具有生物防治作用的勐海产气霉

摘要

本发明公开了1株对多种植物病原微生物和人体病原微生物具有抑制作用的产气霉属真菌，它是勐海产气霉(Musodormenghaiensis)；它能用于植物病原微生物和人类生活环境病原微生物的生物防治，具有开发利用的价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地说是涉及1株产气霉属真菌：勐海产气霉，它能 够抑制植物病原微生物和人体病原微生物，对于植物病原微生物和人类生活环境病原微生物 具有生物防治作用。

发明背景

内生真菌(Endophytic fungi)是指那些在其生活史的部分或全部阶段能在健康植物组织 内部定植，且不会对宿主植物造成明显伤害的一类真菌。宿主植物与内生真菌在长期的协同 进化过程中形成了互惠互利的共生关系。植物可为内生真菌提供生存空间、水分和其他营养 成分，保护其不受外界环境的影响而在植物体内生存繁衍；另一方面，内生真菌也能够产生 一些促进植物生长发育、提高植物抗胁迫能力的次生代谢产物，包括激素、酶、抗生素及其 它杀虫抑菌物质。这些发现使得内生真菌在生物活性物质筛选的研究领域中显示出巨大的应 用潜力，逐渐成为国内外研究的热点之一。

目前，对于农业生产中的植物病原菌、建筑材料的霉变和人类生存环境的病原菌的防治， 人们主要依靠人工合成的化学药剂，但是，这些化学成分大多数具有致癌性，且不易降解， 对人类和动物及环境均具有很大的毒性。因此，这一类化学药剂产品将会逐渐被限制。在这 种情况下，新型环保的生物杀菌剂的开发和利用显得尤为迫切。

产气霉属(Muscodor)真菌属于子囊菌纲炭角菌目，该属物种的显著特征是能够产生一 系列挥发性气体化合物^[1]。经实验证明，这些挥发性物质形成的混合气体可以有效地抑制植 物病原菌及人类病原微生物。这一生物学特性使得产气霉属真菌在土传病害等方面具有很好 的应用前景。2002年，美国AgreQuest公司以白色产气霉(M albus)为基础，首家推出世界 上第一种可以替代传统剧毒土壤熏蒸剂溴代甲烷(已被禁用)的真菌熏蒸剂。这种真菌熏蒸 剂也可以有效地防治引发“病房综合征”的病原霉菌和细菌。目前全世界已报道8个产气霉属 物种[^1-8]。本专利采用组织块分离法，从兰科植物中分离得到一株产气霉属真菌，综合形态鉴 定、分子鉴定和化学分析的结果，这株真菌为产气霉属的新物种，命名为：勐海产气霉(M menghaiensis X.M.Tan et S.X.Guo)。培养皿对峙实验证明，该真菌产生的气体混合物对终极 腐霉、金黄色葡萄球菌、新型隐球酵母等多种植物病原微生物和人体病原微生物具有强烈的 抑制和杀灭作用，显示它具有开发为杀菌剂的巨大潜力。

发明内容

本发明的目的为提供一株产气霉属(Muscodor)真菌：勐海产气霉；它可以应用于多种 病原真菌和细菌的生物防治。

本发明采取如下技术方案实现：

勐海产气霉(M menghaiensis X.M.Tan et S.X.Guo)于2012年7月17日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.6378。保藏单位地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。菌株的保藏和存活证明见附 件。

勐海产气霉的培养特性如下：

PDA培养基上菌落白色，背面无色，生长缓慢，25℃暗培养2周菌落直径43-48mm，边 缘不规则，呈花瓣状，气生菌丝毛状，较发达，产生特殊的气味；菌丝透明，壁薄，具有横 膈膜，直径1.4-3.6μm，常呈90°分枝，缠结在一起形成“绳索链”(rope-like strands)及网状 结构，有些菌丝形成菌丝圈结构，菌丝圈直径20-40μm，部分菌丝中间膨大形成不规则块状 的菌丝细胞；菌丝体不育，未见无性或有性孢子，及产孢结构。

勐海产气霉的核糖体脱氧核糖核酸内转录间隔区(ITS-rDNA)序列(6378-1)、核糖核 酸聚合酶II亚基(RPB2)序列(6378-2)、β-微管蛋白(β-tublin)序列(6378-3)和核糖体脱 氧核糖核酸大亚基(28S)序列(6378-4)如序列表所示。

①勐海产气霉与产气霉属菌株M25(Genbank accession HM595539)和M yucatanensis (Genbank accession FJ917287)相似性分别为99％和98％。以Agaricus bisporus为外类群，基于 产气霉属和炭角菌科其他相关属真菌的ITS序列构建NJ系统进化发育树。在这个树形图中， 产气霉属真菌被分为5个分支，勐海产气霉与菌株M25聚类在分支C中，支持强度88％； M yucatanensis聚类在分支D中。

②勐海产气霉与产气霉属菌株M25(Genbank accession HM595623)的RPB2序列相似性 为86％，与白色产气霉菌株S13-1-2(Genbank accession GQ241929)的RPB2序列相似性为 99％。以Agaricus bisporus为外类群，基于产气霉属和炭角菌科其他相关属真菌的RPB2序列 构建NJ系统进化发育树。在这个树形图中，产气霉属真菌被分为3个分支，勐海产气霉、勐 养产气霉菌株CGMCC No.3672与白色产气霉菌株S13-1-2和B-23(Genbank accession  FJ480345)聚类在分支C中，支持强度100％；菌株M25聚类在分支B中。

③勐海产气霉与产气霉属菌株S18-3-1(Genbank accession HM034846)和白色产气霉菌 株9_-6(Genbank accession HM034844)的β-tublin基因序列相似性分别为90％和82％。以 Sordariafimicola为外类群，基于产气霉属和炭角菌科其他相关属真菌的β-tublin序列构建NJ 系统进化发育树。在这个树形图中，产气霉属真菌被分为3个分支，勐海产气霉、麻栗坡产 气霉菌株CGMCC No.3671和菌株S18-3-1聚类在分支A中，支持强度79％；白色产气霉菌 株9-6聚类在分支B中。

④勐海产气霉与白色产气霉菌株9-6(Genbank accession HM034865)的28S序列存在3 个碱基的差异，相似性99％。以Taphrina deformans和Taphrina sp.为外类群，基于产气霉属 和炭角菌科其他相关属真菌的28S序列构建NJ系统进化发育树。在这个树形图中，产气霉 属真菌被分为3个分支，勐海产气霉、麻栗坡产气霉菌株CGMCC No.3671和白色产气霉菌 株9-6聚类在分支A中，支持强度99％。

在形态学上，勐海产气霉部分菌丝中间膨大形成不规则块状的菌丝细胞，己报道的产气 霉属其他物种都不具有这一特点[^1-8]。分析勐海产气霉释放的挥发性气体的化学成分，其中主 要含有3-Cyclohexene-1-carboxaldehyde，4-(4-methyl-3-pentenyl)-和Methoxyacetic acid，3-tridecyl ester， 不能检测到萘及其衍生物。

综合形态鉴定、分子鉴定和化学分析的结果，勐海产气霉是产气霉属的一个新物种，命 名为M menghaiensis X.M.Tan et S.X.Guo，模式菌株为CGMCC No.6378。

勐海产气霉产生的挥发性气体是有效的混合杀菌剂，能抑制或杀灭多种病原细菌和真菌， 如：金黄色葡萄球菌Staphy loccocus aureus、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、新型隐球酵母 Cryptococcus neoformans、烟曲霉Aspergillusfumigatu、终极腐霉Pythium ultimum、灰葡萄孢 Botrytis cinerea、腐皮镰孢Fusarium solani、锈腐柱孢Cylindrocarpon distructans。它能用于对 植物病原微生物和人类生活环境病原微生物的生物防治。

附图说明

图1：基于ITS-rDNA序列构建的NJ(Neighbor-Joining)系统发育进化树，显示勐海产 气霉与同属真菌及炭角菌目其他类群的亲缘关系。

图2：基于RPB2基因序列构建的NJ系统发育进化树，显示勐海产气霉与同属真菌及炭 角菌目其他类群的亲缘关系。

图3：基于β-微管蛋白(β-tublin)基因序列构建的NJ系统发育进化树，显示勐海产气霉 与同属真菌及炭角菌目其他类群的亲缘关系。

图4：基于28S基因序列构建的NJ系统发育进化树，显示勐海产气霉与同属真菌及炭角 菌目其他类群的亲缘关系。

具体实施方式

实施例1.勐海产气霉的形态学鉴定

在PDA培养基上，CGMCC No.6378菌落白色，背面无色，生长缓慢，25℃暗培养2周 菌落直径43-48mm，边缘不规则，呈花瓣状，气生菌丝毛状，较发达，产生特殊的气味；菌 丝透明，壁薄，具有横膈膜，直径1.4-3.6μm，常呈90°分枝，缠结在一起形成“绳索链”(rope-like  strands)及网状结构，有些菌丝形成菌丝圈结构，菌丝圈直径20-40μm，部分菌丝中间膨大 形成不规则块状的菌丝细胞；菌丝体不育，未见无性或有性孢子，及产孢结构。

菌株CGMCC No.6378部分菌丝中间膨大形成不规则块状的菌丝细胞，己报道的产气霉 属其他物种均不具有这一特点[^1-81。

实施例2.勐海产气霉的分子生物学鉴定

将真菌接种到PDA培养基上，在暗室内25℃培养2周后提取DNA。DNA提取方法参 照真菌DNA提取试剂盒的使用指南进行(E.Z.N.ATM Fungal DNA Kit，Omega Bio-Tek， Doraville，Georgia，USA)。

核糖体脱氧核糖核酸内转录间隔区(ITS-rDNA)的扩增采用真菌通用引物ITS1

(5′_-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。50μL PCR扩增反应体系：Mix25μL，引物各2μL(5μM)，模板2-10μL，ddH₂O补足50μL。PCR 扩增反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火25s，72℃延伸30s，共35个循 环后，72℃C再延伸7min，暂时4℃C保存；如保存时间在2天以上，-20℃C保存。PCR扩增产物 经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下观察，有条带的PCR产物进行测序。测序所用引 物与扩增反应的相同。

核糖核酸聚合酶II亚基(RPB₂)的扩增采用引物RPB2-5f(5′-GAYGAYMGWGATCAYTTY GG-3′)和RPB2-7cr(5′-CCCATRGCTTGYTTRCCCAT-3′)。50μL PCR扩增反应体系：Mix25μL， 引物各2μL(5μM)，模板2-10μL，ddH₂O补足50μL。PCR扩增反应条件：95℃预变性5min， 95℃变性60s，55℃退火120s，72℃延伸1.5min，共35个循环后，72℃再延伸10min，暂时 4℃保存；如保存时间在2天以上，-20℃保存。PCR扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测， 在紫外灯下观察，有条带的PCR产物进行测序。测序所用引物与扩增反应的相同。

β-微管蛋白(β-tublin)的扩增采用bena-T1(5′-AACATGCGTGAGATTG TAAGT-3′)和 bena-T22(5′-TCTGGATGTTGTTGGGAATCC-3′)。50μL PCR扩增反应体系：Mix25μL，引 物各2μL(5μM)，模板2-10μL，ddH₂O补足50μL。PCR扩增反应条件：94℃预变性3min， 94℃变性30s，53℃退火50s，72℃延伸1.5min，共35个循环后，72℃再延伸10min，暂时4℃ 保存；如保存时间在2天以上，-20℃保存。PCR扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，在 紫外灯下观察，有条带的PCR产物进行测序。测序所用引物与扩增反应的相同。

核糖体脱氧核糖核酸大亚基(28S)的扩增采用引物LR7(5′-TACTACCACCAAGATCT-3′) 和LROR(5′-ACCCGCTGAACTTAAGC-3′)。50μL PCR扩增反应体系：Mix25μL，引物各2μL (5μM)，模板2-10μL，ddH₂O补足50μL。PCR扩增反应条件：95℃预变性3min，95℃变性 45s，53℃退火45s，72℃延伸30s，共30个循环后，72℃再延伸7min，暂时4℃保存；如保 存时间在2天以上，-20℃保存。PCR扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下观 察，有条带的PCR产物进行测序。测序所用引物与扩增反应的相同。

菌株CGMCC No.6378的ITS-rDNA、RPB₂、β-tublin和28S基因序列见序列表，序列编 号分别为SEQ6378-1，SEQ6378-2，SEQ6378-3和SEQ6378-4。

BLASTn搜索结果表明，菌株CGMCC No.6378与产气霉属菌株M25的ITS序列和RPB2 序列的相似性均为86％，与M yucatanensis的ITS序列相似性98％，与白色产气霉菌株S13-1-2 的RPB2序列相似性99％，与白色产气霉菌株9-6的β-tublin序列和28S序列的相似性分别为 82％和99％，与菌株S18-3-1的β-tublin序列的相似性为90％。

以Agaricus bisporus为外类群，基于产气霉属和炭角菌科其他相关属真菌的ITS序列构 建NJ系统进化发育树状图(图1)。在这个树状图中，菌株CGMCC No.6378与菌株M25聚 类在支持强度为88％的分支C中。

以Agaricus bisporus为外类群，基于产气霉属和炭角菌科其他相关属真菌的RPB2序列 构建的NJ系统进化发育树状图(图2)中，菌株CGMCC No.6378与勐养产气霉菌株CGMCC  No.6372、白色产气霉菌株S13-1-2和B-23聚类在分支强度为100％的分支C中。

以Sordariafimicola为外类群，基于产气霉属和炭角菌科其他相关属真菌的β-tublin序列 构建的NJ系统进化发育树状图(图3)中，菌株CGMCC No.6378与麻栗坡产气霉菌株CGMCC  No.6371、菌株S18-3-1聚类在分支强度为79％的分支A中。

以Taphrinadeformans和Taphrina sp.为外类群，基于产气霉属和炭角菌科其他相关属真 菌的28S序列构建的NJ系统进化发育树(图4)中，菌株CGMCC No.6378与麻栗坡产气霉 菌株CGMCC No.6371、白色产气霉菌株9-6聚类在支持强度为99％的分支A中。

综合多基因序列片段的比对和构建系统发育树状图的结果，菌株CGMCC No.6378与麻 栗坡产气霉菌株CGMCC No.6371和白色产气霉的同源性较高。但在形态上，麻栗坡产气霉 菌株CGMCC No.6371的部分菌丝中间膨大形成具有“8”字形结构的菌丝细胞，白色产气霉 不具有菌丝膨大的特点。因此，菌株CGMCC No.6378是产气霉属的一个新物种，命名为勐 海产气霉(Muscodor menghaiensis X.M.Tan et S.X.Guo)。

实施例3.勐海产气霉的抑菌谱测试及分析

供试菌为勐海产气霉。指示菌包括：①3种人体病原细菌：大肠杆菌(Escherichia coli)、 金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；②2种人体病原酵母 菌：白色念珠菌(Canidia albicans)、新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)；③6种植物病原 真菌：烟曲霉(Aspergillusfumigatu)、终极腐霉(Pythium ultimum)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、 立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、诱腐柱孢(Cylindrocarpon distructans)。

将新鲜的PDA倒入一次性分隔塑料培养皿(two-section Petri dish)中，在其中一侧接入一 块直径为5mm的供试菌菌块，25℃暗培养7天后，在分隔塑料培养皿的另一侧接种指示菌。 指示菌的类型不同，接种方法会有差别。对细菌和酵母菌，采用划线接种的方法；对其它指 示菌，接种相同直径大小的菌块。每个处理重复3皿，以不加供试菌菌块的处理为空白对照。 25℃暗培养3天后观察并记录实验结果。细菌和酵母菌的抗菌活性通过与空白对照比较得出 的百分比进行估算；对其它指示菌，用游标卡尺测量供试菌处理组和空白对照组中指示菌的 菌落直径。测量完成后，将指示菌菌块转接到新的PDA培养基上，观察指示菌的存活能力^[1，3]。 研究结果见表1。

研究结果表明：在供试的11种病原微生物中，勐海产气霉产生的挥发性气体物质对其中 的8种病原微生物具有不同程度的抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌、新型隐球酵母和终极 腐霉具有完全杀灭的作用，但对大肠杆菌、白色念珠菌和立枯丝核菌没有抑制作用。

表1勐海产气霉产生的挥发性气体对指示菌生长的影响

指示菌 抑制率(％) 24小时存活能力 48小时存活能力 大肠杆菌 0 +^a)+ 金黄色葡萄球菌 100±0 _^b) - 枯草芽孢杆菌 30.7+3.6 + - 白色念珠菌 0 + + 新型隐球酵母 100±0 - - 烟曲霉 100±0 + + 终极腐霉 100±0 - - 灰葡萄孢 100±0 + + 立枯丝核菌 0 + + 腐皮镰孢 32.9±14.3 + + 锈腐柱孢 100±0 + -

a)：指示菌存活；b)：指示菌未存活.

实施例4.勐海产气霉产生的挥发性气体物质分析

勐海产气霉在PDA培养基上培养10天，分别收集挥发性气体成分，用于气-质联用 (GC-MS)分析^[1]。以不接菌的PDA培养基为对照。将测量对照得到的峰形图从测量产气霉 的峰形图中扣除，即为产气霉菌株产生的挥发性成分。

GC-MS测试分析的结果表明，勐海产气霉产生的挥发性气体的化学成分较少，且相对较 单一，3-Cyclohexene-1-carboxaldehyde，4-(4-methyl-3-pentenyl)-和Methoxyacetic acid，3-tridecyl  ester是其中的主要成分，没有检测到萘及其衍生物(表2)。根据文献报道，产气霉属模式种 白色产气霉(M albus)产生的挥发性气体中含有萘衍生物^[1]。这一差别从化学成分的方面证 明了勐海产气霉与白色产气霉不是同一个物种。

表2勐海产气霉产生的挥发性气体成分

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