液体中HA的浓度为约3mg/ml。HA由N-乙酰葡糖胺和葡萄糖 醛酸钠的重复二糖单元组成(图1)。在正常的关节滑液中的HA包含 12,500个二糖单元，总分子量(MW)为5MDa(Balazs等(1993) J.Rheumatol.Suppl.,39:3-9)。在OA患者中，滑液中HA的浓度和MW 降低，导致保护软骨的液体的能力的减少。

已经表明，关节内注射包含高分子量HA的弹粘性溶液可恢复患 病关节的正常内环境稳定。这一过程，称为粘弹性补充，已证实可有 效地减少疼痛和增加关节功能(参见，例如Balazs等(1993)J. Rheumatol.Suppl.,39:3-9；Wobig(1998)Clin.Ther.,20(3):410-423)。

许多基于HA粘弹性补充剂为市售的，且新产品正在研究中。粘 弹性补充剂在许多特性方面不同，若有的话，包括，例如，HA的来源 (动物-衍生的或细菌)，HA的浓度和MW，使用的类型和化学交联度。 通常，大部分粘弹性补充剂包含5-15mg/ml HA，一旦注射具有的存留 半衰期为几小时至几天。将这样的粘弹性补充剂以2-3ml单位容积注 射到膝中，每隔一周分别注射三至五次。在某些情况下，疼痛缓解可 发生在几天内，连续持续几周，通常持续几个月，甚至达到一年。例 如，已经证实，在每周给药，三次(每次2ml)(hylan G-F 20； Genzyme Corp.,Cambridge,MA)的膝粘弹性补充比在6个月内用非甾 体抗炎药(NSAIDs)的连续口服加关节穿刺术的治疗(Adams等(1995) Osteoarthritis and Cartilage,3:213-225)至少要好，或较好，且比生理盐 水安慰剂或关节穿刺术对照更有效(Moreland(1993)Am.Coll. Rheumatol.(57th Ann.Sci.Meeting,Nov.7-11,San Antonio,TX),165； Wobig(1998)Clin.Ther.,20(3):410-423)。

连续多次注射被认为对于延长治疗骨关节炎疼痛的(六个月或一 年)效果是必需的，主要是因为大部分粘弹性补充剂的存留半衰期短 (Peyron(1993)J.Rheumatol.,20(Suppl.39):10-15)。例如，如在兔 子中测定时，1％具有平均MW为1.7-2.6MDa的HA的关节内存留半 衰期为11小时。当HA的MW增加时，存留半衰期也延长(例如，其 中HA的平均MW为6MDa的1％hylan A具有的半衰期为1.2±1天)。 然而，即使是不溶性凝胶，例如包含0.4％HA的hylan B，具有7.7±1 天的相对短的存留半衰期。按照半衰期数据，对于减少OA疼痛而言， 与二次2ml注射相比，将三次2ml的注射入OA膝中证实可 显著地更有效(Scale等(1994)Curr.Ther.Res.,55(3):220-232)。

对于用治疗患有髋部OA的患者，推荐剂量为一次2ml 注射，如果没有感受到足够的疼痛缓解，可在一至三月内进行第二次 任选的注射给药(Chevalier(2000)Am.Coll.Rheumatol.(64th Annual  Scientific Meeting,Oct.30-Nov.3,Philadelphia,PA))。在髋部OA患者 中，截止三个月(研究的持续时间)内，在大多数登记得患者中，以2 ml单次关节内注射显示出即刻的和持续的症状疗效。还没有 研究与多次注射2-3ml或单次注射2ml相比，用更少次注射较大体积 的粘弹性补充剂例如(例如4、6ml或更多)是否可提供相 等的或较好的功效。就目前已知的而言，使用较大体积可造成局部副 作用例如疼痛、肿胀和渗出的危险。

Durolane^TM(Q-Med AB,Uppsala,Sweden)为被推荐以3ml注射 一次的唯一粘弹性补充剂。其为环氧交联的粘弹性补充剂，具有较长 报告的半衰期(4周)和较高的HA(20mg/ml)。延长的保留时间被认 为使注射次数减少。然而，单次注射Durolane^TM没有证实高于安慰剂 的统计学益处(Altman等(2004)Osteoarthritis and Cart.,12:642-649)。

这样，在本发明之前，还不知道单次注射基于HA的粘弹性补充 剂，尤其是一种具有短保留期的，是否可产生想要的长期治疗效果。

利用较少次注射提供了高于多次注射明显的优点，包括避免了副 作用、降低了成本和较好的患者顺应性。仍旧存在研究新的粘弹性补 充治疗的需要，其能提供对OA患者的有效缓解，而不需要多次注射。

发明内容

本发明提供用于治疗关节病症和用于减少与此病症有关的疼痛和 不适的的方法和组合物。这种病症的实例包括骨关节炎和关节损伤。

本发明是，至少部分是，基于发现了单次关节内注射较大体积的 粘弹性补充剂可提供相当于小体积连续注射产生的长期治疗益处。在 进行与本发明有关的研究中，一组膝OA患者接受如下标准顺序的治 疗：在三周期间内，在膝部，注射三次，每次2ml；而另一 组接受在同等条件下的6ml的单次注射。出人意外地是，如在治疗后 26周评价，发现治疗效果在两组中是相当的。因此，单次注射较大体 积的粘弹性补充例如可以和几次小体积注射同样有效，而保 持了良好的安全特性。

因此，本发明提供用基于HA的粘弹性补充剂用于关节内粘弹性 补充的方案，所述粘弹性补充剂特别是具有关节内存留半衰期(T_1/2) 短于3周的粘弹性补充剂。在本发明中使用的粘弹性补充剂可进一步 表征为：其中它们包含小于20mg/ml HA(衍生的和/或非衍生的)，其 中至少5％为凝胶形式，比如例如hylan B。在一个说明性的实施方案 中，粘弹性补充剂为hylan G-F 20其包含8±2mg/ml HA， 其中10％重量为凝胶形式。

在某些实施方案中，粘弹性补充剂以足量单次注射给药，在注射 后，所述剂量提供了达6个月的治疗效果。在某些实施方案中，大体 积单次注射的治疗效果基本上与在治疗过程内三次注射给药(每次大 体积的1/3)获得的相同。在一个说明性的实施方案中，在三周期间内， 以6ml单次注射给药，而不是三次2ml注射。

也提供给药的方法、组合物和在本发明的方法中使用的装置。

上述简述及其后的说明并不是限制要求保护的本发明。

附图说明

图1图解了透明质烷(透明质酸钠)的结构。

具体实施方式

定义

术语“关节内半衰期”、“存留半衰期”和它们的同源词指如下时 间，其为适于将给定的粘弹性补充剂注射入关节内区域的任何时间中 较大(的时间)：(a)清除50％注射的HA凝胶组分需要的时间；(b) 清除50％注射的HA液体组分需要的时间；和(c)清除50％HA需要 的时间，无论其是否为液体、凝胶或另一种形式。用于计算存留半衰 期的目的，除非另有说明，注射被认为是给药进入成年人的膝关节的 关节内区域。用于测定存留半衰期的方法是本领域已知的，说明性的 方法为在实施例中描述的。

术语“HA液体”、“HA液体相”、“HA液体组分”、“可溶性HA” 和它们的同源词指具有小于20MDa的平均MW的非交联的或微交联 的(lightly crosslinked)水溶性HA。

术语“HA凝胶”、“HA凝胶相”、“HA凝胶组分”和它们的同源 词指HA凝胶，其为不包含可溶性HA或包含小于10％(w/w)可溶性 HA的基于HA的组合物的水不溶性部分。典型地，给定基于HA的组 合物中凝胶的含量可以通过从HA液体中分离HA凝胶来测定，所述 组合物包含HA凝胶和HA液体的混合。分离可通过例如45μ过滤器 过滤组合物来实现，所述过滤器使可溶性HA穿过，而保留不溶相。 为了使更粘性组合物中的可溶性HA从HA凝胶中的释放达到最大， 需要在过滤前用几体积有或没有使其达到平衡的溶剂稀释组合物。而 且，通常，基于它们的流变学性质，纯凝胶可与纯液体区分，所述流 变学性质例如储能(弹性的)模量(storage(elastic)modulus(G')和 损耗(粘性的)模量(loss(viscous)modulus)(G")，其分别表示随 着变形速率(测试频率)的改变，物质可以回收(弹性应答(elastic  response))或流动(粘性应答(viscous response))的相对程度。这两 个模量都为频率的线性函数。它们已被证明是聚合物溶液和凝胶结构 的灵敏的探针。G'和G"随着频率的增加而增加，但是一个比另一个增 加的更快。在其中G'＝G"时，该频率被称为交叉频率(f_c)。交叉频率 随着聚合物分子量或浓度的增加而降低。对于在低频率的聚合物溶液， 弹性应力松弛和粘应应力占主导，因此，在频率低于f_c时，G"大于G'。 相反，对于凝胶，不会存在G'和G"交叉，在频带中G'大于G"。除非 另有说明，测试频率为0.04-7Hz。对于粘弹性材料的物理性能和测定 这些性质的方法的综述，参见，例如“Polymers as Rheology Modifiers”, 由Schulz和Glass编辑,ACS Symposium Series 462,1991；”An  Introduction to Rheology,”H.A.Barnes,J.F.Hutton和K.Walters,Elsevier, 1989；和Bohlin Rheometer Application Notes MRK544-01,MRK556-01 和MRK573-01。

术语“HA”、“透明质酸盐”、“透明质烷”可交换使用，除非另有 说明，指任意HA，而不考虑来源(细菌发酵的或动物衍生的)、分子 量、其物理形式(例如凝胶或液体)，或存在或不存在化学改性(例如 交联的或其它衍生化的)或制备方法。

方案

本发明提供粘弹性补充方法和相关的方法。根据本发明，粘弹性 补充方法包括在3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26周内单次关节内注射给药 粘弹性补充剂，给药量足以在注射后提供达4、5或6个月的治疗效果。 在某些实施方案中，大体积单次注射的治疗效果基本上与在治疗过程 内三次注射给药(每次为大体积的1/3)获得的相同。在某些实施方案 中，单次注射方案提供在注射后关节痛减少直至4、5或6个月。

治疗效果可以通过任意适宜的方法(参见，例如，Altman等(1996) Osteoarth.Cart.,4:217-243)评价。例如，治疗效果可通过测定关节痛 的减少来评价。关节痛的程度可以根据五点Likert分类(例如没有、 轻度、中度、严重、非常严重)，或者按如在实施例中描述的100mm 直观类比尺(scale)(VAS)分类。其它适宜的疼痛指数包括健康状态 评估调查表(HAQ)(Fries等(1980)Arthritis Rheumatol.,23:137-145) 和关节炎影响检测尺(Arthritis Impact Measurement Scale)(AIMS) (Meenan等(1980)Arthritis Rheumatol.,23:146-154。

治疗效果也可通过测定功能缺损程度的改善来评价。功能缺损可 使用分离有效的多维指数(segregated validated multidimensional index) (SMI)，例如用于髋部和膝OA的Western Ontario和McMaster's大学 (WOMAC^TM)OA指数(Bellamy等人(1988)J.Rheumatol. 34:1833-1840；也参见实施例)；或聚集的多维指数(aggregated  multidimensional index)(AMI)，例如用于髋部或膝的痛-函数指数 (Algo-Functional Index)(AFI)(Lequesne等人(1987)Scand.J. Rheumatol.Suppl.,65:85-89)。

治疗效果也可由患者或医师通过总体状况评估来评价。总体状况 可利用Likert或VAS尺来评价，例如在实施例中描述的。

治疗效果的其它标记可包括关节检查(参见，如Theiler等人(1994) Osteoarth.Cart.,2:1-24)，基于性能测定(performance based measures) (参见，例如Rejeski等人(1995)Osteoarth.Cart.,3:157-168)等。

在某些实施方案中，给药进入膝关节的粘弹性补充剂的量为6±2 ml或更高，例如4、4.25、4.5、4.75、5、5.25、5.5、5.75、6、6.25、 6.5、6.75、7、7.25、7.5、7.75、8ml或更高。

粘弹性补充剂

在本发明的方法中使用的基于HA的粘弹性补充剂具有下述任一 项、任两项或所有的特征：

(i)粘弹性补充剂具有小于3周的存留半衰期。

(ii)粘弹性补充剂包含小于20mg/ml HA；

(iii)在粘弹性补充剂中5％(w/w)或更高的HA为凝胶形式。

在一个说明性的实施方案中，在本发明中使用的粘弹性补充剂为 包含两种形式的8±2mg/ml HA：可溶性形式，hylan A(平均MW 6,000kDa)和在生理学可接受的溶液中的水合凝胶形式， hylan B。按HA的重量计，在中的hylan A/hylan B比例为9:1。 Hylan A为通过用少量醛共价交联来化学改性的水溶性透明质烷，所述 醛典型地为甲醛，而hylan B为用二乙烯砜进一步交联的hylan A。Hylan 液体为水合的hylan A，用少量交联进行的改性形式的透明质烷，所述 交联增加了其平均分子量和增加了其粘弹性性质。Hylan凝胶为hylan B 的水合形式，其为使用二乙烯砜作为双功能的交联剂通过将hylan A交 联成连续聚合的网状结构制备的。

通常，在本发明提供的方案中使用的粘弹性补充剂包括具有关节 内存留半衰期短于22天例如21、20、19、18、17、16、15、14、13、 12、11、10、9、8、7、6、5、4和3天的基于HA的粘弹性补充剂。 在某些实施方案中，粘弹性补充剂的存留半衰期大于2、3、4、5、6 或7天。

在本发明中使用的粘弹性补充剂可进一步表征为：其中它们包含 小于20mg/ml HA，例如在1-15、1-10、1-5、5-15、5-10、10-15、6-10 和7-9mg/ml的范围。在给定组合物中的HA的含量可通过任意适宜的 方法测定，如例如在实施例中描述的方法。

在本发明中使用的粘弹性补充剂组合物可进一步表征为：其中在 粘弹性补充剂中至少10％重量的HA为凝胶形式。例如，在某些实施 方案中，粘弹性补充剂包含至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、 35％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、 95％、99％或更高的HA凝胶。在某些实施方案中，粘弹性补充剂包含 10-90％、10-75％、10-50％、10-40％、10-25％HA凝胶。在某些实施 方案中，在粘弹性补充剂中HA凝胶/HA液体的比例包含1:50-10:1 (w/w)，例如1:50、1:25、1:15、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、 1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1和10:1。

在本发明的方法中使用的粘弹性补充剂可进一步在液体相中包含 水溶性的HA，其具有HA的MW为500-20,000kDa，例如500-1,000； 500-1,500、500-3,000；500-5,000；500-7,000；500-10,000；500-15,000； 1,000-1,500；1,000-3,000；1,000-5,000；1,000-7,000；1,000-10,000； 1,000-15,000；5,000-10,000；和10,000-15,000kDa。

HA可以是动物源的，例如来源于公鸡冠或脐带或非动物源，例如 细菌发酵的。细菌发酵的HA可以如在例如Cooney等人(1999) Biotechnol.Prog.,15:898-910中描述的。细菌发酵的HA也可以为市售 的(例如Shiseido,Japan；Sigma-Aldrich,USA)。

HA可以是衍生的(例如交联的或另外改性的或稳定的)或非衍生 的。交联剂的实例包括醛、环氧化物、polyaziril、缩水甘油醚(例如 1,4-丁二醇二缩水甘油醚)和二乙烯砜。

在本发明的方法中使用的粘弹性补充剂的特定实例包括Adant^TM、 Arthrease^TM、Arthrum^TM、Fermathron^TM、Goon^TM、Hyalart^TM/Hyalgan^TM、 Hy-GAG^TM、Hya-ject^TM、Hyalubrix^TM、NeoVisc^TM、Supartz^TM/Artz^TM、 Orthovisc^TM、Ostenil^TM、Sinovial^TM、Suplasyn^TM和 Synochrom^TM、Viscorneal^TM(参见，例如Physicians'Desk Reference^TM, 2004)。其它适宜在本发明的方法中使用的产物包括在美国专利Nos. 5,143,724；4,713,448；5,099,013；5,399,351；6,521,223；5,827,937； 美国专利申请No.60/533,429中描述的粘弹性补充剂。

包括hylan A和hylan B的hylans和粘弹性补充剂的制备为在例如 美国专利Nos.5,143,724；4,713,448；5,099,013和5,399,351中描述的。

在某些实施方案中，粘弹性补充剂不包括Durolane^TM和/或其它的 具有存留半衰期比21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、 32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、 47、48、49或50天长的粘弹性补充剂。

粘弹性补充剂也可包含另外的活性或无活性化合物，包括例如非 甾体抗炎药(NSAIDs),例如Ibuprofen^TM、Diclofenac^TM和Piroxicam^TM； 麻醉剂例如，Lidocaine^TM和Bupivacaine^TM；麻醉性镇痛剂，例如，可 待因和吗啡；皮质类固醇，例如，地塞米松和泼尼松；抗肿瘤剂例如 Methotrexate^TM，5-氟尿嘧啶和Paclitaxel^TM和抗病毒剂，例如， Acyclovir^TM和Vidarabine^TM。粘弹性补充剂也可包含组分例如细胞(例 如软骨细胞或间充质干细胞)、蛋白质、DNA、维生素或其它想要的生 物学活性物质。

用途和给药

本发明提供用于治疗患有关节病症的患者和用于减少与这种病症 有关的疼痛和不适的方法和组合物。这种病症的实例包括骨关节炎(原 发性(自发性)或继发性)、类风湿性关节炎、关节损伤(例如重复性 的运动损伤)、软骨组织病症(软骨软化)和关节炎前状况。本发明进 一步提供减少与这种病症有关的疼痛的方法。该方法可在需要用于关 节病症治疗的人类中或在非人类患者中实施。

给药部位的实例包括膝的、肩膀的、颞下颌的和腕掌的关节、肘、 髋部、腕、踝和在脊柱中腰椎关节突(小平面)的关节。注射到任一 个这些关节中的体积将至少为用于那些关节的目前推荐剂量的双倍。

本发明进一步提供粘弹性补充装置，包括前灌注的、单次使用的 注射器，其包含6±2ml的单次单元剂量的例如4、4.25、 4.5、4.75、5、5.25、5.5、5.75、6、6.25、6.5、6.75、7、7.25、7.5、 7.75、8、8.25、8.5、8.75、9、9.25、9.5、9.75、10ml或更多。尽管 其优选地提供使用本文中提供的单次注射器的单次给药剂量，但是需 要的剂量可以由两个或多个注射器提供。例如，单次给药6ml可以使 用每个包含2ml的3个注射器完成。

下述实施例提供说明性的实施方案。所述实施例不以任何方式限 制本发明。本领域普通技术人员将认识到在本发明的范围内可进行多 种修饰和改变。因此，这样的修饰和改变包括在本发明内。

实施例

实施例1∶在患有OA的患者中的关节内注射

进行预期的、开放标记的研究用于评价在患有有症状的胫腿节OA (在研究的膝中的总体OA疼痛，在100mm VAS尺上为50-80)的非 卧床病人中进行关节内注射4ml或6ml的安全和功效(包括 作用的持续时间)，所述关节内注射4ml或6ml与目前三次 关节内注射2ml的配药方案相反。包含的其它条件为：年龄 在40岁以上；最近的3个月内通过X射线测定的Kellgren-Lawrence 等级为II-III；没有压力渗出液(tense effusion)、机能损耗(mechanical  deficit)或最近(<2年)的创伤。将100名患者(从59到66岁，平 均年龄61年，55％女性)随机分为五组：

第1组：一次注射6ml；

第2组：一次注射4ml；

第3组：隔两周注射4ml两次；

第4组：隔一周注射4ml三次；和

第5组：标准方案：隔一周注射2ml三次

然后，随访患者6个月(在第2、3、8、16和24周)。使用的第 一和第二评价点为如下所述的：

A.OA疼痛的患者自我评价

该研究的基本功效点用于评价在患有膝OA的患者中用粘弹性补充对研究膝OA疼痛缓解的功效。这点可在过去的48小时内 患者自我评价的100mm VAS上测定，没有疼痛的点(0mm)至极度 疼痛(100mm)；在第一次注射后的24周进行。

B.患者总体自我评价

患者在100-mm VAS上估计它们的靶标膝的整体状况，100-mm VAS其从很好(0mm)至很差(100mm)，考虑48小时内所有相关的 体征和症状。呈给患者的准确说明为下述的：“请利用下面的垂直线指 出你的(研究)膝在这次探访时的整体一般状况左侧或‘0’分表 示‘非常好’，而‘100’分表示‘非常差’”。

C.WOMAC^TM

患者完成了WOMAC^TM的VAS模型(version)，如在Bellamy等 的(1988)J.Rheumatol.,15(12):1833-40中描述的。该尺为三维的、 疾病特异性、自己管理的、健康状态测定方法。其探查疼痛区域内、 四肢强直和躯体功能总共24个问题的临床重要的患者相关的症状。将 WOMAC^TM以当地语言提供给患者，通常在小于5分钟内完成。 WOMAC^TM的分部为下述的。

WOMAC^TM部分A包括有关活动期间疼痛水平的询问，用没有疼 痛(0mm)至极疼痛(100mm)的VAS对回答评分(由患者)。疼痛 的评价采用下述方案：

1.在平面上行走？[走]

2.上楼或下楼？[爬楼梯]

3.在晚上在躺床上时？[夜间的]

4.坐着或躺着？[静止]

5.站直？[负重]

WOMAC部分A的平均得分是基于每人对部分A问题的回答。

WOMAC^TM部分B(四肢强直评分)包括有关活动期间强直严重 性的询问，用没有四肢强直(0mm)至极端四肢强直(100mm)的 VAS对回答评分(由患者)。四肢强直的评价采用下述方案：

1.在早晨苏醒后？[早晨四肢强直]

2.在白天剩余的后来时间(duing rest later in the day)？[在白天晚 些存在的四肢强直]

部分B的平均得分是基于每人对部分B问题的回答。

WOMCC^TM部分C包括有关活动期间功能缺损的询问，用没有困 难(0mm)至极困难(100mm)的VAS对回答评分(由患者)。功能 缺损的评价采用下述方案：

1.下楼梯？[早晨四肢强直]

2.上楼梯？[在白天晚些存在的四肢强直]

3.从坐着站立？[起立]

4.站？[站]

5.弯向地板？[弯曲]

6.在平面上行走？[平走]

7.上下车？[汽车]

8.上街？[购物]

9.穿短袜/长袜[脱短袜/长袜]

10.卧床[卧床]

11.进入/出浴池[进/出浴池]

12.坐[坐]

13.上/下洗手间[上/下洗手间]

14.重的家庭工作[重的家务]

15.轻的家庭工作[轻的家务]

部分C的平均得分是基于每人对部分C问题的回答。

从总WOMAC^TM得分基线上的改变来自分析在第一次注射后作为 第二端点的所有时间点的3个WOMAC^TM部分(A、B和C)。

D.医师OA总体评价

在患者完成总体评价和WOMAC^TM后，研究者用从很好(0mm) 至很差(100mm)的100-mm VAS评价探访时患者膝的整体状况。这 一评价是基于患者的病征、功能能力和身体检查。医师被要求指出在 这次探访时患者膝的整体一般状况，利用具有如下特征呈现的线 (line)：线的左侧(“0”)端指“很好”，右端(“100”)指“非常差”。

E.结果

在第一次注射后24周，与基线相比表现出疼痛减少的结果(在过 去48小时内的VAS；0相当于没有疼痛，100相当于极疼)显示在表1 中。与在3x2ml组中的36.7mm相比，在1x6ml组中疼痛按34.9mm 减少，其得分是最好的。在用1x4或2x4ml治疗组中，这一减少相当 少(仅24mm减少)。

表1.OA疼痛的患者自我评价(自基线的变化)

包括疼痛、四肢强直和功能缺损改善的第二功效点，如通过 Western Ontario和McMaster Universities Osteoarthritis指数 (WOMAC^TM)(表2为WOMAC^TM A)、患者(表3)和医师(表4) 总体膝OA评价测定的，显示出相同的趋势。按照功效和结果排序的 处理组显示在表5中。在第1组中观察的效果的延长持续时间是令人 惊奇的。依据安全性，在每个组(1x6ml和3x2ml)中10％的患者报

告了最少强度或中等强度的相关局部膝副作用(adverse events)(疼痛、

肿胀或渗出)。

表2.WOMAC^TM A疼痛得分(自基线的变化)

表3.患者总体评价(自基线的变化)

表4.医师总体评价(自基线的变化)

表5：处理组排列

关于安全性，在处理组之间没有观察到大的差异，一般而言，仅 仅第1组(1x6ml)具有最小副作用。这些结果也建议比2ml大的 体积可安全地给药，以减少患有膝骨关节炎的患者的疼痛。

实施例2∶存留半衰期的测定

A.将¹⁴C-乙酸酯加入到公鸡冠的器官培养物的透明质烷中

用颈脱位法处死幼公鸡(3-6个月龄)。用(80％)乙醇彻底地清 洗鸡冠，然后，利用解剖刀在基部切除。将过量的血从鸡冠中挤出， 将其放置在无菌盐溶液中，转移到层流净化罩中，用另外体积的无菌 盐溶液清洗三次。然后，沿着血管中线解剖鸡冠，切除长方形的粉红 色皮组织部分。用解剖刀将鸡冠组织部分切成切片，放置在Ventrex培 养基HL-1(Ventrex Labs)中：5mg/ml丙酸睾丸酮(Belmar Laboratories, Inwood,NY)、20μCi/ml的¹⁴C-醋酸(ICN Radiochemicals,Irvine,CA 1 mCi/ml)、0.1mg/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素和0.1mg/ml两性霉素 B(Hazelton,Lenexa,KS)。将单独培养物置入60mm塑料陪替培养皿 中，其包含约1.5g的鸡冠组织和15ml的培养基。在5％CO₂环境中 培养培养物72小时，之后，通过在10,000g离心10分钟将组织从培 养基中分离。将组织片冷冻在30mm陪替培养皿中。典型地，在继续 制备hylan的过程前，将冷冻的鸡冠组织保存在冰箱中1-72小时。

B.放射标记的hylan液体的制备

Hylan A纤维为如下制备的。将冷冻的放射标记的鸡冠组织的切片 以0.75g组织每1g反应培养基的比例放置在反应培养基中，所述反应 培养基包含丙酮、福尔马林(37％甲醛溶液)、氯仿和醋酸钠。允许反 应进行18-20小时，之后采集组织切片，在丙酮中洗涤三次，然后在层 流净化罩中干燥。然后，将四体积的蒸馏水加入到干的组织切片中， 以便提取放射标记的hylan。该水溶液提取在4-6℃下进行，之后，除 去水提物，加入同样体积的水，进行第二次提取。将固体醋酸钠溶解 在含水提取物中至浓度为1％，通过缓慢加入四体积的95％乙醇沉淀 hylan纤维。在丙酮中洗涤放射标记的hylan纤维两次，将其储存在冷 的丙酮下。

集中放射标记的hylan A纤维(40.3mg)，通过在4℃缓慢的翻滚 式混合(end-over-end mixing)3天，将其溶解在3.0ml无菌、无热原 的磷酸盐缓冲盐水溶液(Biotrics Inc.,Ridgefield,NJ，lot 122-1)中。 在完成溶解后，用未标记的hylan液体稀释放射性hylan液体五倍。将 混合物在4℃以翻滚式混合保存另外5天。

C.放射标记的凝胶的制备

将氚化水(New England Nuclear,100mCi/ml)混入用于将hylan 液体(hylan A)交联成hylan凝胶(hylan B)的反应混合物中。按如 下进行交联反应。将Hylan A纤维在氚化水中膨胀约三小时。加入浓缩 氢氧化钠，强力搅拌混合物直到溶液为均相的(约15分钟)。在水中， 将二乙烯砜稀释至50％的浓度，在强力搅拌下，将其加入反应混合物 中。将反应混合物保存在在室温下(22℃)另外55分钟，期间，通过 二乙烯砜将多糖链交联成连续聚合的凝胶(hylan凝胶)。通过在氚化 水中进行该反应，氚共价附着在二乙烯基磺酰基交联内的碳上。通过 加入十体积的无菌无热原的盐溶液以降低pH低于12来终止该反应。 生理盐水洗涤也引起hylan凝胶肿胀至其饱和水合(equilibrium  hydration)。用生理盐水洗涤hylan凝胶以除去未反应的二乙烯砜、未 反应的氚及其它反应产物，并使pH降至7。通过过滤从凝胶中分离过 量的生理盐水，之后，使凝胶穿过25g针5次，使固体凝胶分裂成易 于可注射的形式。在这种形式中，用无菌无热原的生理盐水彻底地渗 析氚化的凝胶以除去任意非共价结合的氚。

D.hylan凝胶-hylan液体混合物的制备

将氚化的hylan凝胶(3.04g)直接加入到11.63g的¹⁴C-hylan液 体中，将混合物置于Glen粉碎混合机中48小时。然后，使混合物连 续穿过18g、21g和25g针10次，以确保均匀性和易于注射。

E.HA浓度和放射性标记量的测定

混合物的凝胶和液体组分中hylan多糖的浓度为通过用于试验其 重复葡糖醛酸单体(3)的自动化卡唑法来测定，并乘以(2.07)以计 算多糖链的其余部分的浓度。在葡糖醛酸测定之前，通过在紧密密封 的顶部有罗纹的管中(tightly capped screw top tubes)将称重的0.1g凝 胶样品加入到0.2ml 1N H₂SO₄中水解hylan凝胶，在100℃进行酸性 水解2小时。在通过用卡唑法分析HA之前，用0.2ml的1N NaOH中 和在该过程中完全地溶解的样品。

卡唑法包括测定样品中己糖醛酸(葡糖醛酸)的含量。Dische等 人(1947),在J.Biol.Chem.,167:189-198中报道了通过比色法测定己 糖醛酸浓度的方法。该方法是基于用硫酸和卡唑对己糖醛酸进行显色 反应。Balazs等人在(1965)Anal.Biochem.,12:547-558中报道了用于 测定己糖醛酸的最新的自动化方法。在硫酸/硼酸酯介质中加热样品， 并与卡唑反应。卡唑与己糖醛酸反应形成具有在530nm有最大吸光率 的粉红色复合物。对于自动化方法，通过使用蠕动泵抽吸样品和标准 品穿过连续流量分析器。将试剂(酸和卡唑)加入反应室并加热，通 过连续流量比色计在530nm读取吸光率。

试验产品的放射性含量可在ISOCAP 300液体闪烁计数器(Nuclear  Chicago)中使用Scintiverse Bio HP(Fisher Scientific)作为闪烁剂通过 闪烁计数来测定。使用ISOCAP 300的外标比例程序将原始CPM数据 转化成DPM，所述程序相对于氚液体闪烁淬灭标准(Tritium Liquid  Scintillation Quench Standards)或碳-14液体闪烁淬灭标准(Carbon-14 Liquid Scintillation Quench Standards)(Amergham,Arlington Heights,II) 进行标准化。

F.存留半衰期的测定

在称重为2.5至3.5kg的新西兰白兔中测定来自膝关节的和其凝胶和液体组分的清除。将兔子分别在24小时、3、7和28天处 死。给药基本上如上所述制备的放射性物质，如关节内注射0.3ml(0.086 ml/kg体重)。该剂量水平预期相当于单次6ml给药至70kg 的人。同样地，在其它动物中给药的相应量与动物的重量成正比。

DPMs为如上述的每个组织中获得的，当适宜时，直接计算DPM /mg。分别对每种动物计算每个关节组织回收的总DPMs以及和DPMs 和DPM/mg。然后，在每个时间点，平均这些值，表示为平均值±平 均标准误差。计算的平均数以至少二位有效数字来报道，即使在其中 值很小并且动物与动物差别很大的情况下。通过均分独立的动物总数 计算在每个时间点关节恢复的总的平均DPM。

通过将每次的平均数拟合成指数函数(Y＝Ae^kx)进行半衰期的确 定。估计的标准误差是从曲线拟合获得的，除以A以获得预期的误差 百分数。其可乘以半衰期获得半衰期的预计误差。

G.结果

的凝胶组分(hylan B)为具有较长半衰期的部分。根据 放射性物质的清除率，测定凝胶组分的存留半衰期为7.7-8.8天。这样， 在30天，超过95％的凝胶将被清除。根据实验测定的凝胶的半衰期， 进行理论计算以估计预期在单次6ml注射后人类关节中的凝胶含量。 假设将约6mg的凝胶注入人类患者的膝中，在注射后第21天，剩余 凝胶的含量将为约0.9mg。

的液体组分(hylan A)比凝胶组分清除的更快。液体组 分的半衰期确定为1.2-1.5天。在第7天，99％注射的物质从兔子的膝 关节中清除。

也进行兔子肌肉植入物研究。在植入后第7和30天的显微镜检查 没有检测出任意剩余试验材料，其与关节内清除率的研究一致。

根据在说明书内引用的参考的教导，说明书可被最彻底地理解。 在说明书内的实施方案提供了本发明实施方案的说明，其将不会被解 释为限制本发明的范围。本领域技术人员易于认识到许多其它的实施 方案包括在本发明内。在该公开的内容中引用的所有出版物和专利以 其全部引入作为参考。至此，通过参考被人本申请的材料与本说明书 矛盾或不一致时，以本说明书内容为准。在本文中任意参考的引证都 是允许的，这样的参考都是本发明的现有技术。

除非另有说明，在包括权利要求的说明中使用的所有的表示成分 量、细胞培养和处理条件等的数字应当理解为在所有条件下可通过术 语“约”来修改。因此，除非另有相反说明，数字参数为近似值，可 根据寻求通过本发明获得想要的性质进行改变。除非另有说明，在一 组成分前的术语“至少”应当理解为指组中的每个成分。本领域技术 人员将认识到或能仅仅使用常规实验来确定，许多本文中描述的本发 明特定实施方案的同等方案。这样的同等方案指下述权利要求书包括 的。