一种用于抑制肿瘤细胞生长的基因表达元件及其应用

摘要

本发明公开了一种用于抑制肿瘤细胞生长的基因表达元件及其应用。所述基因表达元件由第一表达框和第二表达框组成，第一表达框由肿瘤特异性启动子，分别靶向DNA聚合酶α、δ、ε的三种mircoRNA序列以及转录终止信号序列依次连接而成；第二表达框由肿瘤特异性启动子、凋亡因子基因以及转录终止信号序列依次连接而成。一方面，本发明以染色体复制必需的三个DNA聚合酶基因为靶点，对它们的表达同时进行有效抑制，使得肿瘤细胞因缺乏这三种DNA聚合酶而无法进行染色体复制，进而无法增殖；另一方面，利用凋亡因子促进停止增殖的肿瘤细胞凋亡，最终达到较为彻底的基因治疗的目的。

说明书

技术领域

本发明属于肿瘤基因治疗技术领域，具体涉及一种用于抑制肿瘤细胞 生长的基因表达元件及其应用。

背景技术

恶性肿瘤是严重危害人类健康的疾病之一，其治疗耗费了大量的医疗 资源，手术、化疗和放疗等常规方式的疗效和预后均不理想，因此，研究 探索新的癌症治疗方法具有重要意义。

新兴的肿瘤生物治疗方法目前已经在临床开始应用，对放化疗无效的 恶性肿瘤的治疗显示出其独特的优势，展现出了良好的应用前景。其中肿 瘤基因治疗始终是肿瘤生物治疗的主要方向之一。

靶向性是肿瘤基因治疗一个非常重要的方面，即在特异性杀伤肿瘤细 胞的同时对正常细胞没有伤害。利用肿瘤特异性启动子，使目的基因只在 肿瘤细胞内特异性表达而在其它细胞中不表达，是靶向性基因治疗的主要 手段之一。

在靶基因的选择方面，目前的基因治疗研究大都仅针对那些在正常和 肿瘤细胞中表达差异明显的个别靶基因(如失活的抑癌基因、异常激活的 癌基因、过表达的抗凋亡基因、各种microRNA等)。然而，肿瘤的发生 发展涉及众多基因，仅仅针对一个或几个表达差异的基因虽能在一定程度 上纠正肿瘤细胞的某些恶性表型，显示出一定的体内外抑瘤效应，但因针 对个别靶基因的抑瘤效率以及载体导入的靶向性、目的基因表达的可调控 性等较多的问题而使这些基因治疗手段无法在临床上发挥更好的疗效，甚 至大部分难以进入临床。因此，探索、尝试新的提高基因治疗药物的靶向 性和体内抑瘤的有效性的肝癌基因治疗方法具有十分重要的意义。

肿瘤细胞具有快速生长和增殖的特性，而任何细胞的增殖都需要经过 染色体复制这一细胞内独一无二的重要基本环节。通过抑制DNA聚合酶 的表达，可以使肿瘤细胞无法进行染色体复制，进而无法增殖。

如公开号为CN 10168654A的中国专利公开了一种癌胚抗原阳性细 胞靶基因表达元件CPD，该基因表达元件导入CEA阳性的肿瘤细胞后， 可以在细胞中表达针对DNA聚合酶δ催化亚基p125的人工microRNA， 抑制DNA聚合酶δ催化亚基p125的表达，进而影响DNA复制，抑制细 胞增殖。

真核细胞中负责DNA合成的DNA聚合酶主要有α、δ、ε三种，而现 有用于抑制DNA聚合酶表达的肿瘤靶向性基因表达元件中，其携带的 microRNA均靶向单一的DNA聚合酶，其阻断DNA复制的效果不够理想。 并且，仅仅阻断肿瘤细胞的增殖还不能杀死肿瘤细胞，难以根治癌症。

发明内容

本发明公开了一种用于抑制肿瘤细胞生长的基因表达元件，该基因表 达元件不仅能有效阻断肿瘤细胞增殖，还能诱导肿瘤细胞凋亡。

一种用于抑制肿瘤细胞生长的基因表达元件，由第一表达框和第二表 达框组成，所述第一表达框由肿瘤特异性启动子、分别靶向DNA聚合酶 α、δ、ε的三种mircoRNA序列以及转录终止信号序列依次连接而成；所 述第二表达框由肿瘤特异性启动子、凋亡因子基因以及转录终止信号序列 依次连接而成。

一方面，本发明以染色体复制必需的DNA聚合酶α、δ、ε三个酶基 因为靶点，对它们的表达同时进行有效抑制，使得肿瘤细胞因缺乏这三种 DNA聚合酶而无法进行染色体复制，进而无法增殖；另一方面，本发明 利用凋亡因子促进停止增殖的肿瘤细胞凋亡，最终达到较为彻底的基因治 疗的目的。将mircoRNA和凋亡因子置于两个单独的表达框分别转录，避 免相互干扰。

针对不同的肿瘤细胞，可以选择不同种类的肿瘤特异性启动子，如甲 胎蛋白启动子、癌胚抗原启动子或前列腺特异性抗原启动子。其中，甲胎 蛋白启动子(AFP启动子)可以靶向肝细胞性肝癌细胞，癌胚抗原启动子 (CEA启动子)可以靶向CEA阳性的肠癌、肺癌细胞，前列腺特异性抗 原启动子(PSA启动子)可以靶向PSA阳性的前列腺癌细胞。

当选用AFP启动子时，其核苷酸序列优选为如SEQ ID No.1所示。该 序列的AFP启动子中包含人AFP基因的-4120至-3300区的增强子区域和 -180至+1区的基本启动子区域，其中，该增强子区域中带有多个肝细胞 特异性转录因子结合位点，可以较大幅度地特异地提高AFP启动子的表 达效率。

作为优选，靶向DNA聚合酶α的mircoRNA序列如SEQ ID No.2所 示，靶向DNA聚合酶δ的mircoRNA序列如SEQ ID No.3所示，靶向DNA 聚合酶ε的mircoRNA序列如SEQ ID No.4所示。

三种mircoRNA序列的表达顺序对其抑制效果基本无影响，mircoRNA 的拷贝数增加后，抑制效果略有增加但幅度不大，因此也没有必要增加拷 贝数。

所述凋亡因子基因可选用Caspase3、Caspase6、Caspase7或Granzyme  B基因。

作为优选，所述凋亡因子基因为Caspase3基因，其核苷酸序列如SEQ  ID No.5所示。

本发明还提供了携带有所述基因表达元件的表达载体。该表达载体可 以是腺病毒表达载体。

本发明还提供了所述基因表达元件在制备肿瘤基因治疗药物中的应 用。

采用包含不同肿瘤特异性启动子的基因表达元件，可以针对性地制备 相应的肿瘤基因治疗药物。

作为一种实施方式，本发明提供了一种肿瘤靶向性基因表达元件，其 核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，可用于制备抑制肝细胞性肝癌 (hepatocellular carcinoma，HCC)的基因治疗药物。该序列中，第一表达 框由AFP启动子、Caspase3基因以及串联连接的两个牛生长激素基因多 聚腺苷酸信号区BGH polyA依次连接而成；第二表达框由AFP启动子、 串联连接的分别靶向DNA聚合酶α、δ、ε的三种microRNA序列(miR-pol α-δ-ε)以及BGH polyA依次连接而成。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明的基因表达元件一方面以染色体复制必需的DNA聚合酶α、δ、 ε三个酶基因为靶点，对它们的表达同时进行有效抑制，使得肿瘤细胞因 缺乏这三种DNA聚合酶而无法进行染色体复制，进而无法增殖；另一方 面利用凋亡因子促进停止增殖的肿瘤细胞凋亡，最终达到较为彻底的基因 治疗的目的。

附图说明

图1A为各表达测试载体对Hep3B细胞中DNA聚合酶α基因表达的 mRNA水平的抑制效果；

图1B为各表达测试载体对Hep3B细胞中DNA聚合酶δ基因表达的 mRNA水平的抑制效果；

图1C为各表达测试载体对Hep3B细胞中DNA聚合酶ε基因表达的 mRNA水平的抑制效果；

图1A、1B、1C中，Relative mRNA level表示相对mRNA水平，Blank  control表示空白对照，统计学检验*：p<0.05，**：p<0.01，**：p<0.001， 下同；

图2A为腺病毒表达载体Ad/AFP-Casp-AFP-amiR的结构示意图；

其中，Adenoviral backbone表示腺病毒骨架，AFP promoter表示重组 AFP启动子，rCaspase3表示组成型重组活化Caspase 3基因，miR-polα表 示靶向DNA聚合酶α的人工miRNA，miR-polδ表示靶向DNA聚合酶 δ的人工miRNA，miR-polε表示靶向DNA聚合酶ε的人工miRNA，polyA 表示转录终止信号；下同；

图2B为腺病毒表达载体Ad/AFP的结构示意图；

图3A为不同肝细胞中甲胎蛋白AFP的mRNA水平；

其中，Relative mRNA level表示相对mRNA水平，HepG2、Hep3B为 肝癌细胞，HL7702为正常肝细胞；下同；

图3B为各腺病毒表达载体对HepG2细胞中各DNA聚合酶mRNA水 平的抑制效果；

图3C为各腺病毒表达载体对Hep3B细胞中各DNA聚合酶mRNA水 平的抑制效果；

图3D为各腺病毒表达载体对HL7702细胞中各DNA聚合酶mRNA 水平的抑制效果；

图4A为各腺病毒表达载体对HepG2细胞中DNA聚合酶蛋白水平的 抑制效果；

图4B为各腺病毒表达载体对Hep3B细胞中DNA聚合酶蛋白水平的 抑制效果；

图4C为各腺病毒表达载体对HL7702细胞中DNA聚合酶蛋白水平的 抑制效果；

图4A、4B、4C中，polα表示聚合酶α，polδ表示DNA聚合酶δ， polε表示DNA聚合酶ε，Caspase3表示凋亡因子，β-Actin表示内参蛋白， kDa表示蛋白质相对分子量；

图5为各腺病毒表达载体对不同肝细胞增殖的抑制效果；

其中，Relative cell viability(％)表示细胞相对存活率(％)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

实施例1单个及串联连接的靶向DNA聚合酶α、δ、ε人工microRNA 的表达测试元件的构建

1、PCR扩增

靶向DNA聚合酶α、δ、ε人工microRNA均基于人miR-30(miRBase  accession number:MI0000088)天然结构，核心序列获自RNAi Codex (http://cancan.cshl.edu/cgi-bin/Codex/Codex.cgi)，命名为和miR-polε。用软件设计该三种人工miRNA的引物序列，送由 Invitrogen上海分公司合成。采用二轮PCR法分别扩增编码三种人工 miRNA前体的DNA序列，其中，第一轮PCR的扩增引物为相应的Forward 和Reverse，引物互为模板；第二轮PCR扩增以回收纯化的第一轮PCR 扩增的的扩增产物(长度97bp)为模板，用外接限制性内切酶位点的引物 扩增得到142bp的人工miRNA前体序列。将人工miRNA前体序列克隆 至TA克隆载体pMD19-T(Takata公司，日本)，筛选插入DNA片段大小 正确的pMD19-T/miR-polα、pMD19-T/miR-polδ和pMD19-T/miR-polε， 送由Invitrogen上海分公司测序鉴定。

第一轮PCR采用的三对引物分别是：

(1)miR-polα

Forward：5’-TGCTGTTGACAGTGAGCGCGCAGATCATGT GTGAG CTAAATAGTGAAGCCACAGATGTA-3’；

Reverse：5’-TCCGAGGCAGTAGGCATGCAGATCATGTGT GAGCTA AATACATCTGTGGCTTCACTATT-3’；

(2)miR-polδ

Forward：5’-TGCTGTTGACAGTGAGCGACGGGACCAGG GAGAAT TAATATAGTGAAGCCACAGATGTA-3’；

Reverse：5’-TCCGAGGCAGTAGGCAGCGGGACCAGGGA GAATT AATATACATCTGTGGCTTCACTATA-3’；

(3)miR-polε

Forward：5’-TGCTGTTGACAGTGAGCGAGGTTCCCACT TGCTGC TCAATTAGTGAAGCCACAGATGTA-3’；

Reverse：5’-TCCGAGGCAGTAGGCACGGTTCCCACTTG CTGCTCA ATTACATCTGTGGCTTCACTAAT-3’；

PCR扩增条件：

95℃预变性2min→95℃变性30s→58℃退火30s→72℃延伸30s→30 个循环→72℃，5min。扩增产物：97bp。

第二轮PCR采用的引物为：

Forward：5’-(Bgl II)AGATCTGATCCAAGAAGGTATATTGCTGTTGA CAGTGAGCG-3’；

Reverse：5’-(BamH I)GGATCCATCGTAGCCCTTGAAGTCCGAGGC AGTAGGCA-3’；

PCR扩增条件：

95℃预变性2min→95℃变性30s→58℃退火30s→72℃延伸30s→30 个循环→72℃，5min。扩增产物142bp。靶向DNA聚合酶α、δ、ε的人 工mircoRNA序列miR-polα、miR-polδ、miR-polε分别如SEQ ID No.2～4 所示，SEQ ID No.2～4中，第1位至第6位均为限制性内切酶Bgl Ⅱ的酶 切位点，第7位至第136位序列分别为miR-polα、miR-polδ、miR-polε， 第137位至第142位均为限制性内切酶BamHⅠ的酶切位点。

2、克隆至表达载体

用BamHI和BglII双酶解序列正确的pMD19-T/miR-polα、 pMD19-T/miR-polδ和pMD19-T/miR-polε，获取分别编码miR-polα、 miR-polδ和miR-polε的DNA片段，克隆到表达载体pIRES2-EGFP (Clontech公司，美国)的BamHI位点，获得含有单个人工miRNA的三 种表达测试载体pIRES2-EGFP/miR-polα、pIRES2-EGFP/miR-polδ和 pIRES2-EGFP/miR-polε。用BamHI和BglII双酶解鉴定插入片段大小正确 的克隆。

用BamHI和BglII双酶解pIRES2-EGFP/miR-polδ，获得编码miR-polδ 的DNA片段，克隆到pIRES2-EGFP/miR-polα的BamHI位点，获得 pIRES2-EGFP/miR-polα-miR-polδ；用BamHI和BglII双酶解 pIRES2-EGFP/miR-polε，获得编码miR-polε的DNA片段，克隆到 pIRES2-EGFP/miR-polα-miR-polδ的BamHI位点，获得含有三种人工 miRNA的表达测试载体pIRES2-EGFP/miR-polα-miR-polδ-miR-polε。

没有外源插入片段的pIRES2-EGFP用作空白对照表达测试载体。

实施例2各表达测试载体对肝癌细胞Hep3B中DNA聚合酶基因表达的 mRNA水平的抑制效果(荧光实时定量PCR法)

取对数生长期的人肝癌细胞Hep3B 0.9×10⁶，分3孔均匀地接种于24 孔板中，取实施例1中构建的五种表达测试载体，按1.5g载体和3ul  Lipofectamine LTX的比例，瞬时转染肝癌细胞Hep3B。72小时后，收集 细胞，用荧光实时定量PCR试剂盒QuantiFast SYBR Green PCR(Qiagen  公司，德国)检测DNA聚合酶α、δ、ε以及内参蛋白β-Actin的mRNA 水平。每一样品设置三复孔，实验至少重复一次。检测结果如图1A、图 1B、图1C所示。

由图1A、图1B、图1C可见，与空白对照表达测试载体pIRES2-EGFP 相比，表达测试载体pIRES2-EGFP/miR-polα-miR-polδ-miR-polε能够显著 地抑制DNA聚合酶α、δ、ε的mRNA水平，抑制率分别达69.62％(p<0.001, n＝3)、57.29％(p<0.05,n＝3)和60.00％(p<0.01,n＝3)。而表达测试载体 pIRES2-EGFP/miR-polα、pIRES2-EGFP/miR-polδ、pIRES2-EGFP/miR-polε 对DNA聚合酶α、δ、ε的mRNA水平的抑制率则分别仅为39.00％(p<0.05, n＝3)、26.33％(p>0.05,n＝3)和12.68％(p>0.05,n＝3)。

结果清楚表明，与单独表达相比，miR-polα、miR-polδ、miR-polε串联 表达后，表达测试载体对DNA聚合酶α、δ、ε的mRNA水平的抑制效应 显著提高，由此，用串联表达的三种人工miRNA构建本项发明的基因表 达元件。

实施例3抑制肝细胞性肝癌细胞生长的基因表达元件的构建

1第一表达框的构建

(1)重组AFP启动子

重组AFP启动子的碱基序列如SEQ ID No.1所示，其中第1位至第6 位为限制性内切酶BglⅡ的酶切位点；第1013位至第1018位为限制性内 切酶BamHⅠ的酶切位点。

重组AFP启动子中包含人AFP基因的-4120至-3300区的增强子区域 和-180至+1区的基本启动子区域，其克隆方法参见文献：叶景佳，陈萍， 贾振宇，李春春，陈丽红，曹江。巨细胞病毒增强子提高人甲胎蛋白启 动子效率的研究。中国细胞生物学学报，2013，35(4)：486-493；获得 pMD19-T/AFP。

(2)靶向DNA聚合酶的人工microRNA

编码靶向DNA聚合酶α的的DNA序列如SEQ ID No.2所 示。

编码靶向DNA聚合酶DNAδ的miR-polδ的DNA序列如SEQ ID No.3 所示。

编码靶向DNA聚合酶ε的的DNA序列如SEQ ID No.4所 示。

(3)构建第一表达框

将重组AFP启动子、miR-polα、miR-polδ、miR-polε和克隆自 pcDNA3.1(+)(Life Technologies公司，美国)的转录终止信号BGH polyA 片段按顺序先后克隆到pMD19-T，获得基因表达元件： pMD19-T/AFP-amiR(amiR：miR-polα-miR-polδ-miR-polε)。

构建过程包括：

①用BamHI和BglII双酶解序列正确的pMD19-T/miR-polα，获取编 码miR-polα的DNA片段，克隆到pMD19-T/AFP的BamHI位点，获得 pMD19-T/AFP-miR-polα。

②用BamHI和BglII双酶解序列正确的pMD19-T/miR-polδ，获取编 码miR-polδ的DNA片段，克隆到pMD19-T/AFP-miR-polα的BamHI位点， 获得pMD19-T/AFP-miR-polα-miR-polδ。

③用BamHI和BglII双酶解序列正确的pMD19-T/miR-polε，获取编 码miR-polε的DNA片段，克隆到pMD19-T/AFP-miR-polα-miR-polδ的 BamHI位点，获得pMD19-T/AFP-miR-polα-miR-polδ-miR-polε。

④用BamHI和BglII双酶解序列正确的pMD19-T/polyA，获取转录 终止信号序列BGHpolyA，将转录终止信号序列BGHpolyA克隆到 pMD19-T/AFP-miR-polα-miR-polδ-miR-polε的BamHI位点，获得 pMD19-T/AFP-miR-polα-miR-polδ-miR-polε-polyA，即pMD19-T/AFP- amiR。

2第二表达框的构建

(1)组成型重组活化Caspase 3基因(rCaspase3)

rCaspase3基因的克隆方法如论文(Chen J,Yang B,Zhang S，Ling Y,Ye  J,Jia Z,Cao J:Antitumor potential of SLPI promoter controlled recombinant  caspase-3expression in laryngeal carcinoma.Cancer Gene Ther 2012,19(5): 328-335.)；克隆得到的基因序列如SEQ ID No.5所示，其中，第1位至第 6位为限制性内切酶BglⅡ的酶切位点；第7位至第1151位序列为重组活 化Caspase3基因；第1152位至第1157位序列为限制性内切酶BamHⅠ的 酶切位点；将克隆得到的基因转入pMD19-T中，构建获得 pMD19-T/Caspase3。

(2)构建第二表达框

将重组AFP启动子、rCaspase 3和BGH polyA按顺序先后克隆到 pDC312(Microbix Biosystems公司,加拿大)，获得基因表达元件： pDC312/AFP-Casp。构建过程如下：

①用BamHI和BglII双酶解序列正确的pMD19-T/AFP，获取编AFP 启动子，克隆到pDC312的BamHI位点，获得pDC312/AFP；

②用BamHI和BglII双酶解序列正确的pMD19-T/Caspase3，获取重 组活化的Caspase3基因，克隆到pDC312/AFP的BamHI位点，获得 pDC312/AFP-Caspase3；

③用BamHI和BglII双酶解序列正确的pMD19-T/polyA，获取 BGHpolyA，将BGHpolyA克隆到pDC312/AFP-Caspase3的BamHI位点， 获得pDC312/AFP-Caspase3-polyA，即pDC312/AFP-Casp。

3、构建Ad/AFP-Casp-AFP-amiR

将pDC312/AFP-amiR和pDC312/AFP-Casp串联连接，获得基因表达 元件：pDC312/AFP-Casp-AFP-amiR(SEQ ID No.6)，构建过程如下：

①用BamHI和BglII双酶解序列正确的pMD19-T/polyA，获取转录终 止信号BGHpolyA，克隆到pDC312/AFP-Casp的BamHI位点，获得 pDC312/AFP-Casp-polyA，以保证重组活化Caspase3转录完全终止。

②用BamHI和BglII双酶解pMD19-T/AFP-amiR，获得第一表达框 AFP-amiR，克隆到pDC312/AFP-Casp-polyA的BamHI位点，获得基因表 达元件pDC312/AFP-Casp-AFP-amiR。SEQ ID No.6中，第7位至第1012 位、第2632位至第3637位的序列为人重组AFP启动子；第1019位至第 2163位的序列为人重组活化型的凋亡因子Caspase3；第2170位至第2625 位的序列为串联连接的2个牛生长激素基因多聚腺苷酸信号区BGH  polyA，第4146位至第4370位的序列为1个BGH polyA，为基因表达提 供转录终止信号；第3644位至第4045位的序列为串联连接的靶向DNA 聚合酶α、δ和、ε的三种人工microRNA miR-polα-δ-ε；第4052位至 第4145位的序列为多克隆位点；第1位至第6位序列为限制性内切酶Bgl  Ⅱ位点；第1013位至第1018位、第2164位至第2169位、第2395位至 第2400、第2626位至第2631位、第3638位至第3643位、第3774位至 第3779、第3910位至第3905位序列为连接相邻片段的限制性内切酶 BamH Ⅰ/Bgl Ⅱ位点；第4046位至第4051位序列为限制性内切酶BamH Ⅰ 位点。

实施例4抑制肝细胞性肝癌细胞生长的腺病毒表达载体的构建

将基因表达元件pDC312/AFP-Casp-AFP-amiR与腺病毒骨架质粒 pBGHlox(delta)E1，3Cre vector(Microbix Biosystems公司)共转染 Adeno-X-293细胞(Clontech Laboratories公司，美国)，重组、包装后，获 得腺病毒表达载体Ad/AFP-Casp-AFP-amiR；其结构示意图见图2A。

用只包含重组AFP启动子的基因表达元件pDC312/AFP与 pBGHlox(delta)E1，3Cre vector共转染Adeno-X-293细胞，按照同样的方 法重组、包装后，获得腺病毒表达载体Ad/AFP，其结构示意图见图2B。 实施例5腺病毒表达载体对肝细胞肝癌细胞中DNA聚合酶α、δ、ε基因 表达的mRNA水平的抑制效果(荧光实时定量PCR法)

取对数生长期的人肝癌细胞HepG2、Hep3B和正常肝细胞HL7702， 分别按1.2×10⁶、1.6×10⁶和5×10⁵的量接种于6孔板中，用实施例2中构 建的六种腺病毒表达载体以MOI(感染复数)50分别感染48小时。

收集感染细胞，用试剂盒RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen公司)提取总 RNA，用M-MLV Reverse Transcriptase(Promega公司，美国)逆转录成 cDNA，用荧光实时定量PCR试剂盒QuantiFast SYBR Green PCR(Qiagen 公司)检测AFP、DNA聚合酶α、δ、ε以及内参蛋白β-Actin的mRNA 水平。每一样品设置三复孔，实验至少重复三次。检测结果见图3A、3B、 3C、3D。

由图3A、3B、3C、3D可见，与空白对照腺病毒表达载体Ad/AFP相 比，腺病毒表达载体Ad/AFP-Casp-AFP-amiR对三种DAN聚合酶的mRNA 水平的抑制效果与细胞中AFP水平正相关。在AFP强阳性的肝癌细胞 HepG2中，Ad/AFP-Casp-AFP-amiR对DNA聚合酶α、δ和ε基因的抑 制率分别达到51.19％(p<0.001,n＝3)、58.27％(p<0.001,n＝3)和51.50％ (p<0.001,n＝3)；在AFP弱阳性的肝癌细胞Hep3B中，对DNA聚合酶α、 δ和ε基因的抑制率分别为25.51％(p<0.05,n＝3)，34.33％(p<0.01,n＝3)和 26.28％(p<0.01,n＝3)；而在AFP阴性的正常肝细胞HL7702中，对DNA 聚合酶α、δ和ε基因的抑制率仅为12.71％(p<0.05,n＝3)，14.87％(p<0.01, n＝3)和12.06％(p>0.05,n＝3)。

实施例6腺病毒表达载体对肝细胞肝癌细胞中DNA聚合酶α、δ、ε基因 表达的蛋白质水平的抑制效果(Western blot法)

取对数生长期的人肝癌细胞HepG2、Hep3B和正常肝细胞HL7702， 分别按1.2×10⁶、1.6×10⁶和5×10⁵的量接种于6孔板中，用实施例2中 构建的六种腺病毒表达载体以MOI(感染复数)50分别感染48小时。

收集感染细胞并裂解，用BCA蛋白定量试剂盒(Thermo-Pierce公 司，美国)测定细胞总蛋白浓度；SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰 胺凝胶电泳)(8％分离胶，5％浓缩胶)分离蛋白，电转移至PVDF膜(Merck  Millipore公司，美国)，封闭后，分别与1︰100稀释的抗DNA聚合酶α、 δ、ε的三种抗体(Santa Cruz Biotechnology公司，美国)、抗Caspase 3抗 体(Cell Signaling Technology公司，美国)和1︰5000稀释的抗β-Actin 抗体(Santa Cruz Biotechnology公司)于4℃结合过夜；用TBST缓冲液洗 膜3次，再与1︰5000稀释的HRP(辣根过氧化物酶)标记的二抗(杭州联 科生物技术有限公司)结合，室温孵育2小时；用TBST洗膜3次，然后 用化学发光试剂盒Clarify Wester ubstrate(Bio-Rad Laboratories公司，美国) 显影，在化学发光凝胶成像仪上拍照、软件分析Western blot条带。实验 至少重复一次，检测结果见图4A、4B、4C。

由图4A、4B、4C可见，与空白对照腺病毒表达载体Ad/AFP相比， 腺病毒表达载体Ad/AFP-Casp-AFP-amiR对三种DAN聚合酶的蛋白水平 的抑制效应与细胞中AFP水平正相关，与对mRNA水平的抑制趋势相一 致。

在AFP强阳性的肝癌细胞HepG2中，Ad/AFP-Casp-AFP-amiR对DNA 聚合酶α、δ和ε的抑制率分别达到42.91％(p<0.05,n＝3)，75.91％(p<0.05, n＝3)和61.03％(p<0.05,n＝3)；在AFP弱阳性的肝癌细胞Hep3B中，对 DNA聚合酶α、δ和ε的抑制率分别为54.32％(p<0.05,n＝3)，20.58％(p<0.05, n＝3)和53.96％(p>0.05,n＝2)；而在AFP阴性的正常肝细胞HL7702中， 对DNA聚合酶α、δ和ε的抑制率仅为22.88％(p>0.05,n＝3)，14.53％(p>0.05, n＝3)和6.68％(p>0.05,n＝3)。

实施例7腺病毒表达载体对对肝细胞性肝癌细胞增殖的抑制效果(MTT 法)

取对数生长期的肝癌细胞HepG2、Hep3B和正常肝细胞HL7702，按 1×10⁴细胞/孔于0.5ml培养液的密度接种于24孔板中，用实施例2中构建 的六种腺病毒表达载体以MOI(感染复数)50分别感染。病毒感染72小 时后，每孔加入MTT(噻唑蓝,Sigma公司，美国)溶液，使终浓度为0.5 mg/ml，于5％CO₂培养箱中37℃继续培养4小时。弃去培养上清液，每 孔加入异丙醇250ul以溶解紫色结晶物，取100ul至96孔板，在微孔板检 测仪上测定样品在570nm波长的OD值，以690nm为参考波长，计算细 胞存活率：

细胞存活率＝(病毒感染细胞的OD值/无病毒感染细胞的OD值) ×100％；

每个样品设立3复孔，实验至少重复二次。

由图5可见，与空白对照腺病毒表达载体Ad/AFP相比，腺病毒表达 载体Ad/AFP-Casp-AFP-amiR对肝癌细胞增殖的抑制效应与细胞内AFP水 平正相关。对AFP强阳性的肝癌细胞HepG2存活率的抑制达56.40％ (p<0.001,n＝5)，对AFP阴性的正常肝细胞HL7702的存活率的抑制仅为 8.72％(p<0.01,n＝5)。