一种青虾FoxL2蛋白及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了一种青虾FoxL2蛋白及其编码基因与应用。利用本发明提供的引物组从青虾精巢或卵巢中克隆到了Foxl2基因，通过利用FoxL2基因制备得到dsRNA，将其注入雄性或雌性青虾围心腔后，可以沉默精巢或卵巢中FoxL2基因的表达，使青虾精巢的发育延缓，但对青虾卵巢的发育影响不明显。因此，青虾FoxL2基因可促进精巢的发育，其功能与FoxL2基因在哺乳动物及鱼类中的作用相反。本发明为解决青虾性早熟现象，培育优良品种提供新的思路和有效手段。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和生殖发育调控领域，具体涉及青虾FoxL2蛋白及其编码基因与 应用。

背景技术

青虾，学名日本沼虾(Macrobrachium nipponense)，俗称河虾，隶属十足目(Decapoda)、 长臂虾科(Palaemonidae)、沼虾属(Macrobrachium)，广泛分布于我国各地水域，生长快、 适应性强、养殖经济效益高，是我国重要的淡水养殖虾类。据2012年《中国渔业年鉴》记 载，全国养殖青虾年产量超过23万吨，年产值超过150亿元，是目前淡水养殖业中最有发 展前途的品种之一。近年来,随着其自然资源的锐减和养殖规模的扩大,养殖的青虾出现了生 产性能下降和种质资源退化的情况,其中虾个体小型化和“性早熟”的现象尤为突出。“性早 熟”即雌、雄性个体性腺提前发育，在生产中小虾性腺过早成熟，产卵导致个体变小、池塘 养殖密度过大、生长规格不齐、近亲交配等一系列问题，最终商品虾的规格降低，繁殖性 能下降，严重影响了青虾的品质和产值，成为青虾养殖业发展的一大瓶颈。为实现青虾产 业的可持续发展，寻找解决雌性青虾“性早熟”的解决方法变得刻不容缓。

Forkhead box protein L2(FoxL2)基因是一种广泛存在于哺乳动物以及鱼类体内的一种 基因，其主要功能为促进卵巢分化以及卵巢的发育。FoxL2基因在小鼠卵巢分化的开始既有 表达。在成熟的雌性小鼠体内敲除FoxL2基因后，其卵巢逐渐退化并伴有精巢的出现，但卵 母细胞取始终存在于小鼠的体内。最近的研究表明，FoxL2基因抑制精巢的发育主要是通过 抑制SOX9基因的表达。SOX9基因主要促进雄性特征的发育，并在小鼠中可导致性逆转。 FoxL2基因的研究多见与哺乳动物和鱼类，但尚未见对甲壳动物中FoxL2基因的研究。

RAN干扰(RNA interference,RNAi)是一种快速有效的基因功能研究方法，已广泛用于动 植物基因功能的研究。RNAi是指一种由双链RNA诱发的基因沉默现象，当细胞中导入与内 源性mRNA编码区同源的双链RNA时，mRNA发生降解从而阻碍特定基因的表达。RNAi 技术目前已应用于甲壳动物促雄腺中基因的功能研究。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种青虾FoxL2蛋白及其编码基因与应用，通过用 FoxL2-dsRNA注入雄性或雌性青虾体内，研究该基因在dsRNA刺激下的表达变化以及对精 巢或卵巢发育的影响，阐释FoxL2基因在青虾中的功能，推动FoxL2基因在甲壳类动物中的 研究，为利用FoxL2-dsRNA干扰技术抗性早熟的实用化提供新思路和参考依据。

为解决上述技术问题，本发明提供一种青虾FoxL2蛋白，具有SEQ ID NO.1所示的氨基 酸序列。

本发明还提供了编码上述的青虾FoxL2蛋白的FoxL2基因，其具有SEQ ID NO.2所示的 核苷酸序列。

本发明还提供了一种扩增上述的FoxL2基因的引物，其正向外引物3FoxL2-F1的核苷酸 序列如SEQ ID NO.5所示；正向内引物3FoxL2-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；反向 外引物5FoxL2-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；反向内引物5FoxL2-R2的核苷酸序 列如SEQ ID NO.8所示。

本发明还提供了一种上述FoxL2基因制备dsRNA所用的引物，引物序列如SEQ ID NO.3 与SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了一种延缓青虾精巢成熟的生物制剂，其含有以上所述的FoxL2基因制备 得到的dsRNA。

本发明提供了一种青虾FoxL2蛋白及其编码基因与应用，利用FoxL2基因合成的 dsRNA可以特异性的干涉精巢和卵巢中FoxL2基因的表达，将dsRNA通过注射的方式注 入青虾围心腔内，可以有效地延缓青虾精巢成熟的时间，证明其能够显著的延缓青虾精巢 的发育，但对卵巢发育的影响并不明显，因此FoxL2基因在青虾中的功能与其在哺乳动物 及鱼类中相反，首次证明FoxL2基因可促进青虾精巢的发育，可用于调控雄性青虾精巢发 育速度，为解决青虾性早熟提供理论基础。

附图说明

图1为外源性注射FoxL2-dsRNA后，对雄性青虾精巢发育的影响图；

其中0d，4d，7d，10d分别为注射后0，4，7，10天(N≥3)。

图2.为在精巢中，外源性注射FoxL2-dsRNA后，对雄性青虾内源FoxL2基因的表达量的影 响图；

其中0d，4d，7d，10d分别为注射后0，4，7，10天(N≥3)。对照组注射相同剂量的生理盐 水。

图3.为外源性注射FoxL2-dsRNA后，对雌性青虾卵巢发育的影响图；

其中0d，4d，7d，10d，14d分别为注射后0，4，7，10，14天(N≥3)。

图4.为在卵巢中，外源性注射FoxL2-dsRNA后，对雌性青虾内源FoxL2基因的表达量的影 响图；

其中0d，4d，7d，10d，14d分别为注射后0，4，7，10，14天(N≥3)。对照组注射相同剂 量的生理盐水。

具体实施方式

实施例1

青虾FoxL2基因全长cDNA的获得，由以下步骤实现：

步骤1：总RNA提取：

选取5支成熟雄虾的精巢，迅速放入盛有液氮的预冷研钵中，迅速的研磨。使用Takara公 司的RNAiso Plus提取试剂结合传统的酚仿抽提法提取精巢总RNA，提取方法参照使用说明 书。经过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，分光光度计分析该样品OD260/280比值在1.8-2.0 之间，并测定RNA的浓度。

步骤2：青虾FoxL2基因全长cDNA序列的克隆：

根据青虾促雄腺转录组文库中获得的FoxL2基因cDNA中间片段序列(SEQ ID NO.9)， 设计特异性正向外引物3FoxL2-F1(SEQ ID NO.5)、正向内引物3FoxL2-F2(SEQ ID NO.6)； 和反向外引物5FoxL2-R1(SEQ ID NO.7)、反向内引物5FoxL2-R2(SEQ ID NO.8)分别 进行cDNA 3’和5’端快速扩增，操作步骤按TaKaRa 3’-RACE和TaKaRa5’-RACE试剂盒说 明书进行。利用上海生工生物工程有限公司(Sangon)的柱式DNA胶回收试剂盒进行目的片 段的回收，将产物连接到pMD18-T载体(Takara)，并转化入大肠杆菌DH5α，进行蓝白斑 筛选(培养基为LB固体培养基含amp+,37℃培养12小时)，挑取单克隆白斑扩增培养(培 养基为LB液体培养基含amp+,37℃培养6小时。)后，对挑选的克隆进行PCR验证(试剂 成份见表1，PCR反应程序为：94℃预变性3min，然后进入下列循环：94℃30s，55℃30s， 72℃30s，30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。)，将插 入目的片段的阳性克隆送至上海铂尚生物公司进行测序分析。将得到的产物与青虾促雄腺 转录组文库中的FoxL2中间片段(SEQ ID NO.9)进行拼接，得到青虾FoxL2基因的cDNA 全长(SEQ ID NO.2)。利用NCBI开放阅读框预测软件 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)，得到青虾FoxL2基因编码的蛋白质的氨基酸序 列(SEQ ID NO.1)。

经过序列比对显示，青虾FoxL2基因和其它鱼类FoxL2的同源性在70％以上。

表1

实施例2：青虾FoxL2基因dsRNA的合成

以青虾FoxL2基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)为依据，在开放阅读框以内采用NCBI 在线dsRNA引物设计软件(http://www.flyrnai.org/cgi-bin/RNAi_find_primers.pl)设计制备双 链RNA的引物(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)，根据Transcript AidTM T7High Yield  Transcription kit(Fermentas,Inc.,USA)试剂盒说明进行体外转录合成dsRNA。将制备好的 dsRNA溶解在DEPC水中，测定其浓度并在1.5％琼脂糖凝胶上检测其纯度。将上述dsRNA 溶液以4ug/g的剂量注射到青虾的围心腔内。对照组注射相同体积的生理盐水，实验所用的 雄虾为同一批孵出的虾以保证精巢处于同一发育时期，雌虾都处于卵巢发育初期(刚排完卵)。 在注射后的第0、4、7、10天收集样品(N≥3)，将试验下的总重及采集的样品在分析天平上称 重，并将组织样品保存在RNA保存液中(Takara)。最后提取各样品的总RNA并反转成cDNA， 采用Real Time PCR检测FoxL2基因相对于对照组的表达量变化，以此来计算FoxL2基因干 扰的效率。性腺指数是评价动物性腺发育状况的重要指标。根据性腺发育指数(Gonad Somatic  Index，GSI)计算公式如下式所示，计算两组雄性和雌性青虾的GSI。

实施例3：青虾FoxL2基因在生产中的应用

按照实施例2提供的方法合成青虾FoxL2基因dsRNA。挑选100只健康的雄虾，采用实 施例2所提供的方法，将青虾FoxL2基因dsRNA注入到挑选的雄虾中，并与30只健康的雌 虾同塘饲养。对照组为另外100只雄虾，并与另外的30只健康的雌虾同塘饲养。母虾的卵巢 均已发育成熟。对照组饲养6天后即有母虾抱卵，但实验组知道第11天才发现抱卵母虾。对 照组母虾全部抱卵仅需12天，而实验组母虾全部抱卵需19天。

具体实验结果如下：

图1所示，为外源性注射FoxL2-dsRNA后，对雄性青虾精巢发育的影响图，依照实施例 2中所提供的dsRNA合成，注射以及注射后基因表达量的检测方法，在精巢中，相对于对照 组，注射后第4天，青虾FoxL2基因的表达量显著下降了63％，在第7天已经下降了92％， 但在第10天，FoxL2基因的表达量教注射后第7天有所回升；然后FoxL2基因在对照组中的 表达量取维持在一个比较稳定的水平，无明显变化。

如图2所示，为在精巢中，外源性注射FoxL2-dsRNA后，对雄性青虾内源FoxL2基因 的表达量的影响图，依照实施例2中的性腺发育指数计算公式，为对照组的精巢GSI性腺发 育指数和注射组的精巢性腺发育指数对比的示意图，可以看出FoxL2-dsRNA注射后，可延 缓青虾精巢的发育。

如图3所示，为外源性注射FoxL2-dsRNA后，对雌性青虾卵巢发育的影响图，依照实 施例2中所提供的dsRNA合成，注射以及注射后基因表达量的检测方法，在卵巢中，相对 于对照组，注射后第4天，青虾FoxL2基因的表达量显著下降了30％，在第7天已经下降 了30％，但在第10天，FoxL2基因的表达量下降了60％。

如图4所示，为在卵巢中，外源性注射FoxL2-dsRNA后，对雌性青虾内源FoxL2基因 的表达量的影响图，依照实施例2中的性腺发育指数计算公式，为对照组的卵巢GSI性腺发 育指数和注射组的卵巢性腺发育指数对比的示意图，可以看出FoxL2-dsRNA注射后，青虾 卵巢的发育无明显变化。

序列表

<110>  中国水产科学研究院淡水渔业研究中心

<120> 一种青虾FoxL2蛋白及其编码基因与应用

<130>  1

<160>  8    

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  579

<212>  PRT

<213>  人工序列

<400>  1

Met Lys Asp Asp Tyr Leu Ala Thr Pro Glu His Met His Asn Tyr Gly

1               5                   10                  15     

Ser Ser Asp Leu Ser Asp Val Ile Lys Arg Glu Glu Asp Ala Tyr His

            20                  25                  30         

Tyr Pro Thr Thr Thr Pro Leu Thr Asn Thr His His His Tyr Arg Ser

        35                  40                  45             

Glu Ser Tyr Gly Arg Pro Pro Val Leu Leu Pro Ile Glu Ala Asp Pro

    50                  55                  60                 

His Val Gln Ser Lys Ser Leu Tyr Asp His Ile Asp Ser Thr Ser Ala

65                  70                  75                  80 

Gln Pro Gly Phe Asp Ser Pro Lys Met Tyr Asp Asn Lys Leu Tyr Asp

                85                  90                  95     

Thr Thr Lys Ala Tyr Asp Lys Leu Tyr Ile Asp Lys Ser Ile Met Asp

            100                 105                 110        

His Ala Met Asp Thr Thr Pro Thr Ala Ala Ser Ser Pro Tyr Asp Ser

        115                 120                 125            

His His Lys Ile Lys Ser Tyr Pro Glu Met Leu Tyr Pro Thr Lys Pro

    130                 135                 140                

Pro Pro Ala Pro Pro Gln Pro Pro Pro Pro Pro His Ile Asp Thr His

145                 150                 155                 160

Ile Asp Asp Asn Ser Tyr Glu Lys Pro Tyr Asp Lys Pro Tyr Asp Lys

                165                 170                 175    

Gly Tyr Asp Lys Leu Tyr Asp Lys Gly Cys Glu Lys Thr Tyr Lys Thr

            180                 185                 190        

Leu Glu Thr Met Thr Ala Ser Ser Tyr Asp Arg Ser Tyr Glu Ala Thr

        195                 200                 205             

Thr Lys Ala Ile Glu Pro Val Asp Ser Thr Thr Thr His Glu Lys Ala

    210                 215                 220                

Gln Pro Leu Glu Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ser Val Pro Asp Gly Gln

225                 230                 235                 240

Glu Arg Thr Cys Ser Gly Asn Gly Asn Lys Lys Asp Glu Asn Ser Lys

                245                 250                 255    

Glu Ile Asn Asp Ile Asp Pro Asn Lys Lys Pro Pro Tyr Ser Tyr Val

            260                 265                 270        

Ala Leu Ile Ala Met Ala Ile Lys Glu Ser Pro Asp Arg Lys Leu Gln

        275                 280                 285            

Leu Ser Glu Ile Tyr His Trp Ile Ala Thr Lys Phe Pro Phe Tyr Gln

    290                 295                 300                 

Gln Gln Asn Ala Lys Glu Lys Gln Gly Trp Lys Asn Ser Ile Arg His

305                 310                 315                 320

Asn Leu Ser Leu Asn Glu Cys Phe Val Lys Ile Pro Arg Glu Gly Gly

                325                 330                 335    

Gly Gly Gly Gly Lys Gly Asn Tyr Trp Thr Leu Asp Pro Gln His Glu

            340                 345                 350        

Asp Met Phe Glu His Gly Asn Tyr Lys Arg Arg Arg Arg Met Lys Arg

        355                 360                 365            

Pro Asn Leu Tyr Arg His Ala Tyr Thr Tyr Pro Asp Ser Tyr Leu Gly

    370                 375                 380                

Ile Pro Thr Arg Ser Phe Phe Ser Ala Ser Pro Gly Ser Gly Trp Gly

385                 390                 395                 400

Ile Pro Gln Met Gln Gly Ser Gln Ile Gly Gly Tyr Pro Gln Thr Pro

                405                 410                 415    

Arg Ala His Thr Pro His Ser Tyr Ser Tyr Thr Gln Met Asn Gln Phe

            420                 425                 430        

Gln Ser Gly Val Gln Leu Ser Asn Gly Tyr Gln Gln Ile Gly Gly Ser

        435                 440                 445            

Leu Gly Ser Ser Ala Leu Gly Thr Ala Pro Leu Gly Ser Gly Ala Leu

    450                 455                 460                

Arg Pro Gly Leu Pro Ala Pro Leu Gly Gly Gly Phe Leu Gly Gly His

465                 470                 475                 480

Ser Pro Ala Ile Ser Ser Pro Ser Asn Asn Ser Ser Gly Leu Gly Ser

                485                 490                 495    

Ser His Ser Ile Trp Ser Ser Gly Ser Thr Ser Ser Leu Ser Ser Gly

            500                 505                 510        

Phe Gly Ser Ser Ser Phe Leu Ser Ser Ser Gly Ser Leu Gly Ser Ser

        515                 520                 525            

Ser Ala Pro Ser Leu Gln Pro Ser Phe Gly Ser Ser Thr Gly Gly Asn

    530                 535                 540                

Tyr Asn Ser Gly Leu Ser Ala Cys Pro Lys Gln Gly Asp Thr Pro Thr

545                 550                 555                 560

Ser Ser Gln Leu Thr Pro Leu Pro Tyr Tyr His Tyr Trp Thr Thr Asp

                565                 570                 575    

His Lys Ile

<210>  2

<211>  2097

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  2

atgcagctga cgaaacaggg agaggaagag tgaaaagact tctctaccta cggggacaac     60

gatatttaac aaaggaaaaa tgaaggacga ttacttagcc acgcccgagc atatgcacaa    120

ttatggcagc agcgatctca gtgacgtcat caagcgagaa gaggatgcct accactaccc    180

taccaccaca cctttgacaa atacccatca tcactacaga tcggagtcgt acgggagacc    240

gccggtgcta ctcccgatcg aagccgaccc gcacgtccag agcaaatccc tgtacgacca    300

catcgactcc accagcgccc agccgggatt cgactctccg aagatgtacg acaacaaact    360

ctacgacacg accaaggcct atgacaagct gtacatcgat aagtccatca tggaccacgc    420

gatggacacc acgccgacgg ctgcgtcgtc gccctacgac agccaccaca agatcaagtc    480

gtatccggag atgctctacc cgacgaagcc gccgcccgcg ccgccccagc cgccgccgcc    540

gccgcacata gatacccaca tcgatgacaa ctcctacgag aagccttacg acaaacctta    600

cgacaagggc tacgacaaac tctacgacaa gggctgcgag aagacgtaca agacgctgga    660

gacgatgacc gcgtcgtcgt acgacaggtc gtacgaggcg acgacgaagg cgatcgagcc    720

tgtcgattcg acgaccactc acgagaaggc tcagccgctg gagacgacca cgacgacgac    780

ctccgtgccc gatgggcaag agaggacgtg ttcagggaac gggaacaaga aggacgagaa    840

cagcaaagaa attaacgata ttgacccgaa taagaagcct ccctactcct acgtggctct    900

cattgccatg gcgataaagg aaagtcccga cagaaagctt cagctgagcg aaatatacca    960

ctggatcgcg accaagttcc cgttttacca gcagcagaac gccaaggaga agcaaggctg   1020

gaagaattcc atcaggcaca acctcagtct caacgagtgc ttcgtcaaga tcccccggga   1080

gggaggggga ggtggcggca agggcaacta ctggacgtta gatcctcagc acgaagacat   1140

gttcgaacac gggaactaca aaagacgccg gagaatgaaa agaccgaact tgtacaggca   1200

cgcctacacc tacccagatt cctacctggg aataccaacg aggtcattct tctctgcttc   1260

tccaggcagt ggctggggca tcccacagat gcagggcagt caaataggag gataccccca   1320

aaccccgagg gcccacacac cccattccta tagttacaca caaatgaatc agttccaaag   1380

tggagttcag ctaagcaatg ggtaccagca aatcggagga tctttaggca gctctgcact   1440

agggacagcg cccttaggat caggcgctct acgtccgggc ctgcccgcgc ccctgggggg   1500

aggattccta gggggccatt ccccagccat ctcctccccg agcaacaatt cctccgggtt   1560

aggatcctcg cactcgatct ggtcctcggg atcgacctcc tctctctcct cgggcttcgg   1620

gtcaagcagt ttcctcagtt ccagcggctc ccttggatcg tcctcggctc cttcgctgca   1680

gccttccttc gggagcagta caggaggcaa ctacaactcc ggcctaagtg catgcccgaa   1740

acaaggggac acgcccactt cgtcacagct cacgcccctc ccttattatc actactggac   1800

cactgaccac aagatataac agtcaggaca tcgggacatc acattgcaag accgagctcg   1860

tgaacctgtt taccagccgt gaaagagaaa atgcgcctgc acgcgacacc agcaatatct   1920

cgcagatagc cttggtccca tctcaataga gagaaatcaa cacagttcca ggcatatttc   1980

tagaaacaga cgctgtcctg cgtcatttgt cgatctaaaa ggcagcaagg ctcttacttc   2040

atctgcttcg catggagaac cgtgaaagga gcatcatcgt catcagcaaa aaaaaaa      2097

<210>  3

<211>  40

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  3

taatacgact cactataggg taggaggata cccccaaacc                           40

<210>  4

<211>  40

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  4

taatacgact cactataggg gctggaactg aggaaactgc                           40

<210>  5

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  5

ctactcctac gtggctctca tt                                              22

<210>  6

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  6

caacgagtgc ttcgtcaaga tcc                                             23

<210>  7

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  7

ctgaggttgt gcctgatgga at                                              22

<210>  8

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  8

tgcttctcct tggcgttctg ct                                              22

<210>  9

<211>  1250

<212>  DNA

<213>  FoxL2中间片段

<400>  9

ggcctatgac aagctgtaca tcgataagtc catcatggac cacgcgatgg acaccacgcc     60

gacggctgcg tcgtcgccct acgacagcca ccacaagatc aagtcgtatc cggagatgct    120

ctacccgacg aagccgccgc ccgcgccgcc ccagccgccg ccgccgccgc acatagatac    180

ccacatcgat gacaactcct acgagaagcc ttacgacaaa ccttacgaca agggctacga    240

caaactctac gacaagggct gcgagaagac gtacaagacg ctggagacga tgaccgcgtc    300

gtcgtacgac aggtcgtacg aggcgacgac gaaggcgatc gagcctgtcg attcgacgac    360

cactcacgag aaggctcagc cgctggagac gaccacgacg acgacctccg tgcccgatgg    420

gcaagagagg acgtgttcag ggaacgggaa caagaaggac gagaacagca aagaaattaa    480

cgatattgac ccgaataaga agcctcccta ctcctacgtg gctctcattg ccatggcgat    540

aaaggaaagt cccgacagaa agcttcagct gagcgaaata taccactgga tcgcgaccaa    600

gttcccgttt taccagcagc agaacgccaa ggagaagcaa ggctggaaga attccatcag    660

gcacaacctc agtctcaacg agtgcttcgt caagatcccc cgggagggag ggggaggtgg    720

cggcaagggc aactactgga cgttagatcc tcagcacgaa gacatgttcg aacacgggaa    780

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