一种增强作物抗环境非生物胁迫的方法

摘要

本发明提供了一种增强作物抗环境非生物胁迫的方法，包括以下步骤：将幼苗置于环境非生物胁迫的模拟池中，将同时含有1-氨基环丙烷-1-羧酸与茉莉酮酸甲酯的植物生长调节剂溶液均匀洒到幼苗的叶片上，喷洒的量以生长调节剂溶液完全湿润所有叶片为准。本发明为一种可以显著增加作物根部硝态氮累积的生长调节方式，从而明显提高作物对环境非生物胁迫的抗性，增强作物对于生长环境中重金属污染、盐胁迫等环境非生物胁迫的抗性。

说明书

技术领域

本发明涉及一种作物培养和生长调节方法，具体为一种通过植物生长调节剂的应用来增加作物根部的硝态氮分配比例，从而增强作物抗逆性的方法。

背景技术

地球上约有20%的表层土壤受到环境非生物胁迫的影响。这些土壤不仅分布在沙漠和半沙漠地区，而且还通常分布在肥沃的平原、河谷和沿海这些人口密集的灌溉地区。环境非生物胁迫主要可以分为两种：湿地胁迫和干旱胁迫。湿地胁迫是指靠海的沼泽地区，这些地区受到海水高盐含量的影响而产生盐胁迫。干旱地区胁迫主要分布在内陆的沙漠边缘。其它一些胁迫的影响地区主要为内陆湖和河流地区。环境非生物胁迫是指土壤或水源中含有的盐分或重金属物质等已经影响到了作物的正常生长。因此，提高作物环境非生物胁迫条件下的抗性，建立起一套提高作物抗逆的完整技术体系，对于减轻逆境胁迫对作物的影响和提高作物产量都至关重要。

硝态氮是陆生植物主要的氮源。在植物体内，硝态氮可以代谢为铵盐，通过谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶(GS-GOGAT)循环转变为谷氨酸，而谷氨酸可以进一步生成其他的氨基酸，从而参与构建蛋白质、核苷酸、叶绿素等各类分子。而更为重要的是，硝态氮本身和许多硝态氮的下游代谢产物可以作为信号分子调控植物的代谢、发育、生长和植物对环境的适应。硝态氮进入植物体内后，除了少部分在根部同化或储存在液泡中，大多数硝态氮会通过长途转运到植物的地上部分，在那里利用光合作用提供的碳骨架、能量和还原力，被同化为有机氮。由于这种氮同化的方式能够将碳、氮代谢直接偶联起来，具有能量进化优势，因此成为大多数植物的优先选择。由此可见，硝态氮的长途转运过程决定了硝态氮在植物地上和地下部位的分配比例，并进而决定了氮素同化的效率。  

然而，当外界环境不利时（例如低温、弱光或重金属），会有更多的硝态氮积存在根部，即逆境诱导的硝态氮再分配。该过程使得硝态氮同化过程中的碳氮代谢解偶联，可能会使得能量利用效率下降。然而这一生理过程仍然在进化过程中保存下来并被许多植物所采用。一种解释是，根中硝态氮的同化不会与叶中二氧化碳的固定争夺还原力和能量，有利于植物在不利环境下的生长。因此，从这一点来说，逆境诱导的硝态氮再分配（即逆境条件下让更多的硝态氮累积在作物的根系中）对于提高植物的抗逆性有重要的意义。        

在模式植物的研究中发现，逆境诱导的硝态氮再分配主要是由两个硝态氮转运蛋白NRT1.5和NRT1.8介导的。前者主要表达在根部的中柱鞘细胞，负责硝态氮向木质部的装载，后者主要表达在木质部的薄壁细胞，负责硝态氮自木质部的卸载。正常情况下，根部吸收的硝态氮通过NRT1.5装在进入木质部导管，转移至地上部分，而地上部分的NRT1.8将其卸载至木质部薄壁细胞，进而通过共质体运输至叶肉细胞。然而，当逆境来临时，根部NRT1.5表达量下调，减少了硝态氮向木质部的装载；同时， NRT1.8表达量上调，在根部卸载硝态氮。通过这种高度协调的转录调控，地上、地下部分的硝态氮比例在不同的环境条件下得以被精密调节。而且，体内逆境诱导的硝态氮再分配发生缺失的植物对逆境如重金属镉、盐胁迫、干旱等更为敏感。这些发现暗示了逆境诱导的硝态氮再分配可能以降低能量利用效率为代价提高对植物的抗性。   

可见，国内外对硝态氮的地上、地下部分配已经有较多研究，但是如何利用硝态氮的长途转运来调控作物对于环境非生物胁迫的抗性仍然没有很好的办法。此外，硝态氮长途转运的这种高度协同的转录水平的调控在面对多种逆境时都会发生，暗示逆境诱导的硝态氮再分配是一种面对逆境的普遍机制。但是，逆境诱导的硝态氮再分配是如何被启动的，启动后是怎样发挥作用并与外界环境相互作用的，仍然知之甚少。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，将以上背景技术中提到的理论知识通过作物外源生长调节物质（1-氨基环丙烷-1-羧酸和茉莉酮酸甲酯）的添加得以实际应用，提供一种可以显著增加作物根部硝态氮累积的生长调节方式，从而明显提高作物对环境非生物胁迫的抗性，增强作物对于生长环境中重金属污染、盐胁迫等环境非生物胁迫的抗性。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种增强作物抗环境非生物胁迫的方法，包括以下步骤：将幼苗置于环境非生物胁迫的模拟池中，将同时含有1-氨基环丙烷-1-羧酸与茉莉酮酸甲酯的植物生长调节剂溶液均匀洒到幼苗的叶片上，喷洒的量以生长调节剂溶液完全湿润所有叶片为准。

方法原理：（1）作物生长调节剂（1-氨基环丙烷-1-羧酸和茉莉酮酸甲酯）的叶片喷洒可以使硝态氮长途转运基因的表达量发生变化；（2）硝态氮长途转运基因发生变化以后使得更多的硝态氮分配到作物的地下部分；（3）作物地下部分硝态氮的累积比例增加可以显著增强作物的抗逆性。

上述的方法中，优选的，所述幼苗为水稻幼苗与油菜幼苗。

上述的方法中，优选的，所述水稻幼苗的培养包括以下步骤：水培采用Yoshida营养液（国际水稻研究所Yoshida营养液配方），培养容器上面漂浮一个泡沫聚苯乙烯薄板，薄板上有120个孔：横排12个、竖排10个，每孔播1兜，每兜2粒，薄板底部为尼龙网，种子播在其上，随机排列，播种前先把种子放入50℃烘箱内破除休眠3天，预先催芽，催芽后的水稻种子都用蒸馏水培养3~6天以后，再用Yoshida营养液继续培养。

上述的方法中，优选的，所述油菜幼苗的培养包括以下步骤：将油菜籽粒浸种于体积分数为20%的次氯酸钠进行表面消毒30~50 min，用蒸馏水冲洗3~6遍以后在玻璃网室的土培中发芽，所用营养液为贺格兰德（Hoagland）完全营养液，每5天浇一次营养液，每次浇100 ml，玻璃网室中昼夜平均温度29℃/19℃，自然湿度和光照，光照强度为205~230 Ue/(m².s)。

上述的方法中，优选的，所述环境非生物胁迫的模拟池中，盐和镉胁迫浓度分别为50~150 mmol·L^-1 NaCl、50~200 μmol·L^-1 CdCl₂，所述水稻按6600株/亩的密度进行移栽，所述油菜按8000株/亩的密度进行移栽。

上述的方法中，优选的，所述1-氨基环丙烷-1-羧酸的处理浓度为10~100 μmol·L^-1，茉莉酮酸甲酯（MeJA）的处理浓度为50~200 μmol·L^-1。

上述的方法中，优选的，所述生长调节剂处理的时期为从水稻移栽后的幼苗期到灌浆期，以及从油菜移栽后的幼苗期到角果发育期，包括从移栽后的幼苗期开始每6天均匀的喷洒一次植物生长调节剂直到进入水稻的灌浆期结束，以及油菜的角果发育期结束。

上述的方法中，优选的，所述水稻的Yoshida营养液中加入NH₄NO₃，NaH₂PO₄?2H₂O，K₂SO₄，CaCl₂，MgSO₄?7H₂O，使大量营养元素N、P、K、Ca、Mg在营养液中的含量分别为35~45、8~12、35~45、35~4045、35~45 mg/L；同时在Yoshida营养液中加入MnCl₂?4H₂O，(NH₄)₆Mo₇O₂₄?2H₂O，H₃BO_3，ZnSO₄?7H₂O，CuSO₄?5H₂O，FeCl₃?6H₂O，使微量营养元素Mn、Mo、B、Zn、Cu、Fe在营养液中的含量分别为0.4~0.6、0.04~0.06、0.18~0.22、0.018~0.022、0.008~0.012、1.8~2.2 mg/L。

上述的方法中，优选的，所述油菜所用贺格兰德（Hoagland）完全营养液组成包括4~6 mmol.L^-1 KNO₃，0.5~1.5 mmol.L^-1 KH₂PO₄，6~8 mmol.L^-1  MgSO₄，4~6 mmol.L^-1 Ca(NO₃)₂·4H₂O，2~4 mmol.L^-1 Fe-EDTA，0.4~0.6 mg.L^-1 B，0.4~0.6 mg.L^-1 Mn，0.04~0.06 mg.L^-1 Zn，0.01~0.03 mg.L^-1 Cu，0.005~0.015 mg.L^-1 Mo。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明所使用的外源作物生长调节剂（1-氨基环丙烷-1-羧酸和茉莉酮酸甲酯）能够有效调控硝态氮在作物地上、地下部的分配，从而显著提高作物抗环境非生物胁迫的能力，为增强作物的抗逆性提供可行的调节手段。具体表现为：

（1）目前还没有一种方法能够将营养调控和环境非生物胁迫调控相协调，本方法采用植物生长调节物质（1-氨基环丙烷-1-羧酸和茉莉酮酸甲酯）可以将作物的抗逆性与硝态氮的分配调控相结合；

（2）现有的技术可以观测到作物根部累积更多的硝态氮以后可以显著影响作物的氮素利用效率，但是并不了解作物吸收硝态氮的分配调控可以调节作物的抗逆性，本方法通过植物生长调节剂的施用，可以使作物地下部的硝态氮累积比例增加25%左右，显著增强了作物的抗逆性；

（3）现有的技术仅仅知道逆境条件下可以使作物产生更多的乙烯和茉莉酸，但并不清楚产生更多的乙烯和茉莉酸对作物抗逆性的作用，本方法利用乙烯和茉莉酸类物质的喷施，充分说明逆境条件下产生的激素对作物硝态氮营养分配的调节能力及其对作物抗逆性的影响；

（4）对水稻和油菜施用了植物外源生长调节剂（1-氨基环丙烷-1-羧酸和茉莉酮酸甲酯）处理以后，使作物在强逆境生长条件下（50~150 mmol·L^-1NaCl、50~200 μmol·L^-1 CdCl₂）的存活率分别提高了30%和45%左右。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中盐胁迫环境下添加生长调节剂与不添加生长调节剂水稻的生长速率对比图。

图2为本发明实施例1中水稻收获期成活率的对比图。

图3为本发明实施例1中水稻抽穗期地下/地上部硝态氮含量的比值对比图。

图4为本发明实施例1中水稻叶绿素a含量的对比图。

图5为本发明实施例1中水稻总叶绿素（叶绿素a+叶绿素b）含量的对比图。

图6为本发明实施例1中水稻干物质量的对比图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例1：

一种增强作物抗环境非生物胁迫的方法，包括以下步骤：

第一步：作物幼苗培养

水稻幼苗的培养：水培采用Yoshida营养液，分别在营养液中加入NH₄NO₃，NaH₂PO₄?2H₂O，K₂SO₄，CaCl₂，MgSO₄?7H₂O，使大量营养元素N、P、K、Ca、Mg在营养液中的含量分别为40、10、40、40、40 mg/L；同时在营养液中加入MnCl₂?4H₂O，(NH₄)₆Mo₇O₂₄?2H₂O，H₃BO_3，ZnSO₄?7H₂O，CuSO₄?5H₂O，FeCl₃?6H₂O，使微量营养元素Mn、Mo、B、Zn、Cu、Fe在营养液中的含量分别为0.5、0.05、0.2、0.01、0.01、2.0 mg/L。培养容器为长35cm, 宽25cm，高30 cm的塑料盆，上面漂浮一个泡沫聚苯乙烯薄板，薄板上有120个孔（横排12个、竖排10个），每孔播1兜，每兜2粒，薄板底部为尼龙网，种子播在其上，随机排列。播种前先把种子放入50℃烘箱内破除休眠3天，预先催芽，催芽后的水稻种子都用蒸馏水培养3天以后，再用Yoshida营养液继续培养。

油菜幼苗的培养：将油菜籽粒浸种于20%(v/v)的次氯酸钠进行表面消毒30分钟，用蒸馏水冲洗数遍以后于9月30日在玻璃网室的土培中发芽，所用Hoagland完全营养液的组成为5 mmol.L^-1 KNO₃，1 mmol.L^-1 KH₂PO₄，7 mmol.L^-1  MgSO₄，5 mmol.L^-1 Ca(NO₃)₂·4H₂O，3 mmol.L^-1 Fe-EDTA，0.5 mg.L^-1 B，0.5 mg.L^-1 Mn，0.05 mg.L^-1 Zn，0.02 mg.L^-1 Cu，0.01 mg.L^-1 Mo，每5天浇一次营养液，每次浇100 ml。玻璃网室中昼夜平均温度29℃/19℃，自然湿度和光照，光照强度为205-230 Ue/(m².s)。

第二步：作物的非生物胁迫处理

水稻幼苗的移栽（采用育苗移栽方法），4月中下旬按照第一步所述方法育苗，20-25天以后移栽到环境非生物胁迫的模拟池中（模拟池中的盐和镉胁迫浓度分别为100 mmol·L^-1NaCl、60 μmol·L^-1 CdCl₂），每小区10 m² (长5 m,宽2 m)，按6600株/亩的密度进行移栽，共3个小区，随机区组排列。于当年的9月中旬收获。采用传统的前期淹水、中期烤田和后期干湿交替的管理模式。其中N:P₂O₅:K₂O = 2:1:1，每亩施肥量参照农民习惯施肥量（8 kg N/亩）。水稻移栽前施入基肥，基肥施氮量均为设计施氮量的25%。     

油菜幼苗的移栽（采用育苗移栽方法），9月30日前后按照第一步所述方法育苗，一个月以后移栽到环境非生物胁迫的模拟池中（模拟池中的盐和镉胁迫浓度分别为100 mmol·L^-1NaCl、60 μmol·L^-1 CdCl₂），每小区10 m² (长5 m,宽2 m)，按8000株/亩的密度进行移栽，共3个小区，随机区组排列。按苗期、抽薹期、开花期、角果发育期和成熟期这5个生长时期进行划分，于当年的5月中旬收获。苗期移栽返青后补施尿素5 kg/亩，适期灌水并追施薹花肥，春季结合春灌追施蕾薹肥尿素7.5 kg/亩。

第三步：作物生长调节剂的施用

移栽后的幼苗期水稻和油菜外源生长调节剂（1-氨基环丙烷-1-羧酸和茉莉酮酸甲酯）的处理，将同时含有40 μmol·L^-1 1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）和100 μmol·L^-1茉莉酮酸甲酯（MeJA）的植物生长调节剂溶液于每次的上午10点均匀的喷洒到水稻和油菜的叶片上，喷洒的量以生长调节剂溶液完全湿润所有叶片为准，从移栽后的幼苗期开始每6天均匀的喷洒一次直到进入水稻的灌浆期结束，以及油菜的角果发育期结束。

以水稻为例的部分试验结果如下：

将同时含有40 μmol·L^-1 1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）和100 μmol·L^-1茉莉酮酸甲酯（MeJA）的植物生长调节剂溶液于每次的上午10点均匀的喷洒到水稻的叶片上，喷洒的量以生长调节剂溶液完全湿润所有叶片为准，分别在处理后15-65天对水稻植株进行采样并测定其相对生长速率；相对生长速率（RGR）=(Ln W_f - lnW_i)/(t_f - t_i) ，W代表植株地上部分的干重，t代表时间，i 和 f 分别代表前一次采样和后一次采样时间；图2为水稻收获期成活率的比较，盐胁迫和生长调节剂处理同图1；图3为水稻抽穗期地下/地上部硝态氮含量的比值，盐胁迫和生长调节剂处理同图1。其中图2-6中图柱上的不同字母代表不同处理间差异显著。由图1的结果可知，植物生长调节剂添加以后可以显著提高水稻的生长速率（RGR）（图1）；添加生长调节剂以后水稻地下部分配的硝态氮比例增加了36.9%（图3），同时水稻的成活率提高了33.7%（图2）。由此可见，作物生长在非生物环境胁迫条件下添加植物生长调节剂处理可以显著提高作物的生长速率、作物移栽以后的成活率，而且这种抗逆性的提高确实是由于更多的硝态氮向地下部分分配的结果。

将同时含有40 μmol·L^-1 1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）和100 μmol·L^-1茉莉酮酸甲酯（MeJA）的植物生长调节剂溶液于每次的上午10点均匀的喷洒到水稻的叶片上，喷洒的量以生长调节剂溶液完全湿润所有叶片为准，在处理20天后对水稻植株叶片进行叶绿素含量和水稻植株干物质量的测定。添加植物生长调节剂以后可以显著提高植物叶片的叶绿素a和总叶绿素（叶绿素a+叶绿素b）含量（图4和图5）；图6的结果表明添加植物生长调节剂以后可以显著促进植株生长，增加水稻植株的干物质量。图4、5、6的结果更加直观的展现了植物生长调节剂处理增强水稻抗环境非生物胁迫的显著效果；相对于正常生长的水稻，盐胁迫可以显著抑制水稻的正常生长，而在添加了植物生长调节剂以后水稻生长状况明显得到改善，充分证明了该专利技术对于提高作物抗环境非生物胁迫的显著效果。