一种用于覆盖烧伤创伤创面的人体生物敷料及其应用

摘要

本发明提供了一种用于覆盖烧伤创伤创面的人体生物敷料及其应用，通过生物学、生物化学等手段对异体皮进行了去抗原降低免疫原性处理，保留了真皮与表皮，临床效果远远优于异体皮。本发明包括按顺序进行的下列步骤：戊二醛溶液浸泡处理；分割；纯化水浸泡处理；聚山梨酯80溶液浸泡处理；纯化水浸泡处理；氨基酸溶液浸泡处理；纯化水浸泡处理；PBS缓冲液浸泡处理；修补与修整；氯化钠溶液浸泡处理；包装及辐照。本发明所得产品可净化、清洁创面，促进肉芽组织生长，覆盖肉芽创面、慢性溃疡及褥疮，可缩短愈合时间，可用于大面积深度烧伤救治，各类烧(创)伤创面的覆盖，切(削)痂创面、微粒植皮创面、肉芽创面和慢性溃疡及褥疮的覆盖治疗等领域。

说明书

本申请是申请日为2013年3月28日，申请号为201310103371.8，发明名称为“一种用于覆盖烧伤创伤创面的人体生物敷料的制作方法”的中国发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种烧伤创伤创面覆盖材料及其应用，特别是一种用于覆盖烧伤创伤创面的异体皮去抗原降低免疫原性的人体生物敷料及其具体应用。

背景技术

烧伤是平时和战争年代最普遍的皮肤创伤，烧伤后引起的各种损害均与皮肤屏障作用的破坏与丧失有关。如：新陈代谢加剧、体温下降、水分过度散失、蛋白质的大量丢失及内分泌和免疫系统的失调。因此用敷料覆盖创面，作为临时体表保护屏障，促进创面愈合，尤其是大面积烧伤显得尤为重要。人们早就发现生物材料有助于皮肤创伤的愈合。随着对伤口愈合研究不断的深入，人们逐渐认识到使用敷料的目的远远不仅是为了覆盖创面，敷料还应能够促进创面愈合。1962年，伦敦大学的Winter博士在Nature杂志上发表著名论文，论证了湿润环境对创面的愈合作用。与用聚乙烯膜封闭猪断层皮肤缺损创面相比，暴露在空气中的创面再上皮化概率增加50％，随后的国内外大量临床实践和基础研究都支持这一观念。

近4O年来国内外研制开发了多种暂时性创面覆盖敷料，并广泛应用于临床。目前临床使用的暂时性创面覆盖敷料主要包括：传统敷料、合成敷料、天然生物敷料三大类。而烧伤创面覆盖材料的选择是烧伤治疗，特别是大面积烧伤创伤救治中重要的一环。

传统敷料如纱布、棉垫等存在以下缺点：①无法保持创面湿润，创面愈 合延迟；②敷料纤维易脱落，造成异物反应，影响愈合；③创面肉芽组织易长入敷料的网眼中，换药时可引起疼痛；④敷料被浸透时，病原体易通过；⑤换药时，易损伤新生的组织；⑥换药工作量大。

在合成敷料中，薄膜类合成敷料如Tegaderm、Dermafilm、Oprafiex、Opsite等产品的水蒸汽透过率太低，容易积液，可诱发或加重感染。泡沫型合成敷料如Allevyn、Ixralo等产品孔隙大，创面肉芽组织易长入，造成脱膜困难从而带来再次创伤，且易受细菌污染，易遗留残屑于创面。喷雾型合成敷料如Hydron、Aeroplast等产品存在以下缺点：粘附性和抗张强度较差；保湿性差，创面水分蒸发量大；喷雾膜的水溶性可使其被创面渗液软化，保持时间短；无控制感染作用，用于污染创面易发生膜下感染。水凝胶类敷料如Duoderm、Comfeel、Restore、Intrasite等产品的机械性能太差，在大量吸收渗出物后可因胶体的膨胀而导致敷料与伤口分离，给细菌的侵入繁殖提供了机会。

天然生物敷料包括自体皮、同种异体皮(简称异体皮)、辐照猪皮(异种皮)、羊膜、无细胞真皮基质、胶原类敷料等。目前覆盖创面最理想的方法是移植自体皮，但是烧伤面积超过50％的大面积烧伤患者，自体皮源显得严重不足。同种异体皮肤是近40年来被证实较为有效的皮肤代用品之一，是一种比较理想的创面覆盖物，具有较佳的皮肤屏障功能。异体皮的透湿性、粘附性与自体皮肤相似，能阻止细菌入侵和阻止创面水、电解质、蛋白质及热量的丢失，且具有良好的止血和促进上皮化功能。

异体皮在烧伤领域的应用已有很长的历史，在烧伤治疗中具有减轻患者痛苦，促进创面愈合的作用。1966年Cochrane最早将冰冻保存异体皮(cryopreserved allograft，CPA)应用于烧伤创面获得成功，但CPA的处理及保存相当麻烦，且抗原性较强，排异快，在临床上无法推广应用。1984年后一种改良的甘油保存异体皮(glycerol preserved allograft，GPA)开始在临床上应用，与CPA皮相比，GPA易于生产和保存，抗原性较低，抗感染能力也较强，存活时间显著延长，在临床上得到了较广泛的推广应用。但目前现有的异体皮存 在保存条件要求高、抗原性、有占位性、病原微生物易感染等临床问题。特别是由于其存在的抗原性而造成的明显免疫排斥反应，一般2-3周左右溶解、脱落，创面裸露，影响一期愈合。近年来随着生物技术的发展，更为新型的异体皮人体生物敷料开始进人临床。

发明内容

为了克服现有技术的不足,本发明提供了一种用于覆盖烧伤创伤创面的人体生物敷料，本发明利用异体皮作为原材料，通过生物学、生物化学等手段对异体皮进行了去抗原降低免疫原性处理，保留了真皮与表皮，与GPA相比，其免疫排斥反应延迟，应用及保存更为简便。产品不仅达到了早期覆盖创面的目的，而且还能够促进创面愈合，临床应用未发现明显的免疫排斥反应及全身炎症反应。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种用于覆盖烧伤创伤创面的人体生物敷料半成品和覆盖烧伤创伤创面的人体生物敷料，其中，人体生物敷料半成品的制备方法包括下述步骤1-10，人体生物敷料的制备方法包括下述步骤1-11，具体为按顺序进行的下列步骤：

步骤[1]按每平方厘米异体皮取0.5-3ml的比例取相应量的质量分数为0.25％-3％的戊二醛溶液，将异体皮放入所取戊二醛溶液中，浸泡15-60分钟；更换戊二醛溶液，继续浸泡15-30分钟；取出异体皮，按每平方厘米异体皮取0.5-3ml的比例取相应量的质量分数为0.5％-1.5％的氯化钠溶液，将异体比放入所取氯化钠溶液中，浸泡30-120分钟，取出异体皮得到半成品A；

步骤[2]将半成品A按所需规格进行分割，用取皮鼓对分割后的半成品A进行反取，去除残存的脂肪组织，得半成品B；

步骤[3]按每平方厘米半成品B取0.5-3ml的比例取相应量的纯化水，将半成品B和所取纯化水置于同一容器中，放置于摇床震荡15-60分钟，更换纯化水，再次置于摇床震荡15-60分钟。重复以上步骤，直至置换出的纯化水的pH值在5.5-6.5之间时，弃去纯化水，得半成品C；

步骤[4]按每平方厘米半成品C取0.5-3ml的比例取相应量的质量分数为0.05％-0.3％的聚山梨酯80溶液，将半成品C及所取聚山梨酯80溶液置于同一容器中，放置于摇床震荡15-60分钟，更换聚山梨酯80溶液，再次置于摇床震荡15-60分钟。重复以上步骤，直至置换出的聚山梨酯80溶液的pH值在6.0-7.0之间时，弃去聚山梨酯80溶液，得半成品D；

步骤[5]按每平方厘米半成品D取0.5-3ml的比例取相应量的纯化水，将半成品D和所取纯化水置于同一容器中，放置于摇床震荡15-60分钟，更换纯化水，再次置于摇床震荡15-60分钟。重复以上步骤，直至置换出的纯化水的pH值在5.5-6.5之间时，弃去纯化水，得半成品E；

步骤[6]按每平方厘米半成品E取0.5-3ml的比例取相应量的氨基酸溶液，将半成品E和所取氨基酸溶液置于同一容器中，置摇床震荡15-60分钟，然后静置15-30分钟，弃去氨基酸溶液，得半成品F；

步骤[7]按每平方厘米半成品F取0.5-3ml的比例取相应量的纯化水，将半成品F和所取纯化水置于同一容器中，放置于摇床震荡15-60分钟，更换纯化水，再次置于摇床震荡15-60分钟。重复以上步骤，直至置换出的纯化水的pH值变在6.0-7.0之间时，弃去纯化水，得半成品G；

步骤[8]按每平方厘米半成品G取0.5-3ml的比例取相应量的PBS缓冲液，将半成品G和所取PBS缓冲液置于同一容器中，放置于摇床震荡15-60分钟，然后静置15-30分钟，弃去所使用的PBS缓冲液，得半成品H；

步骤[9]将半成品H的真皮面、表皮面上所有异物清除干净，若存在直径为1厘米以上的孔洞，则用医用缝线将孔洞缝上，若形状不规整则将其修剪整齐，得半成品I；

步骤[10]按每平方厘米半成品I取0.5-3ml的比例取相应量的质量分数为0.5％-1.5％的氯化钠溶液，然后将半成品I和所取氯化钠溶液置于同一容器中，放置于摇床震荡15-60分钟，更换氯化钠溶液，再次置于摇床震荡15-60分钟。重复以上步骤，直至置换出的氯化钠溶液的pH值在6.5-7.5之间时，取出半成 品I；按每1-3平方厘米半成品I取1ml的比例取相应量的质量分数为0.5％-1.5％的氯化钠溶液，将半成品I和所取氯化钠溶液置于同一容器中，静置浸泡15-60分钟，弃去溶液，得半成品J；

步骤[11]将半成品J装入内包装袋，于内包装袋中铺平，将内包装袋密封，然后装入外包装袋并将其密封，最后经钴Co⁶⁰辐照，最终得成品K。

上述步骤[1]中所述异体皮来源于健康人体捐献体的皮肤，其厚度为0.2-0.3毫米，所取异体皮之间的厚度差值不超过0.1毫米。

上述步骤[6]中所述的氨基酸溶液，其中所含的氨基酸为谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天门冬氨酸当中的一种或数种，每1000毫升氨基酸溶液当中，谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天门冬氨酸的一种或数种的含量分别各为0.1-3g。

上述步骤[8]中所述的PBS缓冲液的pH值为7.0-8.0。

上述步骤[9]中所述用医用缝线逢孔洞时应控制针脚之间的距离不大于1厘米。

上述步骤[11]中经钴Co⁶⁰辐照的剂量为：20kGy≤辐照剂量≤30kGy。

本发明的积极效果：本发明所得的人体生物敷料完整地保留了细胞外基质的三维形态结构和成份(生长框架)，能诱导宿主细胞有序长入，不仅缩短了创面愈合时间，还提高了创面愈合质量，减少了瘢痕形成；深度烧伤切削痂创面应用本发明所得产品其免疫排斥反应低，有效延长了覆盖时间，避免了术后过早裸露创面，防止了创面感染及蛋白丢失，为以后的分期自体植皮创造了条件，从而更有利于在大面积深度烧伤救治中的应用。

本发明产品与患者创面有良好的相容性，可有效的隔绝创面与外界的直接接触，起到了暂时的皮肤屏障作用，为创面愈合提供了一个良好的修复环境，有利于上皮细胞生长，缩短了创面愈合时间并提高了创面愈合后的质量。

使用本发明所述方法制得的产品适用于各类烧(创)伤创面的覆盖，适用于浅Ⅱ°、深Ⅱ°、Ⅲ°切(削)痂创面、微粒植皮创面、肉芽创面和慢性溃疡及褥疮的覆盖治疗。本产品具有皮肤完整的去抗原真皮层与表皮层，在降低了 免疫排斥反应的同时，保留了真皮层与表皮层的相应功能，覆盖在烧(创)伤创面上可起到暂时的皮肤屏障作用，可在创基上较长时间的成活而无明显占位，尤其是覆盖大面积深度烧伤切(削)痂微粒植皮创面，可一期愈合并提高了创面修复质量。

附图说明

图1是本发明一种用于覆盖烧伤创伤创面的人体生物敷料的制作方法的流程图。

图2本发明病毒灭活工艺(0.5％戊二醛溶液浸泡处理)HIV灭活动力学曲线。

图3使用本发明所述人体生物敷料处理后不同时间家兔血清IgG水平的变化。

图4使用本发明所述人体生物敷料处理后不同时间家兔血清IgA水平的变化。

图5使用本发明所述人体生物敷料处理后不同时间家兔血清IgM水平的变化。

图6实验前各组家兔血清抗体水平比较。

图7使用本发明所述人体生物敷料处理后2周各组家兔血清抗体水平比较。

图8使用本发明所述人体生物敷料处理后4周各组家兔血清抗体水平比较。

图9使用本发明所述人体生物敷料处理后12周各组家兔血清抗体水平比较。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的优选实施例进行详细说明。

如图1所示，本发明优选实施例提供一种用于覆盖烧伤创伤创面的生物敷料的制作方法，包括按顺序进行的下列步骤：

步骤[1]戊二醛溶液浸泡处理：按每平方厘米异体皮(来源于健康人体捐献体的皮肤，其厚度为0.2-0.3毫米)取1ml的比例取相应量的质量分数为0.5％的戊二醛溶液，将异体皮放入所取戊二醛溶液中，浸泡50分钟；更换戊二醛溶液，继续浸泡25分钟；取出异体皮，按每平方厘米同种异体皮取1ml的比例取相应量的质量分数为0.9％的氯化钠溶液，将异体皮放入所取氯化钠溶液中，浸泡90分钟，取出异体皮得到半成品A；

步骤[2]分割：将半成品A按所需规格进行分割，用取皮鼓对分割后的半成品A进行反取，去除残存的脂肪组织，得半成品B；

步骤[3]纯化水浸泡处理：按每平方厘米半成品B取2ml的比例取相应量的纯化水，将半成品B和所取纯化水置于同一容器中，放置于摇床震荡30分钟，更换纯化水，再次置于摇床震荡30分钟。重复以上步骤，直至置换出的纯化水的pH值在5.5-6.5之间时，弃去纯化水，得半成品C；

步骤[4]聚山梨酯80溶液浸泡处理：按每平方厘米半成品C取2ml的比例取相应量的质量分数为0.2％的聚山梨酯80溶液，将半成品C及所取聚山梨酯80溶液置于同一容器中，放置于摇床震荡30分钟，更换聚山梨酯80溶液，再次置于摇床震荡30分钟。重复以上步骤，直至置换出的聚山梨酯80溶液的pH值在6.0-7.0之间时，弃去聚山梨酯80溶液，得半成品D；

步骤[5]纯化水浸泡处理：按每平方厘米半成品D取2ml的比例取相应量的纯化水，将半成品D和所取纯化水置于同一容器中，放置于摇床震荡30分钟，更换纯化水，再次置于摇床震荡30分钟。重复以上步骤，直至置换出的纯化水的pH值在5.5-6.5之间时，弃去纯化水，得半成品E；

步骤[6]氨基酸溶液浸泡处理：按每平方厘米半成品E取2ml的比例取相应量的由谷氨酸和甘氨酸混合而成的氨基酸混合溶液，每1000毫升此氨基酸混合溶液中含谷氨酸0.75g、甘氨酸1.5g，将半成品E和所取氨基酸混合溶液置于同一容器中，置摇床震荡30分钟，然后静置30分钟，弃去氨基酸混合溶液，得半成品F；

步骤[7]纯化水浸泡处理：按每平方厘米半成品F取2ml的比例取相应量的纯化水，将半成品F和所取纯化水置于同一容器中，放置于摇床震荡30分钟，更换纯化水，再次置于摇床震荡30分钟。重复以上步骤，直至置换出的纯化水的pH值变为在6.0-7.0之间时，弃去纯化水，得半成品G；

步骤[8]PBS缓冲液浸泡处理：按每平方厘米半成品G取2ml的比例取相应量pH值为7.5的PBS缓冲液，将半成品G和所取PBS缓冲液置于同一容器中，放置于摇床震荡30分钟，然后静置30分钟，弃去所使用的PBS缓冲液，得半成品H；

步骤[9]修补与修整：将半成品H的真皮面、表皮面上所有异物清除干净，若存在直径为1厘米以上的孔洞，则用医用缝线将孔洞缝上，缝孔洞时控制针脚之间的距离不大于1厘米，若形状不规整则将其修剪整齐，得半成品I；

步骤[10]氯化钠溶液浸泡处理：按每平方厘米半成品I取1ml的比例取相应量的质量分数为0.9％的氯化钠溶液，然后将半成品I和所取氯化钠溶液置于同一容器中，放置于摇床震荡30分钟，更换氯化钠溶液，再次置于摇床震荡30分钟。重复以上步骤，直至置换出的氯化钠溶液的pH值在6.5-7.5之间时，取出半成品I；按每1平方厘米半成品I取1ml的比例取相应量的质量分数为0.9％的氯化钠溶液，将半成品I和所取氯化钠溶液置于同一容器中，静置浸泡30分钟，弃去溶液，得半成品J；

步骤[11]包装及辐射灭菌：将半成品J装入内包装袋，于内包装袋中铺平，将内包装袋密封，然后装入外包装袋并将其密封，最后经辐照剂量为25kGy的钴Co⁶⁰辐照，最终得成品K。

一、对上述实施例所述步骤[1]中异体皮原材料经戊二醛溶液浸泡处理工艺灭活HIV效果的验证如下：

1材料

1.1原料皮，即上述实施例步骤[1]中所述的异体皮原材料：批号1、2、3；

1.2 50％戊二醛(使用前用去离子水配置成0.5％)；

1.3人免疫缺陷病毒：HIV-1 IIIB株，由美国引进；

1.4 MT₂细胞：传代人T淋巴细胞系；

1.5细胞培养液：RPMI 1640+10％胎牛血清；

1.6 96孔细胞培养板 

1.7 CO₂孵箱：MCO-15A。

2方法

分别取原料皮各一块(约1cm²/块)，PBS反复洗涤，弃PBS，再加入HIV-1 IIIB 0.1ml，反复吹打几次后，孵育30min，加入RPMI 1640细胞培养液0.9ml，混匀，移至过滤离心管中，3000转/分钟2分钟，滤液作为零时取样；再分别取原料皮各一块(约1cm²/块)，PBS反复洗涤，弃PBS，再加入HIV-1 IIIB 0.1ml，反复吹打几次后，孵育30min，再加入0.5％戊二醛0.9ml，浸泡处理50分钟，分别于10、20、30、50分钟移至过滤离心管中，3000转/分钟2分钟，分别将滤液取样；每次取样0.1ml，立刻用培养液做10的梯度稀释，测定其中HIV的滴度，同时设病毒对照，稀释对照，阳性对照及细胞对照，用MT2细胞微量培养法测定HIV的滴度，以细胞病变作为判别病毒存在的指标，对1批样品进行三次重复检测，2和3批样品各进行一次检测。

3结论

在本发明步骤[1]中所述的异体皮原材料加入HIV-1 IIIB，孵育30分钟，再加入0.5％戊二醛浸泡处理50分钟，可使HIV-1 IIIB的滴度下降4.17个log(检测结果如图2所示)且经细胞培养盲传三代，未出现细胞病变。

二、对本发明生产工艺病毒灭活验证如下：

验证依据：国药监注[2002]160号、“动物源性医疗器械产品注册申报资料撰写指导原则”、“同种异体医疗器械病毒灭活工艺验证指导原则”。

验证目的：根据样品生产制造工艺，分别验证0.5％戊二醛浸泡50分钟、钴60-γ射线辐照25KGy等2种工艺对所选3种指示病毒的灭活效果。

1.验证样品：取自生产过程中灭活工艺前一步的连续三批样品，于4℃保 存。

2.指示病毒选择：

(1)伪狂犬病毒(PRV)：属疱疹病毒科，为双链DNA有囊膜病毒。对乙醚、氯仿等脂溶剂，福尔马林和紫外线照射等敏感，是疱疹病毒中抵抗力较强的一种。为国药监注[2002]160号文规定的HBV指示病毒。

(2)辛得毕氏病毒(Sindbis)：属披盖病毒科，球型，为RNA有囊膜病毒。对理化因子的抵抗力较低。为国药监注[2002]160号文规定的HCV指示病毒。

(3)猪细小病毒(PPV)：属细小病毒科，为微小DNA无囊膜病毒，18-24nm。由于无囊膜，对理化因子抗性很强。为国药监注[2002]160号文规定的非脂包膜细小病毒B19指示病毒。

3.病毒灭活/去除验证步骤：

(1)0.5％戊二醛溶液浸泡50分钟灭活工艺：

把同种异体材料样品放入50ml消毒后的培养瓶中，分别加入0.5％戊二醛溶液18ml，2ml指示病毒溶液(10％)。分别于0、5、10、20、30、50分钟取样，依据细胞毒性试验的结果用维持液做适当稀释后检测病毒残留滴度，既可以终止0.5％戊二醛溶液的继续灭活作用，又可以消除0.5％戊二醛溶液对检测细胞的毒性。每种样品做三批重复。

(2)钴60-γ射线辐照25KGy灭活工艺：

把同种异体材料样品放入50ml消毒后的培养瓶中，分别加入20ml指示病毒溶液直接浸泡。立即取出1ml做适当稀释为辐照前对应，其余样品做钴60-γ射线辐照25KGy。辐照结束后取样品与辐照前样品用同样的稀释度测定病毒残留滴度。每种样品做三批重复。

4.病毒活性滴定方法：

(1)细胞毒性检测：

为了确定0.5％戊二醛溶液灭活后样品测定病毒残留滴度时的起始稀释 度，必须先做0.5％戊二醛溶液不同稀释度对检测细胞的毒性试验，才能进行病毒活性滴定。而是通过稀释终止0.5％戊二醛溶液的继续灭活作用。细胞毒性检测用MTT比色法。

(2)病毒活性滴定：

选用病毒敏感的Vero和PK-15细胞株，采用微量细胞病变法。将上述各组中不同时间所取的样品依据细胞毒性检测结果，确定样品的起始稀释度，再做十倍系列稀释后，立即加入已接种检测细胞的96孔板中，每个稀释度做8孔重复，放37℃,5％CO2培养箱中孵育。用Vero细胞检测PRV和Sindbis病毒孵育72小时，光镜下观察并记录细胞病变(CPE)情况。由于PPV的致细胞病变较弱，所以需在细胞病变判定的基础上，增加特异性抗PPV的荧光抗体染色并在荧光显微镜下观察。被PPV感染的细胞在不出现病变的情况下可见亮丽的翠绿色荧光斑点，该方法可明显提高PPV检测的特异性和灵敏度。病毒滴度按Karber氏方法计算。

5.结果判定： 

病毒降低量≥4LgTCID50/ml，判定该病毒灭活步骤有效。

6.细胞盲传三代：

每批经各种病毒灭活工艺灭活后的样品均高浓度加入传代细胞中，做细胞盲传3代，观察是否出现细胞病变。在细胞盲传3代的全过程中，任何时段出现细胞病变均为阳性(+)，说明病毒未被完全灭活；未出现细胞病变为阴性(-)，说明病毒已被完全灭活。

7. 0.5％戊二醛溶液对细胞毒性检测结果：

7.1  0.5％戊二醛溶液对二种检测细胞的毒性检测结果见表1

表1 0.5％戊二醛溶液对检测细胞生长的影响

8. 0.5％戊二醛溶液处理不同时间对“同种异体材料样品”中三种模型病毒灭活效果的观察：

8.1 0.5％戊二醛溶液处理不同时间对PRV病毒的灭活效果：(如表2、 表3所示)

表2 0.5％戊二醛溶液处理不同时间对PRV病毒的灭活效果

表3 0.5％戊二醛溶液浸泡50分钟灭活PRV病毒后盲传结果

样品号 盲传一代 盲传二代 盲传三代 1 (-) (-) (-) 2 (-) (-) (-) 3 (-) (-) (-) 细胞对照 (-) (-) (-)

8.2 0.5％戊二醛溶液浸泡不同时间对Sindbis病毒的灭活效果：(如表4、表5所示)

表4 0.5％戊二醛溶液浸泡不同时间对Sindbis病毒的灭活效果

表5 0.5％戊二醛溶液浸泡50分钟灭活Sindbis病毒后盲传结果

样品号 盲传一代 盲传二代 盲传三代 1 (-) (-) (-) 2 (-) (-) (-) 3 (-) (-) (-) 细胞对照 (-) (-) (-)

8.3 0.5％戊二醛溶液浸泡不同时间对PPV病毒的灭活效果：(如表6、表7所示)

表6 0.5％戊二醛溶液浸泡不同时间对PPV病毒的灭活效果

表7 0.5％戊二醛溶液浸泡50分钟灭活PPV病毒后盲传结果

样品号 盲传一代 盲传二代 盲传三代 1 (-) (-) (-) 2 (-) (-) (-) 3 (-) (-) (-) 细胞对照 (-) (-) (-)

9.钴60-γ射线辐照25KGy处理“同种异体材料样品”对三种模型病毒灭活效果的观察：

9.1钴60-γ射线辐照25KGy处理“同种异体材料样品”对PRV病毒灭活效果：(如表8、9所示)

表8钴60-γ射线辐照25KGy处理同种异体材料样品对PRV病毒灭活效果

表9钴60-γ射线辐照25KGy处理同种异体材料样品灭活PRV后盲传结果

样品号 盲传一代 盲传二代 盲传三代 1 (-) (-) (-) 2 (-) (-) (-) 3 (-) (-) (-)

 

细胞对照 (-) (-) (-)

9.2钴60-γ射线辐照25KGy处理“同种异体材料样品”对Sindbis病毒灭活效果：(如表10、11所示)

表10钴60-γ射线辐照25KGy处理样品材料对Sindbis病毒灭活效果

表11钴60-γ射线辐照25KGy处理样品材料灭活Sindbis后盲传结果

样品号 盲传一代 盲传二代 盲传三代 1 (-) (-) (-) 2 (-) (-) (-) 3 (-) (-) (-) 细胞对照 (-) (-) (-)

9.3钴60-γ射线辐照25KGy处理“同种异体材料样品”对PPV病毒灭活效果：(如表12、13所示)

表12钴60-γ射线辐照25KGy处理样品材料对PPV病毒灭活效果

表13钴60-γ射线辐照25KGy处理样品材料灭活PPV后盲传结果

样品号 盲传一代 盲传二代 盲传三代 1 (-) (-) (-) 2 (-) (-) (-) 3 (-) (-) (-) 细胞对照 (-) (-) (-)

10.结论：

验证试验结果显示，本发明所制备产品的生产中的二个病毒灭活工艺均可有效灭活所加入的三种模型病毒。0.5％戊二醛溶液浸泡50分钟工艺，处理5分钟即可完全灭活PRV、Sindbis病毒。由于PPV是无包膜细小病毒，基本不含蛋白，对理化因素忍耐性极强，需30分钟处理才能完全灭活该病毒。病毒降低量分别为：PRV病毒≥6.0-6.13LgTCID₅₀；Sindbis病毒≥5.13-5.5LgTCID₅₀；PPV病毒≥4.75-4.88LgTCID₅₀。0.5％戊二醛溶液浸泡50分钟处理的含病毒样品加入细胞盲传三代均无病毒检出。钴60-γ射线25KGy辐照工艺可灭活PRV病毒≥6.38-7.13LgTCID₅₀；Sindbis病毒≥5.75-5.88LgTCID₅₀；PPV病毒≥6.0-6.25LgTCID₅₀。辐照25KGy的三种病毒样品经细胞盲传三代均无病毒检出。

依据国食药监注[2008]7号和国药监注[2002]160号文件的规定，在每步灭活工艺中，病毒降低量达到4logs以上，可认为灭活病毒方法有效。且各工艺对病毒的灭活作用可以叠加。病毒降低量越大，且盲传三代无病毒检出，说明灭活工艺效果越好，产品的安全性越高。本试验结果显示，验证的两个工艺，病毒降低量均大于4logs，若两种工艺叠加则三种指示病毒的降低量均达到10logs以上。

所以，本发明所述制备方法中的0.5％戊二醛溶液浸泡50分钟、钴60-γ射线25KGy辐照两种病毒灭活工艺可以保证该类产品的病毒安全性。

三、对本发明所述实施例所制作的人体生物敷料的免疫原性验证如下：

验证依据：动物源性医疗器械产品注册申报资料撰写指导原则

验证目的：通过对家兔植入本发明所述敷料后2周、4周、12周血清抗体IgG、IgA、IgM变化情况，评价本发明所制备产品的免疫原性。

1.实验样品：依照本发明实施例提供的制作方法生产的生物人体生物敷料，生产批号：1和2，置于缓冲液中4℃冰箱存放。

2.实验动物、试剂与仪器设备

实验动物：大耳白家兔60只，体重2.05±0.21kg，雄雌不限。

主要试剂：兔IgG、IgA、IgM ELISA试剂盒，T96、T48两种规格；免疫佐剂，10ml/支；5％戊巴比妥注射液；硫酸庆大霉素注射液，8万IU/2ml。

主要仪器设备：搅拌器；离心机；冰箱；电热恒温培养箱；酶标仪。

3.血样采集

实验前和试验后2周、4周、12周采集血样。用无菌注射器经家兔耳动脉采集非抗凝血1ml，置于室温下1h左右，凝固后，置4℃冰箱过夜析出血清，3500rpm下离心10min，吸出血清，分装于EP管内，标记清洗后保存于-80℃冰箱。待12周后全部采血完成后统一进行抗体IgG、IgA、IgM水平检测。

4.生物人体生物敷料浸出液的制备

在超净台中将人体生物敷料剪碎，置于搅拌机中，加入已灭菌的Ph7.0的磷酸缓冲液，搅拌成匀浆，实验中所用器械均经高压灭菌处理。匀浆置于37℃电热恒温培养箱放置过夜后，在12000rpm下离心10min，取上清经0.22μm的无菌过滤器过滤除菌。置4℃冰箱中存放。人体生物敷料浸出液在使用前1天制备。

5.实验分组与处理

实验家兔(60只)分为四组：高剂量组(植入人体生物敷料组)、低剂量组(浸出液组)、阴性对照组、阳性对照组(加强免疫组)。每组15只。

高剂量组(植入人体生物敷料组)：家兔用5％戊巴比妥麻醉，给药剂量为0.5ml/kg，经耳缘动脉缓慢推注。兔背部局部皮肤脱毛、消毒后，在皮肤切开，将人体生物敷料植入皮肤内，缝合处理。

低剂量组(浸出液组)：取人体生物敷料浸出液0.7ml，分6点注射于家兔脊椎两侧皮下，每点注射约0.12ml。

阴性对照组：手术方式与高剂量组相同，但不植入人体生物敷料。

阳性对照组(加强免疫组)：

人体生物敷料浸出液与佐剂混合液的制备：将人体生物敷料浸出液与佐剂等体积混合，将混合液分别吸入两个100ml的灭菌玻璃注射器中，两注射器用一长约10cm的无菌塑料管连接，分别推拉两注射器使液体混匀，形成油包水乳剂。将乳剂滴一滴在水面上，乳剂保持滴珠完整而不分散即为合格。人体生物敷料浸出液与佐剂混合液在使用前配制。

用加入佐剂的人体生物敷料浸出液免疫家兔：取人体生物敷料浸出液与佐剂混合液1.5ml，分6点注射于家兔脊椎两侧皮下，每点注射约0.25ml。2周后，再用相同剂量的人体生物敷料浸出液与佐剂混合液加强免疫一次，方法同前。

为防止术后感染，进行手术的家兔(高剂量组和阴性对照组)在手术当天及术后3天肌肉注射硫酸庆大霉素注射液，4万单位/天。

采集实验后2周、4周、12周的血样。实验过程中，观察动物伤口愈合情况，有无红肿渗出情况；动物活动、进食、饮水等情况以及动物存活情况。

6.ELISA检测

血清抗体IgG、IgA、IgM水平检测按照试剂盒说明书操作。测定方法如下：

(1)标准品的稀释与加样：根据预实验得到的血清抗体浓度范围对标准品进行稀释。IgG标准品稀释为1.5、3、6、12、18μg/ml五个浓度点，IgA、IgM标准品均稀释为0.75、1.5、3、6、9μg/ml五个浓度点。将50μl标准品稀释液加入酶标包被板标准孔中。

(2)加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl， 然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。

(3)温育：用封板膜封板后置37℃温育30min。

(4)配制洗涤液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。

(5)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，重复5次，拍干。

(6)加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

(7)温育：操作同(3)。

(8)洗涤：操作同(5)。

(9)显色：每孔先加入显色剂A50μl再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min。

(10)终止：每孔加终止液50μl，终止反应。

(11)测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度。测定应在加终止液后15min以内进行。

三复孔检测，取平均值结果进行判断。

7.统计学分析 

采用SPSS16.0软件进行统计学分析。计量资料用表示，各组间及不同采样时间的抗体检测结果的对比采用单因素方差分析检验，率的比较采用χ²检测。所有统计推断均采用双侧检验，具有统计意义的检验水准定为P<0.05.

8.免疫原性实验结果

8.1实验动物的一般情况

进行手术的家兔在术后一天可见活动减少，进食减少，以后恢复正常，无伤口感染发生，伤口无红肿渗出液，动物伤口愈合良好，非手术家兔未出现明显异常反应。各组死亡动物数见表14。

表14各组死亡动物数

对各组动物死亡率进行χ²检测，得χ²＝0.373，P＝0.946>0.05，表明各组间家兔死亡率无统计学差异，家兔的死亡与人体生物敷料植入无关。

8.2家兔血清抗体的变化及各组间的对比

8.2.1家兔血清抗体IgG、IgA、IgM水平

家兔血清抗体IgG、IgA、IgM检测结果列于表15。

表15家兔血清抗体IgG、IgA、IgM水平(μg/ml)

8.2.2处理后不同时间家兔血清抗体的变化

处理后不同时间家兔血清抗体的变化见图3-5。从图中可以看出，各组家 兔血清抗体水平均在第二周升高，在第四周有所下降，但仍高于实验前的基础水平，第12周血清抗体基本降低到实验前的基础水平。

对不同时间点血清抗体水平进行统计学检验，结果列入表16-19。从统计学分析结果可以看出，高剂量组和阳性对照组在处理后第二周IgG、IgA、IgM水平均高于实验前水平，具有统计学显著性的意义；低剂量组处理后第二周IgA和IgM水平高于实验前的水平，而IgG与实验前的水平对比无统计学差异；阴性对照组在处理后第二周IgG水平亦高于实验前的水平，可能与手术创伤引起轻度免疫反应有关；高剂量组和阳性对照组在处理后第四周IgA和IgM水平仍显著高于实验前的水平；各组在处理后第12周均基本恢复到实验前的水平，与实验前的结果对比无统计学差异。

表16阴性对照组不同时间点抗体水平的统计学分析结果

表17高剂量组不同时间点抗体水平的统计学分析结果

表18低剂量组不同时间点抗体水平的统计学分析结果

表19阳性对照组不同时间点抗体水平的统计学分析结果

8.2.3各组家兔血清抗体水平对比

各组家兔血清抗体水平(图6-9)在处理后第2周差异较明显，第2周各组家兔血清抗体水平见图7，从图中可以看出，血清抗体IgG、IgA、IgM水平均为：阳性对照组>高剂量组>低剂量组>阴性对照组。对各组家兔血清抗体水平进行统计学检验，结果列于表20-22。从表中可以看出，处理后第2周高剂量组IgG、IgA、IgM水平均高于阴性对照组，第4周IgA和IgM水平仍高于阴性对照组，结果具有统计学意义，说明人体生物敷料植入可引起家兔一定程度的免疫反应，但抗体仍处在较低水平，IgG、IgA、IgM最高水平仅分别为25.93、10.16、9.98μg/ml。采用佐剂加强免疫，与高剂量组对比，未见抗体水平明显提高，表明人体生物敷料经去抗原处理后，免疫原性很微弱，即使采用佐剂加强免疫，也不会导致明显的免疫反应。

表20各组家兔血清IgG水平的统计学分析结果

表21各组家兔血清IgA水平的统计学分析结果

表22各组家兔血清IgM水平的统计学分析结果

9.结论

9.1植入人体生物敷料后家兔未出现明显的异常反应，表明人体生物敷料植入是安全的；

9.2血清抗体在人体生物敷料植入后2周达到最高水平，4周后有所降低，12周时已接近实验前的基础水平；

9.3人体生物敷料植入后第2周血清抗体水平高于阴性对照组，第4周IgA和IgM水平仍高于阴性对照组，说明人体生物敷料植入后2-4周可引起家兔一定程度的免疫反应，但抗体仍处在较低的表达水平，IgG、IgA、IgM最高水平仅分别为25.93、10.16、9.98μg/ml；采用佐剂加强免疫，亦未见抗体水平明显提高，表明人体生物敷料的免疫原性很弱。

四、对本发明所述实施例所制作的人体生物敷料产品临床试验一：

临床一般资料(病种、病例总数和病例的选择)：本组烧(创)伤病人30例，其中男21例，女9例；年龄2-58岁；最小面积1％，最大面积5％；共36个创面，其中新鲜浅II°创面12个，新鲜深II°创面6个，残余创面6个，切(削)痂植皮创面6个，供皮区6个。本组病例均为同期门诊及住院病人。

临床试验方法：本组实验方法按临床试验方案进行，试验组使用本发明所制备的人体生物敷料覆盖各类烧(创)创面，对照组选用凡士林油纱或其它生物敷料。试验组与对照组选择同一病人的同一部位.或不同部位的创面进行疗效比较。

所采取的评价标准或/和统计学方法：创面常规愈合时间与试验组愈合时间的比较.选用T检验统计学方法处理，作为评价本发明所制备的人体生物敷料疗效的依据。覆盖切(削)痂自体小皮片或微粒皮移植创面，术后5周以上所使用人体生物敷料逐渐干燥脱落，创面封闭者视为优良；4周以下者视为差劣。

临床试验结果：本组30例，36个创面，仅1个小儿创面因固定不牢而 重新更换。新鲜浅II°创面一般8—10天愈合，平均缩短2-4天；深II°创面一般13-17天愈合，平均缩短3—5天；创面无炎症反应。肉芽创面、慢性溃疡、褥疮上使用，可去除坏死组织、净化、清洁创面，利于新鲜肉芽生长，促进创面愈合或为植皮修复培养了良好的创基。疆盖切(削)痂微粒植皮创面，术后5周以上所用人体生物敷料干化脱落，提高愈合质量。2个月后复查创面，无明显瘢痕增生现象；而未使用本发明所制备的人体生物敷料者，有瘢痕增生现象。化验检查：血、尿常规及肝、肾功能无异常，细苗培养无生长；临床应用未见毒副作用。

临床试验效果分析：本发明所制备的人体生物敷料有效地保护了创面，缩短了愈合时问：对于表皮撕脱创面，可形成“无缝隙”即时覆盖；尤其是真皮组织面进行了去抗原的技术处理，降低了抗原剂量，在切(削)痂微粒移植刨而上使用，附着力强、组织相容性好，延长了覆盖创面的时间，提高了创面愈合后的外观与功能。

临床试验结论：本发明所制备的人体生物敷料产品，适用于覆盖各类烧(创)伤创面及微粒植皮创面，有效地保护了创面，阻断丁细菌侵八，缩短了愈合时间；供皮区极缺的病人，先覆盖本发明所述人体生物敷料可以为下一次植皮提供时间的保证。有净化、清洁溃疡、褥疮及肉芽创面的作用，促进新鲜肉芽组织生长，创面可以自愈或为植皮修复培养了良好的上皮细胞生长环境，是一种值得推广的全新概念的创面外用人体生物敷料。

五、对本发明所述实施例所制作的人体生物敷料产品临床试验二：

临床一般资料(病种、病例总数和病例的选择)：本组均选择同一时间段的门诊和住院患者32例：男18例，女14例；年龄1-36岁；共42个创面：浅II°例(8个创面)，深II°例(8个创面)，大面积Ⅲ°5例(15个创面)；肉芽创面4例(4个创面)，慢性溃疡2例(2个创面)，褥疮2例(2个创面)；新鲜创伤创面3例(3个创面)。本组使用最小面积6cm×4cm，最大面积50cm×40cm。

临床试验方法(包括对照组设置)：1、试验组及对照组病例采用随机分组： 试验组使用本发明实施例所制人体生物敷料覆盖各类烧(创)伤创面，而对照组覆盖材料选用凡士林油纱或生物敷料2、选择同体或同一部位损伤近似的创面作为试验组与对照组疗效的比较。

所采取的评价标准或/和统计学方法：1、以各类创面常规愈合时间为标准，与试验组愈台的时间相比较，选用T检验的统计学方法处理，作为评价本发明所述人体生物敷料缩短创面愈合时间的依据；2、覆盖微粒植皮创面，术后5周以上脱落，视为达标合格；4周以下脱落为不合格。

临床试验结果：本组32例，42个创面，其中2个创面因固定不牢而重新更换。浅II°创面7-9天愈台，缩短3-5天；深II°创面2周左右愈合，缩短5-7天；未见炎症反应。肉芽创面、慢性溃疡、褥疮上使用，可去除坏死组织、净化、清洁创面，利于新鲜肉芽生长，促进创面愈合或为植皮培养了良好的创基。血、尿常规及肝、肾功能未见异常，细菌培养无生长，未见毒副作用。覆盖Ⅲ°切(削)痂微粒植皮创面，术后5周以上脱落，提高了愈合质量。

临床试验效果分析：本发明所制备的人体生物敷料具有异体皮覆盖创面的优点，为创面修复创造了良好的内在环境，缩短了创面愈合时间。此外，本发明所制备的人体生物敷料的真皮组织面，经过去抗原的技术处理，具有一薄层细胞外基质“支架”的作用，改善了愈合后创面的外观与功能。

临床试验结论：本发明所制备的人体生物敷料，应用于覆盖各类烧(创)伤创面及微粒植皮创面，具有良好的覆盖作用，减轻创面疼痛、促进上皮生长，缩短愈合时间，减少瘢痕形成；另外，覆盖溃疡、褥疮以及肉芽创而、可净化、清洁创面，促进新鲜肉芽生长，利于创面愈合或为植皮修复培养了良好的创基。是一种值得推广的全新概念的创面外用人体生物敷料。

以上所述的仅为本发明的优选实施例，所应理解的是，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的思想和原则之内所做的任何修改、等同替换等等，均应包含在本发明的保护范围之内。