生物标记用于制备心脏衰竭诊断组合物的用途及诊断装置

摘要

本发明提供一种个体生物样本中的生物标记用于制备诊断组合物的用途，所述诊断组合物用于评估个体的心脏衰竭可能性；再者，本发明进一步根据所述可能性将所述个体的心脏衰竭分类到美国心脏学会的A、B、C及D期或心脏衰竭的预后分类为死亡或再住院，其中，该生物标记选自黄嘌呤、亚精胺、丙酰肉碱、丁酰肉碱及对硫甲酚所组成组的至少一种。再者，本发明进一步提供一种用于诊断心脏衰竭的装置。相较于BNP与传统生物标记，本发明通过使用代谢组学分析而辨识出新的生物标记，由此提供心脏衰竭患者更好的诊断值与预后值。

说明书

技术领域

本发明关于个体生物样本中的生物标记用于制备诊断组合物的用 途以及含有该生物标记的诊断装置。

背景技术

心脏衰竭(heart failure)是多种心血管疾病发展到最后阶段所呈现 的一个临床综合征。在过去数十年来，对于基础病理生理学与血液动 力学的了解以及新颖药物与侵入性治疗的发展已有大幅的进步。尽管 如此，短期及长期与心脏衰竭相关的再住院率与死亡率仍高，且需大 量的健康照护资源。现有的治疗策略在心脏衰竭晚期的效果有限，迫 切需要新的介入性措施以降低在亚临床(sub-clinical)阶段时的不当分 子进程，以避免心脏衰竭病程进展到下一阶段。

多种用于心脏衰竭的生物标记已被证实。B型利尿胜肽(B-type  natriuretic peptide,BNP)及其N端片段已成为临床上有用于诊断心脏衰 竭及预后的生物标记。最近的研究显示，利尿胜肽亦提供无明显症状 的具有中度风险的心血管疾病个人的预后。不幸的是，此等生物标记 无法对用于侵入性治疗的分子标靶提供额外资讯。此外，单一生物标 记的应用可能不足以用来评估心脏衰竭患者，需通过多种分子的组合 以获得补偿。

根据目前对心血管风险因子的认知，大部分心脏衰竭患者的病因 仍无法解释。不论何种异质病因，心脏衰竭的发展与心脏不能满足身 体的代谢需求息息相关。整体代谢作用中伴随的变化对于心脏衰竭特 定性代谢组(metabolome)的临床应用(诊断与预后目的)具有暗示性。目 前心脏衰竭期别的评估并非根据致病机制，而是根据源自于美国心脏 病学会与美国心脏协会(American College of Cardiology and the  American Heart Association,ACC/AHA)的共识。ACC/AHA将心脏衰竭 分类成四个期别，举例而言，A期为尚未发生心脏结构性病变，但具 有罹患心脏衰竭的风险者(如具有冠心病但未出现梗塞的糖尿患者者)； B期为具有心脏结构性病变(即心输出量下降、左心室肥大及心室心房 扩张)，但未发生任何心脏衰竭症状的个人；C期指发展出临床心脏衰 竭的患者；D期指具有难治性心脏衰竭且需使用进阶侵入性治疗(例如： 双心室心律调节器、左心室辅助装置或移植)的患者。

除了ACC/AHA所定义的心脏衰竭期别，尚有依心脏衰竭功能状 态所定义的其他分类方式，称之为纽约心脏学会功能分类(I级至IV 级)，此分类涉及每日活动的症状与患者的生活品质。I级：体能活动 不受限制，普通体能活动不会造成过度疲劳、心悸或呼吸困难(呼吸短 促)；II级：体能活动稍受限制，静止时感到舒适，但普通体能活动会 造成过度疲劳、心悸或呼吸困难；III级：体能活动受到明显限制，静 止时感到舒适，但少量的普通活动就会造成过度疲劳、心悸或呼吸困 难；IV级：无法进行任何体能活动而不发生不适，静止时感到心功能 不全，若进行任何体能活动则不适感会增加。

发展多种生物标记的高产出量及潜力所带来的优势在于代谢组学 为辨识代谢特征的平台，该代谢特征与前心脏衰竭阶段至进阶心脏衰 竭阶段的亚型(subtype)相关，且独立于既定的传统风险因子所形成的 限制。彻底了解心脏衰竭中波动的代谢作用，并配合营养基因体学的 研究进展，将有潜力发展出个人化的预防措施。

US 2012/0286157A1揭露一种于个体中诊断心脏衰竭的方法，其 中，该方法包括从个体的样本中测定至少一种生物标记的量，该生物 标记诸如甘露糖(mannose)、次黄嘌呤(hypoxanthine)、谷氨酸盐 (glutamate)、尿酸(uric acid)、天冬氨酸盐(aspartate)等。此外，该专利 也揭露该方法可用于辨识个体是否需要治疗心脏衰竭，或测定心脏衰 竭疗程是否成功。

虽然几种生物标记(如甘露糖、次黄嘌呤、天冬氨酸盐)已被用于诊 断心脏衰竭，仍有医疗上的需求以寻找更具灵敏性及专一性的生物标 记，以用于诊断心脏衰竭(特别是在心脏衰竭早期阶段)及评估心脏衰竭 预后。

为了诊断心脏衰竭及评估心脏衰竭预后，本发明的目的用来测定 代谢组学分析的临床应用及重要性，以及探究心脏衰竭患者的复杂的 整体代谢波动，且在不同心脏衰竭期别或在侵入性治疗后复原阶段中 提供灵敏评估。

发明内容

有鉴于现有技术中的缺陷，本发明提供一种个体生物样本中的生 物标记用于制备诊断组合物的用途，所述诊断组合物用于评估个体的 心脏衰竭可能性，其中，该生物标记选自黄嘌呤(xanthine)、亚精胺 (spermidine)、丙酰肉碱(propionylcarnitine)、丁酰肉碱(butyrylcarnitine) 及对硫甲酚(p-cresyl sulfate)所组成组的至少一种。

于本发明的一具体实施例中，该生物样本选自血液、血浆、血清 及尿液所组成组的至少一种。

于本发明的一具体实施例中，该生物标记进一步包括氨基酸。

于本发明的一具体实施例中，该氨基酸选自谷氨酰胺、酪氨酸、 苯丙氨酸、组氨酸、精氨酸、亮氨酸、色氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、 赖氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸及脯氨酸所组成组的至少一种。

于本发明的一具体实施例中，该生物标记进一步包括次黄嘌呤 (hypoxanthine)。

于本发明的一具体实施例中，该生物标记进一步包括磷脂酰胆碱 (phosphatidylcholine)。

于本发明的一具体实施例中，该磷脂酰胆碱选自二酰基磷脂酰胆 碱C34:4、酰基-烷基磷脂酰胆碱C36:2、酰基-烷基磷脂酰胆碱C34:2、 酰基-烷基磷脂酰胆碱C34:3、二酰基磷脂酰胆碱C36:0、二酰基磷脂酰 胆碱C36:1、二酰基磷脂酰胆碱C36:3、二酰基磷脂酰胆碱C38:6、二 酰基磷脂酰胆碱C36:6、二酰基磷脂酰胆碱C38:5、二酰基磷脂酰胆碱 C40:5、二酰基磷脂酰胆碱C36:2、酰基-烷基磷脂酰胆碱C36:5、二酰 基磷脂酰胆碱C38:0、酰基-烷基磷脂酰胆碱C32:3、二酰基磷脂酰胆碱 C40:4、酰基-烷基磷脂酰胆碱C38:3及二酰基磷脂酰胆碱C42:6所组成 组的至少一种。

于本发明的一具体实施例中，该磷脂酰胆碱较佳选自酰基-烷基磷 脂酰胆碱C34:2、酰基-烷基磷脂酰胆碱C34:3及二酰基磷脂酰胆碱 C34:4所组成组的至少一种。

本发明进一步提供一种个体生物样本中的生物标记用于制备诊断 组合物的用途，所述诊断组合物用于评估可能性，根据所述可能性将 所述个体的心脏衰竭分类到美国心脏学会的A、B、C及D期，其中， 该生物标记选自黄嘌呤、亚精胺及丙酰肉碱所组成组的至少一种。

于本发明的一具体实施例中，该生物标记进一步包括氨基酸。

于本发明的一具体实施例中，该氨基酸选自谷氨酰胺、酪氨酸、 苯丙氨酸、组氨酸、精氨酸、亮氨酸、色氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、 赖氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸及脯氨酸所组成组的至少一种。

于本发明的一具体实施例中，该生物标记进一步包括次黄嘌呤。

于本发明的一具体实施例中，该生物标记进一步包括磷脂酰胆碱。

于本发明的一具体实施例中，该磷脂酰胆碱选自二酰基磷脂酰胆 碱C34:4、酰基-烷基磷脂酰胆碱C36:2、酰基-烷基磷脂酰胆碱C34:2、 酰基-烷基磷脂酰胆碱C34:3、二酰基磷脂酰胆碱C36:0、二酰基磷脂酰 胆碱C36:1、二酰基磷脂酰胆碱C36:3、二酰基磷脂酰胆碱C38:6、二 酰基磷脂酰胆碱C36:6、二酰基磷脂酰胆碱C38:5、二酰基磷脂酰胆碱 C40:5、二酰基磷脂酰胆碱C36:2、酰基-烷基磷脂酰胆碱C36:5、二酰 基磷脂酰胆碱C38:0、酰基-烷基磷脂酰胆碱C32:3、二酰基磷脂酰胆碱 C40:4、酰基-烷基磷脂酰胆碱C38:3及二酰基磷脂酰胆碱C42:6所组成 组的至少一种。

于本发明的一具体实施例中，该磷脂酰胆碱较佳选自酰基-烷基磷 脂酰胆碱C34:2、酰基-烷基磷脂酰胆碱C34:3及二酰基磷脂酰胆碱 C34:4所组成组的至少一种。

本发明进一步提供一种个体生物样本中的生物标记用于制备诊断 组合物的用途，所述诊断组合物用于评估可能性，根据所述可能性将 所述个体的心脏衰竭预后分类为死亡或再住院，其中，该生物标记选 自黄嘌呤、亚精胺、丁酰肉碱及对硫甲酚所组成组的至少一种。

于本发明的一具体实施例中，该生物标记进一步包括氨基酸。

于本发明的一具体实施例中，该氨基酸为必需氨基酸。

于本发明的一具体实施例中，该必需氨基酸选自组氨酸、异亮氨 酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸及缬氨 酸所组成组的至少一种。

于本发明的一具体实施例中，该必需氨基酸较佳选自亮氨酸、苏 氨酸及色氨酸所组成组的至少一种。

于本发明的一具体实施例中，该生物标记进一步包括二甲基精氨 酸(dimethylarginine)、及二甲基精氨酸/精氨酸的比率。

于本发明的一具体实施例中，该生物标记进一步包括对称性二甲 基精氨酸、及对称性二甲基精氨酸/精氨酸的比率。

本发明进一步提供一种用于诊断心脏衰竭的诊断装置，其包括： 检测器，用于检测选自黄嘌呤、亚精胺、丙酰肉碱、丁酰肉碱、对硫 甲酚及其组合所组成组的生物标记。

于本发明的若干具体实施例中，代谢组学技术(metabonomics/ metabolomics technology)可使用多变量统计技术(multivariate statistical  techniques)来分析高度复杂的数据组，该数据组产生自高产出量光谱， 如核磁共振(NMR)光谱及质谱(MS)。于本发明的若干具体实施例中， 可结合使用不同种类的光谱平台，如气相色谱-质谱法(GC-MS)及液相 色谱-质谱法(LC-MS)，其可带来补充分析结果的优势，因此可提供扩 大的用以解释与病理生理条件相关的生物性变异的代谢“窗 (window)”。于本发明的某些具体实施例中，辨识可用以说明具有心 脏衰竭的患者及健康者的代谢物谱型(metabolite profile)间差异的代谢 物，能够显示该疾病的重要基本分子机制。

于本发明的若干具体实施例中，分析方法可包括气相色谱法与质 谱法。举例而言，根据本发明的一具体实施例，该分析方法可包括气 相色谱-飞行时间质谱法(gas chromatography-time-of-flight mass  spectrometry,GC-TOFMS)及超效液相色谱-四偶极-飞行时间质谱法 (ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass  spectrometry,UPLC-QTOFMS)。于某些具体实施例中，可使用超过一 种分析方法以于患者样本中获得有关代谢物的数据。于若干具体实施 例中，可将一种或多种分析方法与多变数统计技术(multivariate  statistical techniques)一起使用，藉此判定患者样本中的代谢物谱型。

附图说明

图1显示针对心脏衰竭的全代谢组学的诊断数值。收集来自不同 心脏衰竭期别(A期、B期及C期)患者及正常者的血浆样本，通过 LC-MS/MS测定该样本的全代谢物浓度。图1中，(A)正交投影潜在结 构判别分析(OPLS-DA)得分图(score plot)显示正常对照组与A期及C 期的心脏衰竭患者间有明显的区别。为了区分正常对照组与C期患者， 使用所有全代谢组学数据组并计算出全代谢组学衍生参数，称之为t[1] (如x轴所示)；为了区分正常对照组与A期患者，使用所有全代谢组 学数据组并计算出另一全代谢组学衍生参数，称之为t[0](如y轴所示)。 于t[1]标尺中，A期患者的集聚区相似于正常对照组，然而相较于正常 对照组于t[0]标尺上向上位移。(B)依同样的全代谢组学衍生参数计算 方式，计算出B期患者的t[1]与t[0]值。B期患者的得分图广布的区域 位于A期、C期及正常对照组间。

图2显示心脏衰竭(HF)致病机制相关的代谢途径，辨别HF患者中 尿素(urea)循环(a)、生物蝶呤(biopterin)循环(b)、甲硫腺苷 (methylthioadenosine,MTA)循环(c)、甲硫氨酸循环(d)、鸟氨酸-脯氨酸 -谷氨酸(e)、多胺(polyamine)合成(f)、多巴胺(dopamine)合成(g)、甲基 化(肌酸酐(creatinine)及磷脂酰胆碱)(h)、转硫化反应 (transsulfuration)(牛磺酸(taurine))(i)、对硫甲酚合成(j)及嘌呤(purine) 代谢(k)的变异。在HF患者中，代谢物(实线框)显著增加、代谢物(虚 线框)显著减少、代谢物(黑色)不变，而代谢物(灰色)则未检测。

图3显示于急性心脏衰竭后的一系列追踪，BNP及tPS[1]数值示 于32个患者中，该些患者存活超过12个月，且于12个月结束时显著 改善成纽约心脏学会功能分类级别I。N表示正常对照组；M0、M6及 M12分别表示岀院前及岀院后6个月与12个月的数值；tPS[1]：根据 四种代谢物(组氨酸、苯丙氨酸、亚精胺及次黄嘌呤)的组合所产生的参 数，称之为tPS[1]。

图4显示BNP与一些目标代谢物及目标代谢物组合的诊断值。该 ROC曲线是通过B型利尿胜肽(B-type natriuretic peptide、BNP)、t[2] 及tPS[2]显示C期心脏衰竭的诊断(相较于正常对照组)。t[2]：衍生自 计算所有目标代谢物的参数；tPS[2]：根据四种代谢物(组氨酸、苯丙 氨酸、亚精胺及二酰基磷脂酰胆碱C34:4)的组合所产生的参数，称之 为tPS[2]。

图5显示代谢组学的预后值。图5中，(A)该ROC曲线用以比较 B型利尿胜肽(BNP)、t[2]、tPS[2]及tPS[3]的预后值。(B)及(C)分别表 示tPS[3]与BNP的卡本-麦尔曲线(Kaplan-Meier curve)，用以预测所有 案例的全因死亡(all-cause death)与心脏衰竭相关的再住院率的组合事 件。tPS[3]：根据四种代谢物(二甲基精氨酸/精氨酸的比率、亚精胺、 丁酰肉碱及必需氨基酸总量)的组合所产生的参数，称之为tPS[3]。

具体实施方式

以下特定的实施例用以例示本发明，本发明所属的技术领域人员 可以轻易确信本发明的其他优点及效果。本发明能以经制订的不同特 定案例或应用来实施，说明的细节亦能根据不同观点及应用而做出多 种修改或变化，且不悖离本发明的范围及精神。

尚需注意的是，本文中，除非特别表示或明确意指为单数，单数 形式的术语“一(a,an)”、“该(the)”须解释为亦涵盖复数。除非内文 清楚指明，否则术语“或”可与术语“及/或”互相取代。

本文中，术语“个体”或“个人”可为动物，举例而言，该个体 或个人可为哺乳动物，再者，该个体或个人可为人类。该个体或个人 可为男性或女性，该个体或个人亦可为患者，其中，该患者为正进行 牙科或医疗照护者，及/或为了失调或疾病而积极寻求医疗照护者。

本文中者，术语“健康”意指不具有心脏衰竭或其他相关失调的 个人。

本文中，术语“代谢作用”意指发生于有机活体内的一套化学反 应，用以维持生命。代谢作用通常可分为两种类别：分解代谢与合成 代谢。分解代谢为分解有机物质的一套化学反应(例如从细胞呼吸作用 中取得能量)；合成代谢为消耗能量来建构细胞组成物的一套化学反应 (例如蛋白质合成与核苷酸合成)。

本文中，术语“生物标记”意指为分子种类，该分子种类作为过 程、事件或状态(例如：老化、疾病或曝露于有毒物质)的独特生物性或 生物衍生性指标(例如：体内生化代谢物)。

本文中者，术语“代谢物”意指代谢作用的中间产物或产物。该 术语“代谢物”一般限制为小分子。“初级代谢物”为直接参与正常 生长、发育及生殖的代谢物(例如：乙醇)；“次级代谢物”为未直接参 与上述过程的代谢物，但其通常具有重要的生态功能(例如：抗生素及 色素)。有些抗生素使用初级代谢物作为前体，例如自初级代谢物色氨 酸所产生的放射菌霉素(actinomycin)。然而，为了本发明的目的，该术 语“代谢物”意指参与在代谢途径中的小分子(＜1000道尔顿(Dalton)) 中间产物及产物，该代谢途径如糖解作用、柠檬酸(TCA)循环、氨基酸 合成及脂肪酸代谢作用等等。

本文中者，术语“代谢组学(metabolomics或metabonomics)”意指 代谢物谱型的系统研究，该代谢物谱型是在一给定条件下的生物系统 的生物过程。“代谢组(metabolome)”意指一组完整的小分子代谢物(如 代谢中间产物、激素及其他讯号分子，以及次级代谢物)，该小分子代 谢物于生物样本(如生物细胞、组织、器官或有机体)中被发现且为细胞 过程的最终产物。代谢组学为可提供由上至下、全面性及无偏执 (unbiased)资讯的技术平台。现有两种代谢组学方法：全面性代谢组学 及目标代谢组学。

本文中，术语“代谢物谱型”或“代谢物生物标记谱型”意指代 谢物概况，其在健康的个体中，相较于不健康的个体(如具有心脏衰竭 个体)或在疾病的不同状态(如疾病的不同阶段)，会测定出不同含量(如 增加或减少)。

本文中，术语“心脏衰竭(HF)”意指心脏功能受损的情况，导致 心脏无法以足够的速率或足够的量输送血液。心脏衰竭可为收缩期受 损，造成心脏输出血液的量显著下降，因而降低血流量。因此，收缩 期心脏衰竭的特征为左心室的排出量(LVEF)显著降低，较佳地，排出 量低于50％。或者，心脏衰竭可为舒张期受损，即心室未能妥善放松， 且通常伴随有心室壁僵硬。舒张期心脏衰竭造成心室的充填不足，因 而影响血液流量。因此，舒张期功能失调亦导致舒张末期压力上升。 故心脏衰竭可影响右心(肺循环)及左心(体循环)或两者。测量心脏衰竭 的技术为本领域所公知，包括超声波心动扫描仪、电生理学、血管造 影，以及血中胜肽生物标记(例如：B型利尿胜肽(B-type natriuretic  peptide,BNP)或其前肽的N端片段)的测定。应理解心脏衰竭可持续发 生或仅于某些压力或活动的情况下发生。典型的心脏衰竭特征包括呼 吸困难、胸痛、头晕、意识模糊，以及肺部及/或末梢水肿。根据美国 心脏病学会与美国心脏协会的2001指南，心脏衰竭可分为A、B、C 及D期，A期：在未来具有发展成心脏衰竭的高风险，但未有功能或 结构性心脏失调的患者；B期：具有结构性心脏失调，但于任何时期 皆无症状者；C期：在具有基本结构性心脏问题的情况下，先前或目 前有心脏衰竭症状，但以医疗处理者；D期：具有难治性心脏衰竭且 需进阶侵入性治疗的患者。

本文中，术语“全代谢物(global metabolite)”意指获得全面性且广 泛的代谢物谱型，其在特定条件或在不同条件的数个跨群组中，可用 以比较大量的分析物。可通过分析来自不同处理条件(如药物处理组与 对照组)或不同病理生理情况(如糖尿病组与正常组)的复制样本而获得 全代谢物。为了此目的，将生物样品(细胞、血浆、尿液、唾液或病理 样品)进行分析(通过分析工具，如LC-MS)以产生数据组，随后进行单 变数或多变数统计分析。全代谢组学的目的在于辨别特征，该特征可 系统性将大量的代谢物分组(种类)。

本文中，术语“目标代谢物”意指经定义的代谢物组的辨识与量 化，该代谢物为结构上已知且经标注，且根据经完整建立的生物化学 途径而来。

本发明提供一种个体生物样本中的生物标记用于制备诊断组合物 的用途，所述诊断组合物用于评估个体的心脏衰竭可能性，其中，该 生物标记选自黄嘌呤、亚精胺、丙酰肉碱、丁酰肉碱及对硫甲酚所组 成组的至少一种。

根据本发明的一具体实施例，该生物样本选自血液、血浆、血清 及尿液所组成组的至少一种。

根据本发明的一具体实施例，该生物标记进一步包括氨基酸。

根据本发明的一具体实施例，该氨基酸选自谷氨酰胺、酪氨酸、 苯丙氨酸、组氨酸、精氨酸、亮氨酸、色氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、 赖氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸及脯氨酸所组成组的至少一种。

根据本发明的一具体实施例，该生物标记进一步包括次黄嘌呤。

根据本发明的一具体实施例，该生物标记进一步包括磷脂酰胆碱。

根据本发明的一具体实施例，该磷脂酰胆碱选自二酰基磷脂酰胆 碱C34:4、酰基-烷基磷脂酰胆碱C36:2、酰基-烷基磷脂酰胆碱C34:2、 酰基-烷基磷脂酰胆碱C34:3、二酰基磷脂酰胆碱C36:0、二酰基磷脂酰 胆碱C36:1、二酰基磷脂酰胆碱C36:3、二酰基磷脂酰胆碱C38:6、二 酰基磷脂酰胆碱C36:6、二酰基磷脂酰胆碱C38:5、二酰基磷脂酰胆碱 C40:5、二酰基磷脂酰胆碱C36:2、酰基-烷基磷脂酰胆碱C36:5、二酰 基磷脂酰胆碱C38:0、酰基-烷基磷脂酰胆碱C32:3、二酰基磷脂酰胆碱 C40:4、酰基-烷基磷脂酰胆碱C38:3及二酰基磷脂酰胆碱C42:6所组成 组的至少一种。

根据本发明的一具体实施例，该磷脂酰胆碱较佳选自酰基-烷基磷 脂酰胆碱C34:2、酰基-烷基磷脂酰胆碱C34:3及二酰基磷脂酰胆碱 C34:4所组成组的至少一种。

根据本发明的一具体实施例，在心脏衰竭C期的患者中，一些与 精氨酸代谢有关的代谢物(如谷氨酰胺及瓜氨酸)的含量较低；次黄嘌 呤、黄嘌呤、尿酸、谷氨酸、脯氨酸、鸟氨酸、精胺与亚精胺的含量 则上升；芳香氨基酸(如酪氨酸及苯丙氨酸)的含量较高。此外，数种磷 脂酰胆碱的含量降低，而牛磺酸的含量则增加。

本发明进一步提供一种个体生物样本中的生物标记用于制备诊断 组合物的用途，所述诊断组合物用于评估可能性，根据所述可能性将 所述个体的心脏衰竭分类到美国心脏学会的A、B、C及D期，其中， 该生物标记选自黄嘌呤、亚精胺及丙酰肉碱所组成组的至少一种。

根据本发明的一具体实施例，该生物标记进一步包括氨基酸。

根据本发明的一具体实施例，该氨基酸选自谷氨酰胺、酪氨酸、 苯丙氨酸、组氨酸、精氨酸、亮氨酸、色氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、 赖氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸及脯氨酸所组成组的至少一种。

根据本发明的一具体实施例，该生物标记进一步包括次黄嘌呤。

根据本发明的一具体实施例，该生物标记进一步包括磷脂酰胆碱。

根据本发明的一具体实施例，该磷脂酰胆碱选自二酰基磷脂酰胆 碱C34:4、酰基-烷基磷脂酰胆碱C36:2、酰基-烷基磷脂酰胆碱C34:2、 酰基-烷基磷脂酰胆碱C34:3、二酰基磷脂酰胆碱C36:0、二酰基磷脂酰 胆碱C36:1、二酰基磷脂酰胆碱C36:3、二酰基磷脂酰胆碱C38:6、二 酰基磷脂酰胆碱C36:6、二酰基磷脂酰胆碱C38:5、二酰基磷脂酰胆碱 C40:5、二酰基磷脂酰胆碱C36:2、酰基-烷基磷脂酰胆碱C36:5、二酰 基磷脂酰胆碱C38:0、酰基-烷基磷脂酰胆碱C32:3、二酰基磷脂酰胆碱 C40:4、酰基-烷基磷脂酰胆碱C38:3及二酰基磷脂酰胆碱C42:6所组成 组的至少一种。

根据本发明的一具体实施例，该磷脂酰胆碱较佳选自酰基-烷基磷 脂酰胆碱C34:2、酰基-烷基磷脂酰胆碱C34:3及二酰基磷脂酰胆碱 C34:4所组成组的至少一种。

根据本发明的一具体实施例，在心脏衰竭期别(例如：A期、B期 及C期)的判断上，相较于BNP值，检验组合下列所组成组的至少二 种生物标记的含量以及比对该生物标记的参考值较为灵敏：黄嘌呤、 亚精胺、丙酰肉碱、氨基酸、次黄嘌呤及磷脂酰胆碱。

本发明进一步提供一种个体生物样本中的生物标记用于制备诊断 组合物的用途，所述诊断组合物用于评估可能性，根据所述可能性将 所述个体心脏衰竭的预后分类为死亡或再住院，其中，该生物标记选 自黄嘌呤、亚精胺、丁酰肉碱及对硫甲酚所组成组的至少一种。

根据本发明的一具体实施例，该生物标记进一步包括氨基酸。

根据本发明的一具体实施例，该氨基酸为必需氨基酸。

根据本发明的一具体实施例，该必需氨基酸选自组氨酸、异亮氨 酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸及缬氨 酸所组成组的至少一种。

根据本发明的一具体实施例，该必需氨基酸较佳选自亮氨酸、苏 氨酸及色氨酸所组成组的至少一种。

根据本发明的一具体实施例，该生物标记进一步包括二甲基精氨 酸(dimethylarginine)、及二甲基精氨酸/精氨酸的比率。

根据本发明的一具体实施例，该生物标记进一步包括对称性二甲 基精氨酸、及对称性二甲基精氨酸/精氨酸的比率。

根据本发明的一具体实施例，在急性心脏衰竭后预后的状态预估 中，以检验组合四种代谢物(例如：组氨酸、苯丙氨酸、亚精胺及次黄 嘌呤)的诊断值，相较于BNP，该诊断值较为灵敏。

根据本发明的一具体实施例，在心脏衰竭预后的判断上，相较于 BNP值，检验组合下列所组成组的至少二种生物标记的含量以及比对 该生物标记的参考值较为灵敏：黄嘌呤、亚精胺、丁酰肉碱、氨基酸、 次黄嘌呤及磷脂酰胆碱。

本发明进一步提供一种用于诊断心脏衰竭的诊断装置，其包括： 检测器，用于检测选自黄嘌呤、亚精胺、丙酰肉碱、丁酰肉碱、对硫 甲酚及其组合所组成群组的生物标记。

以下多个实施例用以例示本发明，以下所述的实施例不限制本发 明的范围。

实施例

代谢组学分析的材料与方法

一、患者与研究设计：

本研究于2005年1月至2009年12月期间内招收具有B期及C 期心脏衰竭患者，于2008年5月至2009年12月，招收A期心脏衰竭 患者与正常对照组。C期患者因急性心因性肺水肿而住院的，其年龄 为20至85岁，具有收缩期及舒张期心脏衰竭的患者皆包括其中。B 期患者，与其左心室的排出量(LVEF)无关，其具有后期急性心肌梗塞， 且具有任何的严重结构异常或<40％的LVEF，但B期的患者无症状。 A期患者为(1)具有冠状动脉疾病的血管造影图像、≥50％的LVEF且无 症状；或(2)具有风险因子，但无症状，亦无冠心病的血管造影图像。 正常对照组为年龄20-85岁，且无显著的全身性疾病，如高血压、糖 尿病或冠状动脉疾病，其未进行任何药物治疗，且LVEF＞60％。

排除条件包括：(1)具有全身性疾病，如甲状腺机能减退、失代偿 性肝硬化(decompensated liver cirrhosis)及全身性红斑性狼疮；(2)具有 非心脏衰竭的失调，且已妥协存活6个月；(3)卧床不起>3个月及/或无 法独自站立的患者；(4)血清肌酸酐>3毫克/分升(mg/dl)的患者；以及(5) 患有严重冠状动脉疾病但未进行血管再造的患者。从所有患者处皆获 得知情同意。本研究设计及实行皆符合赫尔辛基宣言(Declaration of  Helsinki)的原则，且经长庚纪念医院人体试验伦理委员会批准。

二、血液样本与试验

于岀院前及岀院后6个月与12个月，将血液样本收集于含有 EDTA的管中。同后续章节所描述的代谢组学工作流程分析血浆。以 分级BNP试验(Triage BNP Test)(Biosite,San Diego,CA)三重复测量 BNP，该试验以荧光免疫分析法进行血浆BNP的定量。其它测量，包 括肾功能、血红素及C反应蛋白，于核心实验室中进行。

三、疾病管理计划

C期患者由HF小组进行照护，该小组由三位专门从事HF照护的 心脏病专家、一位心理学家、一位膳食助理及两位个案经理所组成。

四、后续追踪计划

预期每个月来自医院纪录、与患者的医生进行个人沟通、电话访 谈，以及患者例行探访的医生门诊以获得后续数据。“再住院率”定 义为与心脏衰竭相关的再住院率。三位心脏病专家组成的委员会不考 量患者的临床可变值而对所有的住院率进行裁定，决定何为与心脏衰 竭恶化相关的事件。将“全因死亡(all-cause)”选择作为终点(endpoint) 的原因为在患者分群中HF与其他并发症的相互关系。最严重的事件被 认为于后续的期间的终点。为了预后的目的，仅分析与HF相关的再住 院率与全因死亡的复合事件。

五、血浆代谢组分析

(1)通过LC-TOFMS分析血浆全代谢物

于50微升(μl)血浆中添加200μl乙腈(ACN)，将该混合物震荡30 秒，超声波震荡15分钟，接着以10,000×g离心25分钟，收集上清液 且放入分离式玻璃管，该沉淀物以200μl 50％甲醇重新萃取。将甲醇 上清液与乙腈上清液两种水性溶液收集在一起并于氮气蒸发器中干 燥，将残留物保留并储存于-80℃。为了代谢组学分析，将该残留物溶 于100μl 95:5水/乙腈，并以14,000×g离心5分钟。收集澄清的上清 液以进行LC-MS分析。

使用ACQUITY TM UPLC系统(Waters Corp.,Milford,USA)且于 100毫米(mm)×2.1mm Acquity 1.7微米(μm)的C8柱上完成液相色谱分 离，将该柱维持于45℃以及流速0.5毫升/分钟(ml/min)。使用线性梯 度：0至2.5分钟:1至48％B；2.5至3分钟:48至98％B；3至4.2分钟: 98％B；4.3至6分钟:1％B，将样本自LC柱中洗脱(elute)，并用以重 新平衡。移动相为0.1％甲酸于水中(溶剂A)以及0.1％甲酸于乙腈中(溶 剂B)。

将该洗出液(eluent)导入TOG MS系统(SYNAPT G1高解析质谱仪, Waters Corp.,Milford,USA)，并于ESI正离子模式下操作，其条件如下： 去溶气体(desolvation gas)设定为700公升/小时(l/h)，温度300℃；锥孔 气体(cone gas)设定为25l/h，且来源温度设定为80℃；毛细管电压与 锥孔电压分别设定为3,000V与35V；MCP检测器电压设定为1,650 伏特(V)；数据取得率设定为0.1秒且内扫描延迟为0.02秒，该数据于 质心模式(centroid mode)下自20至990m/z下收集。为了取得准确的质 量，磺胺二甲氧嘧啶(sulfadimethoxine)的锁定质量(lock-mass)为浓度60 纳克(ng)/毫升(ng/ml)而流速为6μl/min(ESI正离子模式下，[M+H]⁺离 子为311.0814Da)。

使用MassLynx V4.1及MarkerLynx软件(Waters Corp.,Milford, USA)处理原始质谱数据。各质量离子的强度关于总离子数，其经标准 化以产生数据矩阵(data matrix)，该数据矩阵包括滞留时间、m/z值及 经标准化的峰面积。通过SIMCA-P软件(版本13.0,Umetrics AB,Umea, 瑞典)分析多变数数据矩阵，于使用帕雷托标度化(Pareto scaling)前先进 行OPLS-DA模式。将SIMCA-P用于多变数数据分析与表现。

接着将于两群组间显示显著差异的确切分子质量数据提交至数据 库中搜寻，使用内部数据库或线上数据库HMDB(http://www.hmdb.ca/) 及KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)。为了鉴定特定的代谢物，在与 进行谱型实验相同的条件下，将标准品进行UPLC-MS/MS分析。于每 秒0.1质谱及大约4m/z的中型隔离视窗下收集MS/MS质谱。碰撞能 设定为自5至35V。

根据包括KEGG与HMDB的数据库以MetaboAnalyst软件进行有 潜力的生物标记的构建、相互作用及途径分析，藉此辨识受影响的代 谢途径并将其视觉化。通过大量的分析来评估可能的生物性要素。

(2)血浆目标代谢物的定量(浓度测定)

目标代谢物分析以p180试剂盒(Biocrates Life  Science AG，Innsbruck，澳洲)来实施。该试剂盒用以辨识及定量184 种代谢物，这些代谢物涵盖五种代谢物种类，包括90种甘油磷脂 (glycerophospholipid)与15种鞘脂(sphingolipid)(76种磷脂酰胆碱、14 种溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine)及15种神经鞘磷脂 (sphingomyelin))、19种生物胺、40种酰基肉碱(acyl carnitine)、19种 氨基酸及六碳糖。于96孔盘中将每10μL的血浆样本与经同位素标定 的内标物混合，并在氮气流中干燥。以5％异硫氰酸苯酯 (phenylisothiocyanate,PITC)将氨基酸与生物胺衍生20分钟，随后于氮 气中干燥。加入300μL的萃取溶液(5mM乙酸胺于甲醇中)，反应30 分钟后将混合物以100×g离心2分钟。随后将滤液以150μL等分转 移至微孔盘中，再以150μL水稀释，藉此使用LC-MS/MS进行氨基酸 与生物胺分析。将残留的滤液与试剂盒的MS流动溶剂400μL混合， 并进行流动注射分析暨串联式质谱仪分析(flow injection analysis  coupled with tandem mass spectrometric analysis,FIA-MS/MS)。该分析以 正极及负极电喷洒离子化模式来进行。通过多反应监视(multiple  reaction monitoring,MRM)完成辨识与定量，并通过订定经同位素标定 的标准品而将之标准化。于LC-MS分析中，MS配合UPLC(Waters  Corp，Milford，USA)一起使用，而代谢物于反相柱(2.1mm×50mm， BEH C18，Waters Corp，Milford，USA)中分离。移动相由溶剂A(0.2％ 甲酸于水中)与溶剂B(0.2％甲酸于乙腈中)的梯度混合物所组成(0分钟 0％B，3.5分钟60％B，3.8分钟0％B，3.9分钟0％B)。以流速900 μL/min进行洗脱。柱温维持在50℃。FIA使用等强度法(isocratic  method)，以试剂盒的MS流动溶剂作为移动相，其具有不同的流动条 件(0min，30μL/min；1.6min，30μL/min；2.4min，200μL/min；2.8min， 200μL/min；3min，30μL/min)。所对应的MS如以下设定：暂留时间 0.019-0.25秒；3.92KV正电压模式；1.5KV负电压模式；氮气作为碰 撞气体介质；来源温度为150℃。用于LC-MS的参数为：暂留时间0.006 至0.128秒；来源温度为150℃；电压为3.20KV；氮气作为碰撞气体 介质。用于目标MS数据分析的数据输入与前处理步骤使用TargetLynx (Waters，MA，USA)完成。通过自动化的代谢产物浓度计算将整合的 MetIDQ软件(Biocrates，Innsbruck，澳洲)应用于流线型(streamline)数 据分析。

(3)血浆中对硫甲酚与硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate)的定量

血浆样本的制备是使用500μL甲醇(以40ng/ml d4-硫酸吲哚酚作 为内标准品)将蛋白质沉淀，接着于4℃以12,00×g离心10分钟。收 集上清液用于对硫甲酚与硫酸吲哚酚分析。于Xevo TQ MS Acquity  UPLC系统(Waters Corp，Milford，USA)中实施LC-MS/MS。于反相 Acquity UPLC BEH C18柱(1.7μm，100mm×2.1mm)中完成分离。 该柱维持于40℃，流速为0.5ml/min。将样本自LC柱中洗脱是使用线 性梯度：0至0.5分钟：10-20％B；0.5至3分钟：20至70％B；3至 3.5分钟：98％B；5.1至7分钟：10％B用于再平衡。移动相为水(溶 剂A)及甲醇(溶剂B)。串联式四极质谱法中的质谱离子化、分裂及获 得条件的优化使用负极模式的电喷洒离子化(electrospray ionization, ESI)。条件如下：去溶气体设定为1000l/h，温度500℃；锥孔气体设 定为30l/h，且来源温度设定为150℃。毛细管电压与锥孔电压分别设 定为800V与30V。质谱法操作于多反应监测(MRM)模式，暂留时间 及内扫描延迟时间分别为0.2秒及0.1秒。数据的收集与处理使用 Masslynx软件(版本4.0)。

(4)统计分析

该结果表示为连续变数的平均值±SD以及分类变数的数目(百分 比)。通过适当的两样品的t-tests、ANOVA及卡方检定(Chi-square)比 较数据。使用指定的软件来进行代谢物组学分析。为了最大化各组间 的代谢谱型的辨识差异，利用正交投影潜在结构判别分析(OPLS-DA) 模式，并以SIMCA-P(版本13.0,Umetrics AB,Umea,瑞典)来进行。计 算该模式中各变数的投影值中变数投影重要性(variable importance in  the projection,VIP)的值，以该值表示对该类别的贡献。较高的VIP值 表示对各组间的区分有较强的贡献。这些变数的VIP值大于1.0时被 认为具有显著性差异。代谢物组学以及HF的BNP的诊断值通过接受 者操作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线的曲线下面积 (area under the curve,AUC)表示。

依进度表或最后一个可取得的探访来收集后续数据。ROC曲线以 及Kaplan-Meier分析被用来测定第一个经定义的事件(死亡、或与HF 相关的再住院率)的预测器(predictor)。为了Kaplan-Meier分析，该截断 值(cutoff value)设定为各变数的平均值来获得对数等级(Log rank)的数 据。该AUC及对数等级的值被用来显示具有HF患者的代谢物组学的 预后及BNP。所有的统计分析以双尾及使用SPSS软件进行(版本15.0, SPSS,Chicago,IL,USA)。小于0.05的P值被认为具显著性。

实施例1：用以诊断及判断心脏衰竭期别的全代谢组学分析

1.各组病人的基本特性

本实施例总共招收234名个体，其包括51名正常个体以及183名 处于A期(n＝43)、B期(n＝67)及C期(n＝73)的患者，其基线特性与 实验室数据如表1所示。在大部份的变数中，可注意到自正常对照组 至A、B及C期患者间有显著的改变趋势。相较于正常对照组，处于 C期的患者的BNP含量明显较高，QRS波群则较宽，但总胆固醇、低 及高密度脂蛋白胆固醇(low and high density lipoprotein cholesterol)、 钠、血红素、白蛋白(albumin)及预估的肾小球过滤率(estimated  glomerular filtration rate)则较低。就年龄而言，各组病人之间虽然没有 显著的差异，但其年龄皆大于正常对照组。此外，患者中的男性比例 也较高。冠状动脉疾病是HF患者的主要病因。

2.心脏衰竭组与正常对照组中的全代谢物分析

于本实施例中所进行的全代谢物分析用以区分A、B及C期患者与正常 对照组。

在全代谢物分析中，OPLS-DA明显地区分了正常对照组与A、B及C 期患者(图1A)。比较正常对照组与A、B及C期患者，表2显示VIP得分>1.0 的代谢物。为了区分正常对照组与C期患者，使用所有全代谢组学数据组并 计算出全代谢组学衍生参数，称之为t[1](如x轴所示)；为了区分正常对照 组与A期患者，使用所有全代谢组学数据组并计算出全代谢组学衍生参数， 称之为t[0](如y轴所示)。于t[1]标尺中，A期患者的得分图集聚区相似于正 常对照组，然而相较于正常对照组于t[0]标尺中往上位移(图1A)。

依同样的全代谢组学衍生参数计算方式，计算出B期患者的t[1]与t[0] 值。B期患者的得分图广布的区域位于A期、C期及正常对照组间(图1B)。

3.辨识心脏衰竭中异常的代谢途径

不同种类的代谢物在心脏衰竭的不同期别会有所变化(表2)。这些代谢物 包括嘌呤、氨基酸、生物胺及磷脂质。相较于对照组，C期患者的精氨酸代 谢、尿素循环、嘌呤代谢及一氧化氮合成途径显著地受到影响。一些与精氨 酸代谢有关的代谢物(如谷氨酰胺及瓜氨酸)的含量在C期患者中较低；次黄 嘌呤、黄嘌呤、尿酸、谷氨酸、脯氨酸、鸟氨酸、精胺与亚精胺的含量在C 期患者中则上升；芳香氨基酸(如酪氨酸及苯丙氨酸)的含量在C期患者中较 高。此外，数种磷脂酰胆碱的含量降低，而牛磺酸的含量则增加。通过KEGG 及HMDB数据库，将从C期患者的全代谢物变化中所得的研究结果绘制成 生物化学途径(图2)。此研究结果可以显示尚未出现于HF临床表现时的代谢 物变化异常，并且提供更多有关疾病机制的资讯。

4.用以区分不同期别的HF患者与正常对照组的不同全代谢物组合

为了区分A期患者与正常个体，发现了一些良好的代谢物组合，如表3 所示。通过接受者操作特征(ROC)曲线分析这些组合的诊断值，并以曲线下 面积(AUC)呈现。这些代谢组学衍生参数的诊断值优于BNP。

表3、用以区分A期患者与正常个体的不同全代谢物组合

BNP：B型利尿胜肽；Met：甲硫氨酸；必需AA：必需氨基酸；PCaeC34:3： 酰基-烷基磷脂酰胆碱C34:3；C5:1：甲基巴豆酰肉碱(Tiglylcarnitine)；C3OH： 羟基丙酰肉碱；His：组氨酸；Pro：脯氨酸；Gln：谷氨酸；PCaeC34:2：酰 基-烷基磷脂酰胆碱C34:2；C3：丙酰肉碱；Tyr：酪氨酸；Phe：苯丙氨酸； Ile：异亮氨酸；C18:2：十八二烯基肉碱(Octadecadienylcarnitine)。

为了区分A期患者与C期患者，发现了一些良好的代谢物组合，如 表4所示。通过ROC曲线分析这些组合的诊断值，并以曲线下面积(AUC) 呈现。这些代谢组学衍生参数的诊断值优于BNP。

表4、用以区分A期患者与C期患者的不同全代谢物组合

BNP：B型利尿胜肽；费雪比率：支链氨基酸与芳香氨基酸的比率； PCaeC34:3：酰基-烷基磷脂酰胆碱C34:3；His：组氨酸；Phe：苯丙氨酸。

为了区分C期患者与正常个体，发现了一些良好的代谢物组合，如 表5所示。通过ROC曲线分析这些组合的诊断值，并以曲线下面积(AUC) 呈现。这些代谢组学衍生参数的诊断值与BNP相似。

表5、用以区分C期患者与正常个体的不同全代谢物组合

BNP：B型利尿胜肽；PCaaC34:4：二酰基磷脂酰胆碱C34:4；His： 组氨酸；Phe：苯丙氨酸。

为了区分B期患者与正常个体，发现了一些良好的代谢物组合，如 表6所示。通过ROC曲线分析这些组合的诊断值，并以曲线下面积(AUC) 呈现。这些代谢组学衍生参数的诊断值优于BNP。

表6、用以区分B期患者与正常个体的不同全代谢物组合

BNP：B型利尿胜肽；必需AA：必需氨基酸；PCaeC34:2：酰基-烷 基磷脂酰胆碱C34:2；C3：丙酰肉碱；His：组氨酸；Pro：脯氨酸；Glu： 谷氨酸盐；Tyr：酪氨酸；Phe：苯丙氨酸；C0：肉碱；总ACOH：总羟 基乙酰肉碱；总PCae：总磷脂酰胆碱；费雪比率：(亮氨酸+异亮氨酸+ 缬氨酸)/(苯丙氨酸+色氨酸+酪氨酸)；总AC：总乙酰肉碱。

为了区分B期患者与A期患者，发现了一些良好的代谢物组合，如 表7所示。通过ROC曲线分析这些组合的诊断值，并以曲线下面积(AUC) 呈现。这些代谢组学衍生参数的诊断值优于BNP。

表7、用以区分B期患者与A期患者的不同全代谢物组合

BNP：B型利尿胜肽；PCaaC34:4：二酰基磷脂酰胆碱C34:4；Ala： 丙氨酸；SDMA：对称性二甲基精氨酸；C5:1：甲基巴豆酰肉碱 (Tiglylcarnitine)；C3：丙酰肉碱。

为了区分B期患者与C期患者，发现了一些良好的代谢物组合，如 表8所示。通过ROC曲线分析这些组合的诊断值，并以曲线下面积(AUC) 呈现。这些代谢组学衍生参数的诊断值优于BNP。

表8、用以区分B期患者与C期患者的不同全代谢物组合

BNP：B型利尿胜肽；PCaaC34:4：二酰基磷脂酰胆碱C34:4； PCaeC34:2：酰基-烷基磷脂酰胆碱C34:2；His：组氨酸；SM C16:0：神 经鞘磷脂；C14:2：十四二烯酰基肉碱(Tetradecadienoylcarnitine)；费雪比 率：支链氨基酸与芳香氨基酸的比率。

5.在连续性评估中，用于急性HF状态到稳定状态患者的代谢组学

根据表5所描述的数据，试着检验组合四种代谢物(组氨酸、苯丙氨 酸、亚精胺及次黄嘌呤)的诊断值。计算该四种代谢物所衍生的参数称为 tPS[1]。为了此目的，进一步于32名(22名男性与10名女性，年龄为54 ±11岁)处于C期的患者一起进行代谢组分析与BNP测量。这些患者最 初因急性心因性肺水肿而住院，而后改善成NTHA功能分类级别I，且存 活长达1年以上。于出院前及出院后6个月与12个月时进行血浆分析， 呈现连续性变化的tPS[1]值。如图4所示，在32名患者中的出院前的tPS[1] 值显著高于正常对照组。虽然6个月时tPS[1]值明显降低，但于12个月 时，注意到在部分患者中tPS[1]值上升。相较于出院前，于6个月时的 BNP含量明显下降，而于12个月时的含量仍维持稳定。这些研究结果表 示在急性HF后的HF状态预估中，相较于BNP，代谢组学分析是较为灵 敏的工具。

实施例2：用以诊断及判断心脏衰竭期别的目标代谢组学分析

1.患者

本实施例总共招收145名个体，其中包括62名正常个体以及83名 处于C期的患者。

2.HF与正常对照组中的目标代谢组学分析

为了定量代谢物的浓度，本实施例使用Biocrates试剂盒，根据目标 代谢组学工作流程，进行血浆代谢组学分析，并且使用OPLS-DA模式进 行生物讯息数据组分析。为了测试目标代谢物谱型是否能够区分C期HF 患者与正常对照组，此分析总共使用201个变数。足以区分两组之间的 代谢物如表9所列(这些代谢物具有VIP得分>1.0)。

3.区分C期患者与正常对照组

为了区分C期患者与正常对照组(诊断值)，绘制BNP与t[2]两者的 ROC曲线(通过使用主成物分析，将所有的目标代谢物列入计算)(图4)， 两者的曲线下面积分别为0.998与1.0。在目标代谢组学数据组中，发现 对于HF的代谢组学诊断值有显著贡献的四种重要的代谢物，包括组氨 酸、苯丙氨酸、亚精胺及二酰基磷脂酰胆碱C34:4(表10)。该四种代谢 物的组合的曲线下面积达到0.995，其优于该四种代谢物单一的数值(图 4)。根据该四种代谢物的组合而产生的参数，称的为tPS[2]。用以辨别C 期HF(与正常对照组比较)的BNP与tPS[2]值的诊断值如表10所示。

表10、C期心脏衰竭患者中的BNP及目标代谢物的诊断值(与正常对照组比较)

BNP：B型利尿胜肽含量；PC aa：二酰基磷脂酰胆碱；t[2]为从所有 目标代谢物数据组所衍生的参数；tPS[2]为从四种代谢物(组氨酸、苯丙 氨酸、PC aa C34:4(二酰基磷脂酰胆碱C34:4)及亚精胺)所衍生的参数。

实施例3：用以评估心脏衰竭预后的目标代谢组学分析

1.代谢组学特征的预后值

为了评估代谢组学与BNP的预后值，以下的分析法针对B期及C期 患者。为了在全因死亡与HF相关的再住院率的复合事件中寻找有预测潜 力的代谢物(predictor)，于目标代谢物数据组中的广泛分析显示，四种 代谢物(二甲基精氨酸/精氨酸的比率、亚精胺、丁酰肉碱及必需氨基酸总 量)的组合产生明显优于BNP的理想的预后价值。通过组合该四种代谢物 所产生的参数，称为tPS[3]。tPS[3]、tPS[2](衍生自所有目标代谢物数据 组)及BNP含量的ROC曲线的AUC分别为0.853、0.792及0.744(图5A)。 表11显示这些参数对于预后的AUC数据(以ROC曲线)及对数等级(以 Kaplan-Meire分析法)。

tPS[3]的平均值(2.9，范围0.04-5.63)被设定为预后预测的截断值 (cutoff value)。在图4B中，Kaplan-Meire曲线表示出院前的tPS[3]≥2.9， 其与HF相关的再住院率与全因致死的复合事件率有关(对数等级＝17.5, p<0.0001)。相较之下，如图5C所示，BNP的预后值≥350皮克/毫升(pg/ml) (对数等级＝9.9,p＝0.002)。

表11、心脏衰竭患者中的BNP及目标代谢物的预后值

BNP呈现B型利尿胜肽含量；t[2]为从所有目标代谢组学分析衍生出 的参数；tPS[2]为从四种代谢物(组氨酸、苯丙氨酸、PC aa C34:4(二酰基 磷脂酰胆碱C34:4)及亚精胺)衍生出的参数；DMA呈现总二甲基精氨酸； 必需氨基酸包含苯丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸、色氨酸、异亮氨酸、亮氨 酸、甲硫氨酸、赖氨酸及组氨酸。

实施例4：用于心脏衰竭患者的全代谢组学分析的预后值

本实施例进行全代谢组学分析，总共招收157名处于B期(n＝81)及C 期(n＝76)的患者。使用全代谢组学分析以辨别不同的代谢物组合，该代谢 物组合对于预测死亡与心脏衰竭相关的再住院的复合事件具有良好的数 值。

对于代谢组学与BNP的预后值，根据AUC(衍生自ROC曲线)及对 数等级值(衍生自Kaplan-Meire分析)来预估，这些数据如表12所示。

1.比较BNP与不同的全代谢物组合的预后值：

(1).通过AUC(衍生自ROC曲线)：

最初发现结合四种代谢物的代谢组学的预后值优于BNP，这些代谢 物包括二甲基精氨酸/精氨酸、亚精胺、丁酰肉碱及必需氨基酸总量。

根据表12，二甲基精氨酸/精氨酸与丁酰肉碱的组合已优于BNP；二 甲基精氨酸/精氨酸、丁酰肉碱及亚精胺的组合已优于BNP；二甲基精氨 酸/精氨酸、丁酰肉碱及黄嘌呤的组合已优于BNP；二甲基精氨酸/精氨酸 及黄嘌呤的组合已优于BNP；二甲基精氨酸/精氨酸、黄嘌呤及色氨酸的 组合已优于BNP；二甲基精氨酸/精氨酸、黄嘌呤及亚精胺/精胺的组合已 优于BNP；单独黄嘌呤已优于BNP；SDMA(对称性二甲基精氨酸)/精氨 酸及黄嘌呤的组合已优于BNP；SDMA/精氨酸、黄嘌呤及色氨酸的组合 已优于BNP；SDMA/精氨酸、黄嘌呤及亚精胺/精胺的组合已优于BNP； 单独SDMA已优于BNP；单独SDMA/精氨酸已优于BNP；单独对硫甲 酚已优于BNP；SDMA及对硫甲酚的组合已优于BNP；SDMA、对硫甲 酚及二酰基磷脂酰胆碱C38:6的组合已优于BNP；SDMA、对硫甲酚及 丁酰肉碱的组合已优于BNP；SDMA、对硫甲酚及亚精胺的组合已优于 BNP；DMA/精氨酸及对硫甲酚的组合已优于BNP；DMA/精氨酸、对硫 甲酚及二酰基磷脂酰胆碱C38:6的组合已优于BNP；DMA/精氨酸、对硫 甲酚及丁酰肉碱的组合已优于BNP；DMA/精氨酸、对硫甲酚及亚精胺的 组合已优于BNP；二甲基精氨酸/精氨酸及亚精胺的组合已优于BNP； SDMA/精氨酸及亚精胺的组合已优于BNP；SDMA/精氨酸及丁酰肉碱的 组合已优于BNP；色氨酸及黄嘌呤的组合已优于BNP；色氨酸及亚精胺 的组合已优于BNP；色氨酸及丁酰肉碱的组合已优于BNP；亮氨酸及黄 嘌呤的组合已优于BNP；亮氨酸及亚精胺的组合已优于BNP；亮氨酸及 丁酰肉碱的组合已优于BNP；苏氨酸及黄嘌呤的组合已优于BNP；苏氨 酸及亚精胺的组合已优于BNP；苏氨酸及丁酰肉碱的组合已优于BNP。

然而，注意到仅有二甲基精氨酸/精氨酸比BNP差。

(2).通过对数等级值(衍生自Kaplan-Meire分析)：(截断值设定为各 参数的平均值)

最初发现结合四种代谢物的代谢组学的预后值优于BNP，这些代谢 物包括二甲基精氨酸/精氨酸、亚精胺、丁酰肉碱及必需氨基酸总量。

二甲基精氨酸/精氨酸与丁酰肉碱的组合已优于BNP；二甲基精氨酸 /精氨酸、丁酰肉碱及亚精胺的组合已优于BNP；二甲基精氨酸/精氨酸、 丁酰肉碱及黄嘌呤的组合已优于BNP；单独二甲基精氨酸/精氨酸仍然优 于BNP；二甲基精氨酸/精氨酸及黄嘌呤的组合已优于BNP；二甲基精氨 酸/精氨酸、黄嘌呤及色氨酸的组合已优于BNP；二甲基精氨酸/精氨酸、 黄嘌呤及亚精胺/精胺的组合已优于BNP；单独黄嘌呤已优于BNP；SDMA (对称性二甲基精氨酸)/精氨酸及黄嘌呤的组合已优于BNP；SDMA/精氨 酸、黄嘌呤及色氨酸的组合已优于BNP；SDMA/精氨酸、黄嘌呤及亚精 胺/精胺的组合已优于BNP；单独SDMA已优于BNP；单独SDMA/精氨 酸已优于BNP；单独对硫甲酚已优于BNP；SDMA及对硫甲酚的组合已 优于BNP；SDMA、对硫甲酚及二酰基磷脂酰胆碱C38:6的组合已优于 BNP；SDMA、对硫甲酚及丁酰肉碱的组合已优于BNP；SDMA、对硫甲 酚及亚精胺的组合已优于BNP；DMA/精氨酸及对硫甲酚的组合已优于 BNP；DMA/精氨酸、对硫甲酚及二酰基磷脂酰胆碱C38:6的组合已优于 BNP；DMA/精氨酸、对硫甲酚及丁酰肉碱的组合已优于BNP；DMA/精 氨酸、对硫甲酚及亚精胺的组合已优于BNP；二甲基精氨酸/精氨酸及亚 精胺的组合已优于BNP；SDMA/精氨酸及亚精胺的组合已优于BNP； SDMA/精氨酸及丁酰肉碱的组合已优于BNP；色氨酸及黄嘌呤的组合已 优于BNP；色氨酸及亚精胺的组合已优于BNP；色氨酸及丁酰肉碱的组 合已优于BNP；亮氨酸及黄嘌呤的组合已优于BNP；亮氨酸及亚精胺的 组合已优于BNP；亮氨酸及丁酰肉碱的组合已优于BNP；苏氨酸及黄嘌 呤的组合已优于BNP；苏氨酸及亚精胺的组合已优于BNP；苏氨酸及丁 酰肉碱的组合已优于BNP。

(3).以2或3个必需氨基酸取代总必需氨基酸

为了评估心脏衰竭的预后，当总必需氨基酸用于如上所述的代谢物 组合时，需注意总必需氨基酸(9种氨基酸)可通过使用3种具有相似预后 值的氨基酸(亮氨酸、苏氨酸及色氨酸)来取代。再者，需注意总必需氨基 酸(9种氨基酸)可通过使用具有相似预后值的2种氨基酸(亮氨酸及苏氨 酸，或亮氨酸及色氨酸)来取代(参见表12)。

表12、比较心脏衰竭患者中B型利尿胜肽与不同全代谢物组合的预后值

DMA：总二甲基精氨酸；SDMA：对称性二甲基精氨酸；PCaaC38:6： 二酰基磷脂酰胆碱C38:6。

实施例5：用于诊断心脏衰竭的试剂盒

1.样本萃取

(1).用于全代谢物分析的血浆样本的制备

于100μl血浆中添加400μl乙腈(ACN)，将该混合物震荡30秒，超 声波震荡15分钟，接着以10,000×g离心25分钟，收集上清液并放入分 离管，再一次萃取该小粒(pellets)，将等量体积的甲醇水溶液(1:1甲醇/ 水，体积比体积)加入该残留小粒中，将上清液震荡30秒，超声波震荡 15分钟，再次离心以去除沉淀物。将甲醇上清液与乙腈上清液两种水性 溶液收集在一起并于氮气蒸发器中干燥，将该残留物保存并储存于 -80℃。将该残留物回溶于100μl 95:5水/乙腈，并以14,000×g离心5分 钟，收集澄清的上清液以进行LC-MS分析。

(2).用于脂质分析的血浆样本的制备

为了萃取脂质，使用修饰过的Folch’s方法。简言之，将100μl血浆 移至玻璃管，加入6毫升的氯仿/甲醇(2:1，v/v)溶液及1.5ml的水。将该 样品震荡30秒4次，随后于4℃下以700×g离心30分钟。尽可能完全移 除上层相，下层相则超声波震荡10分钟。将样品于4℃下以700×g离心 10分钟，尽可能完全移除上层相，下层相则静置于4℃。取3毫升该样 本于氮气中干燥，接着储存于-80℃。于分析前，将样品溶于200μl 40％ 甲醇。

2.通过诊断装置进行代谢物辨识

(1).MS/MS分析

为了辨识目标代谢物的结构，于与谱型实验相同的色谱条件下操作 该标准品。MS及MS/MS分析以相同条件进行。于每秒0.1质谱及大约4 m/z的中型隔离视窗下收集MS及MS/MS质谱。碰撞能设定为5至35V。 于相似的色谱条件下，通过离子迁移质谱仪进一步验证数种代谢物。

(2).荧光光谱仪测定组氨酸(或其他代谢物，诸如黄嘌呤、亚精胺、 丙酰肉碱、丁酰肉碱、对硫甲酚及其组合)在血浆中的浓度的方法为：将 组氨酸(或其他代谢物，诸如黄嘌呤、亚精胺、丙酰肉碱、丁酰肉碱、对 硫甲酚及其组合)与邻苯二甲醛在碱中反应以形成荧光产物，将该荧光产 物使用荧光光谱仪测量。在使用的范围中，该方法为线性。

用于本文的诊断装置并不限于上述实施例。根据代谢物的本性，亦 可使用其他诊断装置，诸如生物晶片、ELISA、LC-MS等，来测量本文 欲辨识的代谢物。

代谢组学分析探究心脏衰竭患者中的全代谢物的异常。通过代谢组 学分析，本发明提供优于BNP及传统标志所能提供与心脏衰竭有关的资 讯。分析血浆中丰富的代谢物可用以探究无法从BNP含量异常中看出的 复杂的整体代谢波动，包括在HF病程期间的谷氨酸-鸟氨酸-脯氨酸、多 胺、嘌呤及牛磺酸合成途径的增加；一氧化氮、多巴胺及磷脂酰胆碱合 成途径的减少(参见图2)；以及尿素循环、生物蝶呤循环、MTA循环、 甲硫氨酸循环、鸟氨酸-脯氨酸-谷氨酸、多胺合成、多巴胺合成、甲基化 (肌酸酐及磷脂酰胆碱)、转硫化反应(牛磺酸)及嘌呤代谢中的变化。一些 代谢物(例如：嘌呤、组氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、精氨酸、精胺、亚精 胺、牛磺酸及磷脂酰胆碱)在血浆中的浓度于不同的心脏衰竭期别会有所 变化，这些代谢物的变化为有潜力的生物标记。

通过代谢组学分析，相较于ACC/AHA分类、BNP或其他传统标志 所能提供者，本发明提供更灵敏且更专一的心脏衰竭阶段代谢评估。本 发明提供的方法能够区分C期HF患者与健康个体、A期HF患者与健康 个体，以及C期HF患者与A期HF患者。相较于ACC/AFA分类方法， 本发明提供的方法能更科学性的区分不同HF期别的患者。

相较于BNP与传统标志所能提供者，本发明通过使用代谢组学分析 而辨识出新的生物标记(例如：黄嘌呤、亚精胺、丁酰肉碱、一些磷脂酰 胆碱及其他代谢物的组合)，藉此提供心脏衰竭患者更好的诊断值与预后 值。

本发明的有些实施例已于上文中详细描述，然而，本发明所属领域 技术人员可针对特定的实施例做出多种修改或变化而实质上不悖离本发 明的教示与优点。该修改与变化包含在本发明的精神与范围，如权利要 求书所陈明。