一种以CRAC通道为靶点的抗炎、抗免疫药物的虚拟筛选方法

摘要

本发明公开了一种以CRAC通道为靶点的抗炎、抗免疫药物的虚拟筛选方法，包括以下步骤：(1)获取CRAC通道蛋白结构数据，构建同源模型；(2)确定活性中心，设定活性口袋；(3)根据活性口袋，利用分子对接软件，对化合物进行对接打分；(4)初步确定具有CRAC通道阻滞活性的化合物；(5)对化合物进行活性筛选，获得具有CRAC通道阻滞活性的先导药物；(6)构建药效团模型，对尚未进行分子对接或者已经对接后的小分子化合物进行进行匹配、比对，指导化合物的筛选或先导化合物的结构优化。本发明的虚拟药物筛选方法降低了进行活性测试的化合物的数量，节约了成本，提高了筛选效率，可用于进一步开发为新型的抗炎、抗免疫药物。

说明书

技术领域

本发明涉及一种以CRAC通道为靶点的抗炎、抗免疫药物的虚拟筛选方法，属于药物筛选 技术领域。

背景技术

钙离子(Ca²⁺)是人体内的最多的阳离子，一个成年人的体内约含有1kg的钙，人体内大 部分的钙主要以磷酸盐的形式存在在骨骼、牙齿中，小部分存在于体液和软骨组织中。而在 细胞中，钙主要贮存在细胞内的钙库(线粒体、内质网或肌浆网)中。胞外Ca²⁺的浓度大约为10^-3M，胞内钙离子的浓度大约为10^-7-10^-8M。两者相差10000多倍。虽然在细胞水平上钙元素的 含量很小，但是它对维系细胞内很多代谢活动极为关键。钙离子通道对维持细胞内外Ca²⁺平衡 具有重要作用。Ca²⁺作为第二信使，关乎许多基础的生理过程的正常进行，可参与调控大量的 生理活动，如血管舒缩、基因转录、递质释放、糖元代谢、蛋白质的合成与分解、细胞的生 长、增殖、分化和凋亡、细胞识别和内吞作用等等。位于神经系统、内分泌系统、心血管系 统细胞膜上的钙离子通道是受电压控制的，称为电压门控型的的钙离子通道 (voltage-operated Ca²⁺channel,VOC channel)。与此相对，位于淋巴细胞、T细胞、肥大 细胞和中性粒细胞等炎症细胞上还存在一类不受电压控制的钙离子通道。其中研究的最清楚 的是钙激活释放的钙离子通道(Ca²⁺release Activated Ca²⁺，CRAC)。CRAC通道由Orail及STIM (stromal interaction molecule)组成。STIM蛋白位于内质网上，是钙离子的感受器，ORAIL 蛋白位于细胞膜上，受到刺激后聚合成四聚物，形成CRAC通道部分。当受到外界刺激时，配 体与G蛋白偶联受体或免疫受体等细胞膜表面的受体结合，从而活化磷脂酶C(PLC)，水解磷 酯酰肌醇二磷酸(phosphatidylinositol 4,5bisphosphate,PIP₂)，导致胞质中l,4,5-磷 酸肌醇(inositol l,4,5trisphosphate,IP₃)浓度升高，使得内质网膜上的IP₃受体(IP₃R) 通道开放，引起内质网内Ca²⁺浓度外流，内质网中Ca²⁺浓度的耗竭，使得STIM1二聚体上的钙结 合区域失去Ca²⁺，结构随之改变，从而被激活。而此时，质膜上的Orai1单体也自发的组装成 为四聚体CRAC通道，被激活的STIM1二聚体迁移并聚集到质膜附近的节点处，触发CRAC通道开 启。CRAC通道开放后，大量Ca²⁺从胞外进入细胞，Ca²⁺的大量内流进而激活T细胞内重要的钙敏 感信使——nuclear factor of activated T cells(NFAT)，NFAT被激活后就会进入细胞核 内启动下游基因的表达，诱导核内细胞免疫因子基因增殖、表达，合成大量免疫细胞因子包 括白细胞介素(IL-2)等，并且诱导T细胞的增殖分化，从而产生免疫反应。因此，CRAC通道 对于T细胞的活化、增殖和凋亡都有重要作用。除此之外，一些人类免疫性疾病如免疫缺陷、 过敏、血栓和乳腺癌等的产生，也被发现与CRAC通道的活性异常有关。因此选择性阻滞Orail 通道或者阻断Orail与STIMI的偶联过程，就能有选择地抑制异常免疫反应，而不影响机体正 常的免疫功能，这将成为一种理想的治疗措施。因此CRAC(同Orail)通道成为一个重要的疾 病治疗靶标，靶向作用于CRAC通道的药物就有望用于治疗炎症反应和过度免疫反应等疾病。

然而，传统的药物筛选方法需先合成或分离出大量的化合物，费时、费力，且具有很大 的盲目性,成功率极低。随着计算机技术在药物研发领域的应用，计算机虚拟筛选为药物先导 化合物的发现提供了一种快速、高效的筛选技术。目前存在的CRAC通道抑制剂偏低，亟需寻 找活性剂选择性较高的结构新颖的药物先导化合物，以满足抗炎、抗免疫药物开发的需要。 因此，建立一种快速、高效的CRAC通道阻滞剂的虚拟筛选方法对于抗炎、抗免疫药物的研发 具有重要意义。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是建立一种快速、高效的CRAC通道阻滞剂的 筛选方法。

本发明的设计构思为：首先运用计算机辅助药物设计技术，将人和黑腹果蝇的CRAC通道 蛋白序列进行比对，然后以黑腹果蝇的CRAC通道晶体作为模板进行同源模型的构建，并且利 用同源模建软件预测出CRAC通道活性位点所在功能域，构建活性口袋，利用分子对接软件 Autodock，对小分子化合物库的化合物分子，进行分子对接打分，选出其中匹配度较高的分 子；基于几个已报道的具有CRAC通道阻滞活性的化合物，建立CRAC通道阻滞剂的药效团模 型，对打分较高的化合物进行匹配、比对，并且指导后期化合物的优化；再以细胞平台的高 通量筛选进行进一步验证，从而获得CRAC通道阻滞剂的候选分子。

基于上述设计构思，本发明采用如下技术方案：

一种以CRAC通道为靶点的新型抗炎、抗免疫药物的虚拟筛选方法，包括以下步骤：

(1)获取CRAC通道蛋白结构数据，构建同源模型；

(2)确定活性中心，设定活性口袋；

(3)根据设定的活性口袋，利用分子对接软件，对小分子化合物库中的化合物进行对接 打分；

(4)根据对接结果的排序，初步确定具有CRAC通道阻滞活性的化合物；

(5)对步骤(4)初步确定的化合物进行活性筛选，获得具有CRAC通道阻滞活性的先导 药物；

(6)利用已报道的活性较好的CRAC通道抑制剂为模板构建药效团模型，指导化合物的 筛选及先导化合物的结构优化。

上述的筛选方法：步骤(6)可置于步骤(1)至步骤(4)任何一个步骤之前。即可以对 尚未进行分子对接或者已经对接后的的小分子化合物进行药效团含有情况的筛选，而不受排 序限制。

为了进一步提高筛选的速度、效率和准确性，上述的虚拟筛选方法：步骤(4)可以为： 根据对接结果的排序，以及小分子配体的毒性、类药性、药效团含有情况以及小分子配体与 活性中心的相互作用方式，进行综合评价，初步确定具有CRAC通道阻滞活性的化合物。

步骤(1)中，CRAC通道蛋白结构数据的获取方法为：通过Uniprot数据库得到人类的 CRAC的氨基酸序列(Uniprot ID:Q96D31)；同源模型的构建方法为：采用Cobalt方法与黑 腹果蝇CRAC晶体(PDB ID:4HKR2)的氨基酸序列进行序列比对，根据比对结果，采用 modeller9.11作为同源建模软件进行建模，采用DOPE、GA341、molPDF三种函数对构建的 模型进行打分评价，选择最好的模型。

步骤(2)中，根据文献报道的对CRAC通道功能至关重要的活性位点，利用Autodock 软件进行blinddock，确定阳性药物与CRAC通道蛋白的结合位点，以此结合位点为中心设定 10埃范围设定为活性口袋，用于对接。

步骤(3)中，采用的分子对接软件为Autodock，采用ChemGauss4打分函数对对接结果 进行打分。

步骤(6)中，所述药效团模型的构建方法为：选取已报道的活性很好骨架不同的CRAC 抑制剂作为模板；使用Caesar方法产生不同构象；然后对不同构象产生药效团模型进行叠合， 得到药效团模型。

步骤(6)中，用于构建药效团模型的CRAC抑制剂为SKF96365、Econazole、 2-Aminoethyldiphenyl borate、BTP2、Diethylstibestrol、Carboxyamidotriazole或/和 Synta compound 66，其结构式如下：

本发明的有益效果：

(1)本发明首次建立了CRAC通道抑制剂的虚拟筛选方法，通过药物的虚拟筛选，可以在 短时间内获得活性化合物的线索，将研究目标从几百万个化合物集中到几十个化合物，而且， 虚拟筛选的阳性率(5％～30％)远远高于高通量实验筛选(0.01％～0.1％)。另外利用构建的 药效团模型进一步指导了化合物的筛选，提高了化合物的命中率。筛选得到的化合物，利用 高通量细胞平台筛选，因此大大提高了筛选化合物的速度和效率，缩短新药研究的周期；

(2)本发明的虚拟药物筛选方法有效的节约了成本，最终筛选出了结构新颖的、活性较 好的CRAC通道阻滞剂，可用于进一步开发为新型的抗炎、抗免疫药物。

附图说明

图1为CRAC通道开放导致NFAT激活进核示意图；

图2为人类Orail(同CRAC)蛋白氨基酸序列；

图3a为以黑腹果蝇Orail(同CRAC)晶体为模板构建的同源模型的顶面观；

图3b为以黑腹果蝇Orail(同CRAC)晶体为模板构建的同源模型的侧面观；

图4为化合物与Orail(同CRAC)通道蛋白结合位点示意图；

图5为化合物YZ-01与Orail(同CRAC)通道蛋白结合模式示意图；

图6为构建好的药效团模型示意图。

具体实施方式

结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明， 并不对其内容进行限定。

实施例中所用到的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如 无特殊说明，均可从商业途径购买得到。

实施例1：一种以CRAC通道蛋白靶点，对Specs数据库中的300000个化合物进行抗炎、 抗免疫药物的虚拟筛选

虚拟筛选步骤如下：

1.1我们通过Uniprot数据库得到人类的CRAC通道蛋白的氨基酸序列(Uniprot ID: Q96D31)，结果见图2。

1.2通过使用Cobalt方法(具体方法参见Bioinformatics 23,1073–9(2007))，与黑腹 果蝇CRAC晶体(PDB ID:4HKR2)的氨基酸序列进行序列比对，两者的氨基酸序列一致性大于 30％。

1.3根据比对的结果，以与人类的CRAC通道蛋白具有较高同源性的黑腹果蝇CRAC晶体 为模板，采用modeller 9.11作为同源建模软件进行建模，产生不同的模型。

1.4根据打分对产生的模型进行评价，挑选最好的模型。方法是：DOPE打分越低越好， 负的越大越好；GA341打分越接近于1越好；molPDF是默认打分函数，越小越好。然后根据 这三个函数的打分结果，进行综合评价，选择DOPE、GA341、molPDF打分均衡的模型作为最 优模型。

1.5采用TIP3P水模型对选择的同源模型进行溶剂化，再利用AMBER 8软件的SANDER模 块，在300K做500步以1.0ns为步长的分子力学最小化和分子动力学模拟，对选择的模型 的能量及构象进行优化，构建好的同源模型见图3。

2.1利用Autodock软件中的随机对接(blind docking)功能，确定阳性药物与CRAC通道 蛋白的结合位点，以此结合位点为中心将10埃范围设定为活性口袋，用于对接，结果见图4。

2.2根据设定的活性口袋，利用分子对接软件Autodock，对Specs数据库中化合物进行 对接，用ChemGauss4函数对对接结果进行打分，打分负的越大越好；筛选出打分靠前、可能 具有CRAC抑制活性的化合物24个，见表1。随后我们用所构建的同源模型研究了YZ-01与 CRAC通道蛋白的作用模式，发现YZ-01可以与CRAC通道结合口袋中的Arg 384、Arg 986和 Arg 1588等残基产生强烈的离子键作用，与Trp 76和Trp 976等残基产生强烈的疏水作用。 结合模型见图5。

表1 分子对接打分结果

3.1我们通过使用Discovery Studio2.5的Hiphop模块构建了药效团模型。

3.2将7个活性很好，骨架不同的CRAC抑制剂作为模板，使用Caesar方法产生不同构 象(具体方法参见J.Chem.Inf.Model.47，1923-32(2007))，然后对不同构象产生药 效团模型进行叠合得到10个最终药效团模型。

3.3我们选取第一个药效团模型(见图6)进行后续化合物的筛选及先导化合物改造的指 导，该药效团模型包含1个氢键受体和两个疏水性基团。随后我们将打分最高的化合物YZ-01 与所构建的药效团模型进行叠合，发现其与能该药效团模型进行很好的匹配。

4对筛选出来的化合物进行活性初筛，活性结果见表2。

生物活性测定

我们对筛选出来的化合物进行了活性的初筛。初筛的方法是GFP-NFAT核转运法。毒胡罗 卜素(Thapsigargin，TG)诱导会使得CRAC通道开放，导致Ca²⁺内流，胞质内的Ca²⁺增多就会 使NFAT激活，被激活的NFAT就会从由胞质中进入核内。本实验将稳转型GFP-NFAT质粒导入 细胞，运用IN Cell Analyzer 6000激光共聚焦成像分析系统进行成像，再用利用Pipeline  Plot软件分析胞质、胞核内的绿光强度。进而计算出两者的强度比——绿光核质比，这就可 以用来衡量GFP-NFAT进核比例。在测试中我们选用SKF 96265作为阳性对照药，DMSO组作 为空白对照。采用GFP-NFAT核转运实验，利用了CRAC通道阻滞剂能阻断TG-NFAT通路的原 理，测量其对CRAC钙离子通道的阻滞活性，计算IC₅₀。

将GFP-NFAT稳转型细胞种在384孔板上，待细胞稳定后，加入梯度浓度的待测化合物和 阳性对照SKF 96265，再用TG刺激，空白对照组加入等量的DMSO。反应1h后，用4％多聚 甲醛(PFA)溶液进行固定，室温下进行10～15分钟。用PBS清洗后，再用0.1M NH₄Cl淬 灭10min，室温下进行10～15分钟。之后用DAPI(1μg/mL)室温下染色10～15分钟，清 洗后，加入PBS。开启IN Cell Analyzer 6000激光共聚焦成像分析系统进行成像。使用 Pipeline Plot软件中的NAFT translocation操作协议来分析细胞核和细胞质中的绿光强 度，并且计算细胞核和细胞质的光强比(核质比)。对各个化合物和阳性对照的核质比进行标 准化换算。将加TG的空白对照组的核质比设为1；没有加TG的空白对照组的核质比设为0。 化合物的标准化核质比值为＝(化合物核质比-未加TG刺激的空白对照组核质比)/加TG刺激 的空白对照组核质比。根据标准化核质比与化合物的浓度作图算出化合物的IC₅₀值，结果如 表2。

表2 化合物对CRAC钙离子通道的阻滞活性初筛结果

注：IC₅₀为化合物将CRAC钙离子通道阻滞50％的浓度。

由表2可知，YZ-01、YZ-02、YZ-08、YZ-10、YZ-14、YZ-16等化合物对CRAC通道的阻 滞活性IC₅₀值与阳性对照SKF96265接近，结果表明我们设计的CRAC通道阻滞剂模型是一类 新颖的CRAC通道阻滞化合物筛选方法。可以快速、准确、低碳的筛选出大量有效的CRAC通 道阻滞化合物，为发现先导化合物和进一步结构改造提供了理论和技术支撑。