一种能靶向抑制ERK信号通路的抗肿瘤多肽及其应用

摘要

本发明涉及一种能靶向抑制ERK信号通路的抗肿瘤多肽及其应用。本发明构建了一个靶向抑制ERK信号通路的小分子多肽，通过一系列生物学实验证明该小分子多肽在多种肿瘤如前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌中均能有效克服PI3K/AKT抑制剂或紫杉醇类药物在抗肿瘤治疗过程中出现的耐药，有显著的协同抗肿瘤作用，由于ERK信号通路存在于多种肿瘤中，是促进细胞生长以及肿瘤发生、发展的重要信号通路之一，因此该小分子多肽可用于此类肿瘤的治疗，优选与PI3K/AKT抑制剂或紫杉醇类药物联合使用。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学及生物医药技术领域，具体地说，涉及一种能靶向 抑制ERK信号通路的抗肿瘤多肽及其应用。

背景技术

磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)是目前发现的最为重要的促进 细胞生长以及肿瘤发生、发展的信号通路之一，因此，很多临床前或临床中正 在使用的药物，包括化疗药、靶向治疗药物等都被设计或者被证明通过抑制 AKT信号途径从而达到抗肿瘤的效果。

但人们发现，这类药物在经过初期较好的抗肿瘤效应后，往往会产生药物 耐受而失效。我们的研究发现，使用PI3K/AKT的抑制剂，如MK2206、 NVP-BEZ235处理前列腺癌细胞后，虽然能显著抑制AKT的激活，但却会导 致细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)信号 通路的激活，两者之间存在负反馈调节平衡，见图1。除此之外，该种负反馈 调节平衡还存在于乳腺癌、结肠癌、直肠癌等其他类型肿瘤中。

ERK是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)的 最重要的亚家族成员，而MAPK也是目前已知的重要的促细胞生长、促肿瘤 信号通路。这提示我们，ERK被负反馈激活是PI3K/AKT抑制剂出现耐药的重 要分子生物学机制。

然而，目前AKT与ERK信号途径之间的负反馈调节机制仍不清楚，也未 见使用PI3K/AKT抑制剂抗肿瘤治疗的同时通过抑制ERK信号通路来提高药 物治疗效果的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种能靶向抑制ERK信号通路的抗肿瘤多肽。

本发明提供了一种多肽，所述的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供了一种分离的核酸分子，它编码序列如SEQ ID NO.2所示的多 肽。

作为本发明的一个优选例，所述的核酸分子的序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明提供了一种表达载体，所述的表达载体包含有如上所述的核酸分 子。

本发明提供了一种药物组合物，它含有序列如SEQ ID NO.2所示的多肽， 和药学上可接受的载体。

作为本发明的一个优选例，所述的药物组合物还包含PI3K/AKT抑制剂或 紫杉醇类药物。

本发明提供了所述的多肽、所述的核酸分子、所述的表达载体或所述的药 物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

作为本发明的一个优选例，所述的肿瘤中AKT与ERK信号途径之间存在 负反馈调节。

更优选地，所述的肿瘤为前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、食 管癌、鼻咽癌、肺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、肾癌或胰腺癌。

本发明还提供了所述的多肽、所述的核酸分子、所述的表达载体或所述的 药物组合物在制备药物中的应用，所述的药物用于克服PI3K/AKT抑制剂或紫 杉醇类药物在抗肿瘤治疗过程中出现的耐药。

本发明优点在于：本发明构建了一个靶向抑制ERK信号通路的小分子多 肽P2SE，通过一系列生物学实验证明P2SE在多种肿瘤(前列腺癌、乳腺癌、 结肠癌、直肠癌)中均能有效克服PI3K/AKT抑制剂或紫杉醇类药物在抗肿瘤 治疗过程中出现的耐药，有显著的协同抗肿瘤作用。由于ERK信号通路存在 于多种肿瘤中，是促进细胞生长以及肿瘤发生、发展的重要信号通路之一，因 此小分子多肽P2SE可用于此类肿瘤的治疗，优选与PI3K/AKT抑制剂或紫杉 醇类药物联合使用。

附图说明

图1.LNCaP、C4-2、C4-2B为三种前列腺癌细胞。MK2206：0.5μM， NVP-BEZ23550nM，处理24小时后收集细胞提取蛋白，western blot检测。显 示MK2206、NVP-BEZ235处理前列腺癌细胞后，虽然能显著抑制AKT的激 活，但却会导致ERK信号通路的激活。

图2.能与支架蛋白IQGAP1的CC结构域结合的FOXO1片段的氨基酸序 列的鉴定。

图3.pCMV-HA载体图谱。

图4.CHX 10μg/ml，预处理30min，MK22060.5μM，处理6小时后收集 细胞提取蛋白，western blot检测。

图5.MK22060.5μM，持续处理48小时，MTS检测吸光度。

图6.MK22060.5μM，处理6小时后收集细胞提取蛋白，western blot检测。

图7.左图：PTX 10nM，处理24小时，收集细胞提取蛋白，western blot 检测。右图：LNCaP细胞，DTX 10nM，处理24小时，收集细胞提取蛋白， western blot检测。

图8.左图：PC3细胞，DTX 10nM，处理24小时，收集细胞提取蛋白， western blot检测。右图：免疫荧光检测，表明PC3稳定株中P2SE多肽稳定表 达。绿色荧光：HA；蓝色荧光：DAPI。

图9.左图：Xenogen活体成像系统动态观察肿瘤荧光强度。右图：DTX 处理24天后处死，各组肿瘤大小情况。

图10.各组小鼠在0天和24天时肿瘤荧光强度对比。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

本发明的发明人通过研究发现叉头转录因子1(FOXO1)掌控、平衡肿瘤 细胞中AKT与ERK信号途径之间的负反馈调节：当AKT激活时，FOXO1被 AKT磷酸化，并被转移至细胞浆中，细胞浆中的FOXO1与支架蛋白IQGAP1 的CC结构域结合从而抑制了ERK的激活；反之，当AKT被抑制，FOXO1 从细胞浆转移至细胞核内，解除了与CC结构域的结合，从而ERK信号通路 被激活。提示在使用PI3K/AKT抑制剂或紫杉醇类药物抗肿瘤治疗的同时抑制 ERK信号通路，将是克服耐药、提高该类药物治疗效果的关键。因此，发明人 设计了一个能与支架蛋白IQGAP1的CC结构域特异性结合的多肽，在细胞及 动物体内表达该多肽，进行了一系列生物学实验，验证了该多肽具备显著的抗 肿瘤效果。

实施例1 构建pCMV-P2SE质粒

参见图2，利用GST-PULL技术鉴定了能与支架蛋白IQGAP1的CC结构 域结合的FOXO1片段的氨基酸序列： NDDFDNWSTFRPRTSSNASTISGRLSPIMT(SEQ ID NO.1)。利用pCMV-HA 载体(购于Clontech公司，载体图谱见图3)构建表达该序列的质粒，并将第 319位点上的丝氨酸(S)点突变为谷氨酸(E)，达到模拟磷酸化状态的目的， 即：NDDFDNWSTFRPRTSENASTISGRLSPIMT(SEQ ID NO.2)。我们将构建 的质粒命名为pCMV-P2SE，所表达的多肽(序列如SEQ ID NO.2所示)命名 为P2SE。

pCMV-P2SE质粒的构建方法为：用EcoR I和Xho I酶酶切pCMV-HA载 体，与P2SE的表达序列(CTATTATTAAAATTACTAACCTCATGAAAAGCAG  GAGCATGATCACTTCTACGATCATGATAATCACCAGCAAATTCAGGATAAT ACTGA，SEQ ID NO.3)进行连接得到pCMV-P2SE质粒，测序验证正确。

实施例2 P2SE在前列腺癌细胞中抑制了MK2206引起的ERK信号途径的 激活

在前列腺癌细胞LNCaP中转染pCMV-P2SE质粒，细胞体内表达P2SE多 肽。结果发现：MK2206处理的LNCaP细胞p-AKT受抑制，p-ERK显著升高； 而在转染表达P2SE多肽的细胞，p-AKT受抑制的同时，p-ERK并没有出现激 活。同时用CHX处理细胞，以排除P2SE的核转录功能引起的上述作用。见 图4。

实施例3 P2SE反转了前列腺癌细胞对MK2206的耐受

在前列腺癌细胞LNCaP中转染pCMV-P2SE质粒，细胞体内表达P2SE多 肽，进行MTS实验，检测LNCaP细胞的增殖活性。结果如图5所示，单独用 MK2206处理的细胞，在经历一个短暂的细胞抑制后，重新出现细胞增殖的反 弹；而在表达P2SE的细胞中，MK2206处理后，细胞增殖持续受到抑制。

实施例4 P2SE在乳腺癌细胞中抑制了MK2206引起的ERK信号途径的激 活

我们在两种乳腺癌细胞MDA-MB-468及BT-474中重复了上述前列腺癌细 胞中的实验。结果与前列腺癌细胞实验类似，如图6所示。MK2206处理的乳 腺癌细胞p-AKT受抑制，p-ERK显著升高；而在转染表达P2SE多肽的细胞， p-AKT受抑制的同时，p-ERK并没有出现激活。

实施例5 P2SE抑制了紫杉醇类化疗药物引起的前列腺癌、乳腺癌细胞ERK 信号途径的激活

紫杉醇类药物是治疗前列腺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤化疗药物，但治疗 效果较差，原因是病人对多稀紫杉醇耐药或病人无法耐受化疗毒性。我们在前 列腺癌细胞LNCaP及乳腺癌细胞BT-474中转染pCMV-P2SE质粒，细胞体内 表达P2SE多肽，并用紫杉醇(Paclitaxel，PTX)或多稀紫杉醇(Docetaxel，DTX) 治疗，结果发现，PTX或DTX处理的肿瘤细胞p-AKT受抑制，p-ERK显著升 高；而在转染表达P2SE多肽的细胞，p-AKT受抑制的同时，p-ERK并没有出 现激活。见图7。

实施例6 稳定表达P2SE的前列腺癌细胞中，DTX引起的ERK信号途径激 活被抑制

pTsin-P2SE质粒的构建：以pCMV-P2SE模板，利用HA-P2SE序列两端 引物PCR扩增得到HA-P2SE产物(HA-P2SE的核苷酸序列为： ATAGGAATACTACAAGGACTAATACGACTATTATTAAAATTACTAACCTCA TGAAAAGCAGGAGCATGATCACTTCTACGATCATGATAATCACCAGCAAA TTCAGGATAATACTGA，SEQ ID NO.4)，EcoR I和Xho I酶酶切pTsin载体(载 体序列如SEQ ID NO.5所示)，与HA-P2SE的PCR产物进行连接得到 pTsin-P2SE质粒，测序验证正确。

利用pTsin载体构建了pTsin-P2SE质粒，通过病毒包装感染恶性程度较高 的前列腺癌细胞PC3，并通过puromycin筛选得到能稳定表达P2SE的PC3细 胞稳定株。用DTX处理PC3细胞，发现DTX处理的普通PC3细胞中p-AKT 受抑制，p-ERK显著升高；而在稳定表达P2SE多肽的PC3细胞中，p-AKT受 抑制的同时，p-ERK并没有出现激活。见图8。

实施例7 P2SE显著增强了DTX对前列腺癌小鼠的抗肿瘤效果

我们利用实施例6构建的PC3/Luc/pTsin-vector和PC3/Luc/pTsin-P2SE稳 定细胞株，种植到NSG小鼠皮下，建立两种荷前列腺癌的小鼠模型。分别予 以尾静脉注射生理盐水(NS)或DTX治疗。DTX注射浓度为1mg/ml，5μl/ 小鼠体重(g)。NS注射体积5μl/小鼠体重(g)。每周的第1天和第3天给药。 连续观察24天，期间予以Xenogen活体成像系统动态观察肿瘤荧光强度。24 天时处死，取下肿瘤测量。如图9、图10所示，不表达P2SE的小鼠，经DTX 治疗后，肿瘤仍呈继续增大趋势，而稳定表达P2SE的小鼠经DTX治疗后， 肿瘤明显缩小。各组肿瘤体积相比较，P2SE+DTX组最小，相比于EV+NS组、 EV+DTX组均具有显著性差异(P<0.05)，平均肿瘤体积为EV+NS组的6.4％、 EV+DTX组的17.8％。

实施例8 P2SE显著增强了DTX对乳腺癌小鼠的抗肿瘤效果

通过病毒包装在乳腺癌细胞BT-474中转染pTsin-P2SE质粒或 pTsin-vector，并通过puromycin筛选得到能稳定表达P2SE的BT-474细胞稳定 株，将该BT-474/Luc/pTsin-P2SE稳定细胞株或BT-474/Luc/pTsin-vector细胞株 种植到NSG小鼠皮下，建立乳腺癌的小鼠模型。将小鼠模型进行分组并给予 治疗：(1)EV+NS组，由BT-474/Luc/pTsin-vector细胞株建立的小鼠模型，以 尾静脉注射生理盐水(NS)；(2)EV+DTX组，由BT-474/Luc/pTsin-vector细 胞株建立的小鼠模型，以尾静脉注射DTX；(3)P2SE+NS组，由 BT-474/Luc/pTsin-P2SE细胞株建立的小鼠模型，以尾静脉注射生理盐水(NS)； (4)P2SE+DTX组，由BT-474/Luc/pTsin-P2SE细胞株建立的小鼠模型，以尾 静脉注射DTX。DTX注射浓度为1mg/ml，5μl/小鼠体重(g)。NS注射体积5μl/ 小鼠体重(g)。每周的第1天和第3天给药。连续观察24天，期间予以Xenogen 活体成像系统动态观察肿瘤荧光强度。24天时处死，取下肿瘤测量。结果显示， 不表达P2SE的小鼠，经DTX治疗后，肿瘤仍呈继续增大趋势，而稳定表达 P2SE的小鼠经DTX治疗后，肿瘤明显缩小；各组肿瘤体积相比较，P2SE+DTX 组最小，相比于EV+NS组、EV+DTX组均具有显著性差异(P<0.05)，平均肿 瘤体积为EV+NS组的8.3％、EV+DTX组的21.6％。

实施例9 P2SE显著增强了DTX对结肠癌小鼠的抗肿瘤效果

通过病毒包装在人结肠癌细胞SW620中转染pTsin-P2SE质粒或 pTsin-vector，并通过puromycin筛选得到能稳定表达P2SE的SW620细胞稳定 株，将该SW620/Luc/pTsin-P2SE稳定细胞株或SW620/Luc/pTsin-vector细胞株 种植到NSG小鼠皮下，建立结肠癌的小鼠模型。将小鼠模型进行分组并给予 治疗：(1)EV+NS组，由SW620/Luc/pTsin-vector细胞株建立的小鼠模型，以 尾静脉注射生理盐水(NS)；(2)EV+DTX组，由SW620/Luc/pTsin-vector细 胞株建立的小鼠模型，以尾静脉注射DTX；(3)P2SE+NS组，由 SW620/Luc/pTsin-P2SE细胞株建立的小鼠模型，以尾静脉注射生理盐水(NS)； (4)P2SE+DTX组，由SW620/Luc/pTsin-P2SE细胞株建立的小鼠模型，以尾 静脉注射DTX。DTX注射浓度为1mg/ml，5μl/小鼠体重(g)。NS注射体积5μl/ 小鼠体重(g)。每周的第1天和第3天给药。连续观察28天，期间予以Xenogen 活体成像系统动态观察肿瘤荧光强度。28天时处死，取下肿瘤测量。结果显示， 不表达P2SE的小鼠，经DTX治疗后，肿瘤仍呈继续增大趋势，而稳定表达 P2SE的小鼠经DTX治疗后，肿瘤明显缩小；各组肿瘤体积相比较，P2SE+DTX 组最小，相比于EV+NS组、EV+DTX组均具有显著性差异(P<0.05)，平均肿 瘤体积为EV+NS组的9.2％、EV+DTX组的20.1％。

实施例10 P2SE显著增强了DTX对直肠癌小鼠的抗肿瘤效果

通过病毒包装在人直肠癌细胞SW480中转染pTsin-P2SE质粒或 pTsin-vector，并通过puromycin筛选得到能稳定表达P2SE的SW480细胞稳定 株，将该SW480/Luc/pTsin-P2SE稳定细胞株或SW480/Luc/pTsin-vector细胞株 种植到NSG小鼠皮下，建立直肠癌的小鼠模型。将小鼠模型进行分组并给予 治疗：(1)EV+NS组，由SW480/Luc/pTsin-vector细胞株建立的小鼠模型，以 尾静脉注射生理盐水(NS)；(2)EV+DTX组，由SW480/Luc/pTsin-vector细 胞株建立的小鼠模型，以尾静脉注射DTX；(3)P2SE+NS组，由 SW480/Luc/pTsin-P2SE细胞株建立的小鼠模型，以尾静脉注射生理盐水(NS)； (4)P2SE+DTX组，由SW480/Luc/pTsin-P2SE细胞株建立的小鼠模型，以尾 静脉注射DTX。DTX注射浓度为1mg/ml，5μl/小鼠体重(g)。NS注射体积5μl/ 小鼠体重(g)。每周的第1天和第3天给药。连续观察28天，期间予以Xenogen 活体成像系统动态观察肿瘤荧光强度。28天时处死，取下肿瘤测量。结果显示， 不表达P2SE的小鼠，经DTX治疗后，肿瘤仍呈继续增大趋势，而稳定表达 P2SE的小鼠经DTX治疗后，肿瘤明显缩小；各组肿瘤体积相比较，P2SE+DTX 组最小，相比于EV+NS组、EV+DTX组均具有显著性差异(P<0.05)，平均肿 瘤体积为EV+NS组的11.3％、EV+DTX组的25.7％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通 技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些 改进和补充也应视为本发明的保护范围。