一种烟碱降解菌筛选培养基及其制备方法

摘要

本发明实施例提供了一种烟碱降解菌筛选培养基及其制备方法，涉及微生物培养技术领域，可以兼顾配方的广谱性和针对性；提高筛选烟碱降解菌资源的多样性，减少和降低不必要的重复筛选；提高烟碱降解菌稀有种类的出菌率，丰富实际生产和研究领域中对高效烟碱降解菌的需求资源。所述培养基包括：牛肉膏2g，酵母粉1g，吉兰糖胶3g，海藻糖0.5g，K

说明书

技术领域

本发明涉及微生物培养技术领域，尤其涉及一种烟碱降解菌筛选培养基及其制备方法。

背景技术

烟碱(Nicotine)，俗名尼古丁，是一种存在于茄科植物(茄属)中的生物碱，也是烟草的重要成分，占烟草生物碱的95％以上。人体长期过量摄入烟碱，会麻痹心脏、抑制中枢神经，大幅度提高患呼吸系统、心脑血管等方面疾病的几率。烤烟燃烧过程中由烟碱亚硝化产生的N-亚硝铵是一种强烈的致癌剂，对主动吸烟和被动吸烟者均具有极大的健康危害。因此，如何控制和降低烟叶中的烟碱含量，是烟草种植和卷烟生产企业共同面临的棘手问题，开展相关研究具有很强的现实意义。

通过微生物发酵的方法降低烤烟中的烟碱含量，逐渐得到国内烟草行业的重视，国外烟草行业很早就开始了运用微生物降解烟碱的研究与实践，并取得了一定的成效。目前，各类文献报道的烟碱降解菌筛选培养基配方基本相同，不同之处表现在相同组分的用量调整上。现有的培养基配方及其制备方法如下：酵母粉1g，K₂HPO₄ 13g，KH₂PO₄4g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，10ml微量元素(MgSO₄·7H₂O 1g，MnSO₄·H₂O0.4g，CaCl₂·2H₂O 0.2g，CuCl₂·2H₂O 0.2g，FeSO₄·7H₂O 0.02g，用0.1mol/LHCl定容至100ml)，琼脂粉20.00g，加蒸馏水至1000ml，自然pH。培养基121℃高压蒸汽灭菌20min，当温度降至60℃时，加入适量用0.22μm滤膜过滤的烟碱。

采用以上培养基配方虽然可以筛选烟碱降解菌，但存在的问题也较为突出，这些不足集中体现在：(1)不适合特殊类型土壤样品烟碱降解菌的筛选；(2)微量元素不平衡，客观性不强；(3)筛选出的烟碱降解菌多样性较差，难以筛出稀有菌资源。

发明内容

本发明的实施例提供一种烟碱降解菌筛选培养基及其制备方法，可以兼顾配方的广谱性和针对性；提高筛选烟碱降解菌资源的多样性，减少和降低不必要的重复筛选；提高烟碱降解菌稀有种类的出菌率，丰富实际生产和研究领域中对高效烟碱降解菌的需求资源。

为达到上述目的，本发明的实施例采用如下技术方案：

一种烟碱降解菌筛选培养基，包括：牛肉膏2g，酵母粉1g，吉兰糖胶3g，海藻糖0.5g，K₂HPO₄ 13g，KH₂PO₄ 4g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，NaCl 5g，CaCl₂ 0.5g，样品环境土壤浸出液600ml，烟碱1g，琼脂粉18g，蒸馏水定容至1000ml，自然pH。

一种烟碱降解菌筛选培养基的制备方法，包括：

A.样品环境土壤浸出液的制备：取采样环境的土壤500g，置于大三角瓶中，加入无菌水900ml，180r/min，室温震荡30min，静置沉淀，取上清；再将上清于121℃高压蒸汽灭菌20min，即得所述样品环境土壤浸出液，4℃保存备用；

B.称取海藻糖0.5g，置于三角瓶，加100ml蒸馏水，于0.06MPa，112.6℃条件下高压蒸汽灭菌15min，即得海藻糖溶液，放入60℃条件恒温箱中保存备用；

C.称取吉兰糖胶3g，用制得的土壤浸出液600ml缓慢溶解，再依次加入K₂HPO₄ 13g，KH₂PO₄ 4g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，NaCl 5g，CaCl₂0.5g，牛肉膏2g，酵母粉1g和琼脂粉18g，用蒸馏水定容至900ml，搅拌均匀后转入三角瓶，121℃条件下高压蒸汽灭菌20min；当冷却至60℃左右时，以无菌操作手续加入灭菌的海藻糖溶液100ml；

D.用0.22μm滤膜规格的针头过滤器加入烟碱1g，同方向轻柔转动混匀，即得烟碱降解菌筛选培养基。

上述技术方案，对培养基配方进行了探索，在使用酵母粉的基础上，进一步补充了一定量的牛肉膏，旨在进一步提高对细菌资源的广谱性；配方中还特别添加了吉兰糖胶(gellan gum)和海藻糖两种核心成分，吉兰糖胶是一种由Paeudomonas elodea产生的多糖，有刺激细胞生长的作用，而号称“生命之糖”的海藻糖，具有提高生物的耐受性和新陈代谢活力作用，加入海藻糖后，能够提高土壤样品中微生物的代谢活性，在一定程度上防止和缓解弱势菌株的死亡率，进而提高目的菌株的出菌率。

在培养基配方中，用样品环境土壤浸出液取代了传统的人工配制的微量元素混合容易，因为绝大部分有关烟碱降解菌筛选文献中所采用的微量元素混合液仅包括MnSO₄·H₂O 0.4g，CaCl₂·2H₂O 0.2g，CuCl₂·2H₂O 0.2g，FeSO₄·7H₂O 0.02g等少量几种成分，具有明显的主观性和不平衡性，与微生物栖息的土壤环境差异较大。而样品环境土壤浸出液最大限度的接近了客观情况，尤其是微量元素的完整性和离子环境的平衡性，对提高微生物的生理活性和存活几率起着积极作用，能更好的保持土壤样品中客观存在的种群多样性特征。

自然土壤环境和人工配制的培养基之间的渗透压不可能达到百分之百的吻合，而渗透压又是生物良好生长不可或缺的生理条件之一，所以，培养基中添加了一定量的氯化钠，旨在调节和缓冲渗透压变化。钙离子在生物的新陈代谢过程中也起着很重要的作用，尤其在生物的信号转导、生物膜透性、细胞组织液平衡等方面，培养集中氯化钙的加入，有利于一些非常见菌的筛出。

通过反复优化，本发明提供的技术方案中，对培养基各种成分剂量的使用都进行了量化，这也是实现有益效果不可或缺的一部分。

附图说明

图1为应用本发明实施例提供的一种烟碱降解菌筛选培养基进行菌落培养的培养效果示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例提供了一种烟碱降解菌筛选培养基，包括：牛肉膏2g，酵母粉1g，吉兰糖胶3g，海藻糖0.5g，K₂HPO₄ 13g，KH₂PO 4g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，NaCl 5g，CaCl₂ 0.5g，样品环境土壤浸出液600ml，烟碱1g，琼脂粉18g，蒸馏水定容至1000ml，自然pH。

可选的，本发明实施例提供的烟碱降解菌筛选培养基的配方具体可以是：牛肉膏2g(01-009，北京奥博星生物技术有限公司)，酵母粉1g(G0961，生工生物工程(上海)有限公司)，吉兰糖胶5g(EZ0001，上海伊卡生物技术有限公司)，海藻糖0.5g(TB0966，生工生物工程(上海)有限公司)，K₂HPO₄ 13g(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)，KH₂PO₄ 4g(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)，(NH₄)₂SO₄ 0.5g(分析纯，西陇化工)，NaCl 5g(分析纯，西陇化工)，CaCl₂ 0.5g(分析纯，西陇化工)，样品环境土壤浸出液500ml(采样环境土壤是指具体实验采样点周围的土壤或与样品背景条件相一致的土壤)，烟碱1g(纯度≥98％，陕西天则生物技术有限责任公司)，琼脂粉18g(01-023，北京奥博星生物技术有限公司)，蒸馏水定容至1000ml，自然pH。

本发明实施例还提供了一种烟碱降解菌筛选培养基的制备方法，包括以下步骤：

A.样品环境土壤浸出液的制备：取采样环境土壤500g，置于大三角瓶中，加入无菌水900ml，180r/min，室温震荡30min，静置沉淀，取上清；再将上清于121℃高压蒸汽灭菌20min，即得所述样品环境土壤浸出液，4℃保存备用。

所述采样环境土壤是指具体实验采样点周围的土壤或与样品背景条件相一致的土壤，其中，这里所说的“具体实验”是指做实验的人所进行的从不同土壤样品中筛选目的菌株的实验。不同人做的实验所用的样品肯定不一样，如大田土壤样品、河底淤泥、不同作物的根际土壤、森林土等等。与样品背景条件相一致的土壤是指采样点周围的土壤或者与采样点土壤自然条件相一致的土壤，这里的背景条件主要指：营养状况、水分、pH、田间管理等等。

B.称取海藻糖0.5g，置于三角瓶，加100ml蒸馏水，于0.06MPa，112.6℃条件下高压蒸汽灭菌15min，即得海藻糖溶液，放入60℃条件恒温箱中保存备用。

C.称取吉兰糖胶3g，用制得的土壤浸出液600ml缓慢溶解，再依次加入K₂HPO₄ 13g，KH₂PO₄ 4g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，NaCl 5g，CaCl₂0.5g，牛肉膏2g，酵母粉1g和琼脂粉18g，用蒸馏水定容至900ml，搅拌均匀后转入三角瓶，121℃条件下高压蒸汽灭菌20min；当冷却至60℃左右时，以无菌操作手续加入灭菌的海藻糖溶液100ml。

D.用0.22μm滤膜规格的针头过滤器加入烟碱1g，同方向轻柔转动混匀，即得烟碱降解菌筛选培养基。

使用传统配方和本发明实施例提供的方法各自对同一环境的6份土壤样品进行了对比实验(实验结果见表1和表2)，由表1和表2的试验结果可以看出，本发明实施例提供的方法获得的菌落总数，鉴定出的菌株数以及具烟碱降解能力菌株数都明显高于传统配方的结果。应用本发明实施例提供的培养基获得的样品，每份样品重复3次，6份土壤样品按照相同的传统稀释涂板方法进行，同时划线纯化菌落特征具有显著差异单菌落，并保种；采用菌落特征、生理生化指标测定和16S rRNA序列比对相结合的方法，对获得的菌种进行鉴定。结果显示，菌落在所发明的培养基上生长良好，数量多，长势好，可重复性强(图1)。鉴定出的种类丰富，鉴定的菌属名录为：微小杆菌(Exiguobacteriumacetylicum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、节杆菌属(Arthrobacter sp.)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)、阴沟杆菌(Enterobacter cloacae)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)、栖木假单胞菌(Pseudomonas hibiscicola)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、不动杆菌属(Acinetobacter)、耐铬酸冢村菌(Tsukamurellatyrosinosolvens)、克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)。在现有技术的文献报道中，筛选出的烟碱降解菌主要有球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)、烟草节杆菌(Arthrobacter nicotianae)、争论产碱菌(Alcaligenesparadoxus)、氧化节杆菌(Arthrobacter oxydans)、纤维单胞菌(Cellulomonas sp.)、噬烟碱节杆菌(Arthrobacternicotinovorans)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、中间苍白杆菌属(Ochrobactrum intermedium)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)。未见使用一种培养基能同时筛选鉴定出本发明技术方案所能达到的效果，如使用本发明技术方案筛选出的栖木假单胞菌(Pseudomonas hibiscicolo)和耐铬酸冢村菌(Tsukamurellatyrosinosolvens)在烟碱降解菌筛选的文献报道中未有涉及。

以上结果说明本发明技术在土壤烟碱菌筛选中优势明显，具有较好的推广和应用价值。

表1本发明技术筛选结果

表2传统配方筛选结果

表1和表2中菌落总数为传统土壤样品细菌培养梯度稀释方法中10^-3的三次重复的平均值，同行数据后标有相同字母表示差异不显著(P＞0.05)。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。