葡萄糖氧化酶介导自由基引发体系及其制备水凝胶的方法

摘要

本发明涉及葡萄糖氧化酶介导自由基引发体系及其制备水凝胶的方法，引发体系由N-羟基酰亚胺衍生物、葡萄糖氧化酶和葡萄糖组成，具有引发条件温和、配制简便、反应介质的pH值适用范围较宽、环境友好的优势。本发明制备方法通过调节反应介质的pH值，或调节三元引发体系的组分浓度比例，可以控制在室温下3～30min内引发单体聚合制备水凝胶，并可用于制备高强度的纳米复合水凝胶，在药物控制释放、酶固定化、组织工程、物质分离等领域具有明显的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及高分子化合物领域，尤其是涉及一种新型葡萄糖氧化酶介导的自由基聚合引发体系，及其用于制备水凝胶的方法。

背景技术

高分子化合物在材料领域发挥着重要作用，并广泛应用于工业、农业、生物医学、环境保护、民用生活等式个领域。常见的高分子合成反应通常需要控制温度和压力，对反应设备要求较高，有时还需使用有毒的催化剂。随着人类社会可持续发展意识的增强，采用高效、对人类无毒、对环境无公害的合成方法制备所需的高分子制品是高分子合成化学研究的方向。

生物酶是一种由活细胞产生的具有催化功能、活性可调的蛋白质，具有以下特性:高催化效率;高度选择性;立体专一性。酶催化反应的条件温和(一般在常温、常压下)，并且不需要使用大量价格较高且有毒的有机溶剂，可以在水溶液中进行。在节能减排为主旋律的今天，水作为一种价格低廉、环保、传热效率高的反应介质，对简化工艺流程、降低成本、节能降耗等具有重要意义。因此，与需要苛刻反应条件的传统化学合成方法相比较，生物酶介导的聚合反应是一种环境友好的制备高分子材料的优越方法。目前，酶介导的聚合反应研究主要集中在缩聚反应(如在木聚糖酶作用下β-木二糖通过转糖苷作用进行缩聚生成木聚糖)和开环聚合反应(如在猪胰脂肪酶作用下ε-己内酯开环聚合生成聚己内酯)等，而对于酶介导的自由基聚合反应研究较少。

氧化还原酶可以催化电子转移反应产生自由基，在水溶液中引发烯类单体的聚合。文献报道，辣根过氧化物酶(EC1.11.1.7)/β-二酮/过氧化氢三元酶促体系能引发亲水性乙烯基单体(如丙烯酰胺)进行自由基聚合，或引发疏水性单体(如苯乙烯)进行细乳液聚合(Polym.Chem.，2012,3,900-906;Biom6crimolecules，2006,7,2927-2930;Chem.Rev，2001,101,3793-3818)。然而，该反应中会出现不可重现的、时间较长(45～360min)的诱导期，且辣根过氧化物酶的价格相对较贵，不利于实际应用。作加一种广泛分布于动植物和微生物体内、价格相对较低的需氧脱氢酶，葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase，EC1.1.3.4)已广泛应用于食品、饲料、医药、分析检测等行业中。它可以在室温下特异性地催化β-D-葡萄糖氧化为葡糖酸内酯，同时还原氧气生成过氧化氢。

文献报道了一种采用葡萄糖氧化酶介导的氧化还原引发体系在室温下引发水溶性丙烯酸酯类单体及交联剂进行自出基聚合制备水凝胶的方法(Chem.Mater.2013,25,761-767;ACSAppl.Mater.Interf.，2010,2,1963-1972;Biomacromolecules，2009,10,3114-3121)。该引发体系的组分包括:硫酸亚铁(提供二价铁离子)、葡萄糖氧化酶和葡萄糖。其引发机理为:在体系中溶解氧的存在下，葡萄糖氧化酶催化葡葡糖的氧化;生成的过氧化氢与二价铁离子通过Fenton反应产生羟基自由基(·OH)，从而引发单体进行聚合得到水凝胶。上述文献同时也指出，在反应体系中引入二价铁离子既会产生羟基自由基引发单体聚合，也会消耗一部分引发自由基，对聚合反应产生抑制作用。同时，体系中的二价铁离子被氧化生成三价铁离子后，也会抑制单体自由基的链增长过程，导致单体聚合不完全，从而影响所制备水凝胶的后续应用。并且，由于二价铁离子的还原性较强，在空气中极易氧化，因此作为引发组分之一的硫酸亚铁配成水溶液后储存稳定性较差，也会影响实际使用。上述酶介导的聚合引发体系可在较短的时间内(约3分钟)制备水凝胶，然而关于其引发成胶时间的可调控性还未见报道。如果可以调节凝胶体系的成胶时间，将有利于针对特定用途的水凝胶，提高实际制备过程中的可操控性。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于N-羟基酰亚胺衍生物(N-Hydroxyimide)的葡萄糖氧化酶介导的自由基聚合引发体系。

本发明的另一个目的是采用上述引发体系在水溶液中引发烯类单体进行聚合制备水凝胶的方法，该方法反应条件温和，反应介质的pH值适用范围较宽，操作简便，成胶时间可控，并可用于制备高强度的纳米复合水凝胶。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:

葡萄糖氧化酶介导自由基引发体系，该自由基体系为在室温下以水为反应介质引发烯类单体进行自由基聚合的引发体系，包含N-羟基酰亚胺衍生物、葡萄糖氧化酶和葡萄糖，引发体系适用的pH值范围为3.5～10.5。

所述的葡萄糖和葡葡糖氧化酶的摩尔浓度比为2250～52000，N-羟基酰亚胺衍生物和葡萄糖的摩尔浓度比为0.2～4.0，引发体系中采用的N-羟基酰亚胺衍生物的摩尔浓度不低于4.87mM，葡萄糖的摩尔浓度不低于9mM。

所述的N-羟基酰亚胺衍生物为N-羟基丁二酰亚胺。

本发明的引发体系制备工艺简单，可采用多种方式进行配制，可以将N-羟基酰亚胺衍生物、葡萄糖氧化酶、葡萄糖三者混合后直接使用或反应一段时间后使用;或者先将N-羟基酰亚胺衍生物和葡萄糖氧化酶混合反应一段时间后，再与葡萄糖配合使用;或者先将N-羟基酰亚胺衍生物和葡萄糖混合反应一段时间后，再与葡萄糖氧化酶配合使用;或者先将葡萄糖氧化酶和葡萄糖混合反应一段时间后，再与N-羟基酰亚胺衍生物配合使用;N-羟基酰亚胺衍生物可加入葡葡糖氧化酶和葡萄糖混合物中，也可直接加入单体/反应介质中;或者可将一部分N-羟基酰亚胺衍生物先加入到单体/反应介质混合物中，另外一部分与葡萄糖氧化酶和葡萄糖进行混合，可直接使用或混合一段时间后使用。该引发体系的式组分配成水溶液后还具有储存稳定性好的优点，甚至在放置几周或几个月后配合使用仍可保持引发活性。

区别于现有技术所述的引发体系产生羟基自由基引发聚合的机理，本发明的引发体系具有新型的自由基引发机理。通过电子自旋共振(ESR)证明了本发明的引发体系中产生了由糖类化合物衍生的碳中心自由基。例如，在用a-(4-吡啶基-1-氧)-N-叔丁基硝基酮(POBN)作为自旋捕捉剂的情况下，本发明的三元引发体系(其中N-羟基丁二酰亚胺和葡萄糖的摩尔浓度比为0.29，葡萄糖和葡萄糖氧化酶的摩尔浓度比为12500)产生的ESR扫描信号为POBN自由基加合物的6个特征峰(其超精细分裂常数a^N＝15.7G，a^H＝2.5G)，说明体系中产生了由糖类化合物衍生的碳中心自由基从而引发聚合反应进行。

利用葡萄糖氧化酶介导自由基体系制备水凝胶的方法，利用N-羟基酰亚胺衍生物、葡萄糖氧化酶和葡萄糖配合作为自由基引发体系，为聚合提供自由基，制备时将N-羟基酰亚胺衍生物、葡萄糖氧化酶与烯类单体的水溶液混合均匀，然后向其中加入葡萄糖，调节反应介质的pH值或调节葡萄糖氧化酶/N-羟基酰亚胺衍生物/葡萄糖三元引发体系的组分浓度，在室温下控制在3min～30min内产生自由基引发单体进行聚合形成三维聚合物网络，得到水凝胶。

反应介质的pH值调整为3.5～10.5，葡萄糖氧化酶/N-羟基酰亚胺衍生物/葡萄糖三元引发体系的组分浓度调整为:葡萄糖和葡萄糖氧化酶的摩尔浓度比为2250～52000，同时N-羟基酰亚胺衍生物和葡萄糖的摩尔浓度比为0.2～4.0，N-羟基酰亚胺衍生物的摩尔浓度不低于4.87mM，葡萄糖的摩尔浓度不低于9mM。

所述的烯类单体选自水溶性的丙烯酸酯衍生物、丙烯酰胺衍生物或N-乙烯基吡咯烷酮中的一种或几种，烯类单体的加入量占反应原料总重量的5～20%。

所述的水溶性的丙烯酸酯衍生物为甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)、丙烯酸羟丙酯(HPA)或聚乙二醇甲基丙烯酸甲酰(PEGMA)，所述的丙烯酰胺衍生物为丙烯酰胺(AM)、N,N-二甲基丙烯酰胺(DMAA)或N-异丙基丙烯酰胺(NIPA)。

反应物中还可以添加带有两个或者多个双键的水溶性化合物作为交联剂，包括N，N-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)或乙烯基修饰的蛋白质，所述的交联剂用量占反应原料总重量的1～6%，。

反应物中还可以添加可水分散的无机纳米材料制备高强度的纳米复合水凝胶，所述的无机纳米材料为粘土纳米片、纳米二氧化硅或纳米羟基磷灰石，优选平均粒径10～40nm的纳米二氧化硅或片层直径20～40nm，厚度1nm，分子式为[Mg_5.34Li_0.66Si₈O₂₀(OH)₄]Na_0.66的粘土纳米片，所述的无机纳米材料的用量占反应原料总重量的5～17%。

普通高分子水凝胶一般只能抵抗大约20～100kPa的压缩强度而且易被压碎。本发明制备的纳米复合水凝胶能抵抗1000～2300kPa的压缩强度而且能恢复到原状，具有优良的力学性能和生物相容性，可以应用于药物控制释放、酶固定化、组织工程、物质分离等领域。

与现有技术相比，本发明具有以下优点:

(1)本发明的聚合引发体系具有环境友好、引发条件温和(水相室温反应)、配制简便、反应介质的pH值适用范围较宽的优势，并可用于制备高强度的纳米复合水凝胶;

(2)本发明的聚合引发体系用N-羟基酰亚胺衍生物替代硫酸亚铁，提供了一种新型的葡萄糖氧化酶介导的自由基引发机理，避免了引入二价铁离子对烯类单体自由基聚合反应及水凝胶制备产生的不利影响。同时，N-羟基丁二酰亚胺比硫酸亚铁的储存稳定性好，避免了二价铁离子容易受氧化的缺点，有利于实际应用;

(3)本发明可以通过调节反应介质的pH值，或调节葡萄糖氧化酶/N-羟基酰亚胺衍生物/葡萄糖三元引发体系的组分浓度，控制成胶时间(3min～30min)，可以针对特定用途的水凝胶，提高实际制备过程中的可操控性。

附图说明

图1为为电子自旋共振检测到的本发明自由基引发体系产生的自由基信号。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案，以下结合实例进一步说明本发明，但这些实例并不用来限制本发明。

实施例1

1)配制前驱液:取N，N-二甲基丙烯酰胺0.10～0.13g，交联剂聚乙二醇二丙烯酸酯(平均分子量250)0.07～0.09g，去离子水1.3～1.5g加入样品瓶中，用旋涡混合器混合均匀，实测pH值为7～8。

2)水凝胶的制备:在上述前驱液中依次加入N-羟基丁二酰亚胺水溶液100μL，葡萄糖氧化酶浓缩液100μL，葡萄糖水溶液200μL(反应体系中N-羟基丁二酰亚胺和葡萄糖的摩尔浓度比为1.74，葡萄糖和葡萄糖氧化酶的摩尔浓度比为25000)，快速混匀，密闭静置得到浅白色半透明水凝胶，成胶时间3min30s。

实施例2

1)配制前驱液:取N，N-二甲基丙烯酰胺0.10～0.13g，交联剂聚乙二醇二丙烯酸酯(平均分子量250)0.07～0.09g，去离子水1.3～1.5g，1M醋酸水溶液50μL加入样品瓶中，用旋涡混合器混合均匀，实测pH值为3.5～4.5。

2)水凝胶的制备:步骤同实施例1，成胶时间3min。

实施例3

1)配制前驱液:取N，N-二甲基丙烯酰胺0.10～0.13g，交联剂聚乙二醇二丙烯酸酯(平均分子量250)0.07～0.09g，去离子水1.3～1.5g，1M氨水溶液125μL加入样品瓶中，用旋涡混合器混合均匀，实测pH值为9.5～10.5。

2)水凝胶的制备:步骤同实施例1，成胶时间19min30s。

实施例4

1)配制前驱液:取N，N-二甲基丙烯酰胺0.10～0.13g，交联剂聚乙二醇二丙烯酸酯(平均分子量250)0.07～0.09g，去离子水1.6～1.7g加入样品瓶中，用旋涡混合器混合均匀。

2)水凝胶的制备：在上述前驱液中依次加入N-羟基丁二酰亚胺水溶液25μL，葡萄糖氧化酶浓缩液100μL，葡萄糖水溶液50μL(反应体系中N-羟基丁二酰亚胺和葡萄糖的摩尔浓度比为1.74，葡萄糖和葡萄糖氧化酶的摩尔浓度比为6250)，快速混匀，密闭静置得到浅白色半透明水凝胶，成胶时间4min20s。

实施例5

1)配制前驱液：步骤同实施例4。

2)水凝胶的制备：在上述前驱液中依次加入N-羟基丁二酰亚胺水溶液2.8μL，葡萄糖氧化酶浓缩液100μL，葡萄糖水溶液50μL(反应体系中N-羟基丁二酰亚胺和葡萄糖的摩尔浓度比为0.20，葡萄糖和葡萄糖氧化酶的摩尔浓度比为6250)，快速混匀，密闭静置得到浅白色半透明水凝胶，成胶时间19min20s。

实施例6

1)配制前驱液：取N，N-二甲基丙烯酰胺0.10～0.13g，交联剂聚乙二醇二丙烯酸酯(平均分子量250)0.07～0.09g，去离子水1.6～1.8g加入样品瓶中，用旋涡混合器混合均匀。

2)水凝胶的制备：在上述前驱液中依次加入N-羟基丁二酰亚胺水溶液20.4μL，葡萄糖氧化酶浓缩液100μL，葡萄糖水溶液25μL（反应体系中N-羟基丁二酰亚胺和葡萄糖的摩尔浓度比为2.84，葡萄糖和葡萄糖氧化酶的摩尔浓度比为3125)，快速混匀，密闭静置得到浅白色半透明水凝胶，成胶时间6min50s。

实施例7

1)配制前驱液：步骤同实施例6。

2)水凝胶的制备：在上述前驱液中依次加入N-羟基丁二酰亚胺水溶液20.4μL，葡萄糖氧化酶浓缩液100μL，葡萄糖水溶液18μL(反应体系中N-羟基丁二酰亚胺和葡萄糖的摩尔浓度比为4.0，葡萄糖和葡萄糖氧化酶的摩尔浓度比为2250)，快速混匀，密闭静置得到浅白色半透明水凝胶，成胶时间7min30s。

实施例8

1)配制前驱液：取N，N-二甲基丙烯酰胺0.10～0.13g，交联剂聚乙二醇二丙烯酸酯(平均分子量250)0.07～0.09g，去离子水1.7～1.8g加入样品瓶中，用旋涡混合器混合均匀。

2)水凝胶的制备：在上述前驱液中依次加入N-羟基丁二酰亚胺水溶液25μL，葡萄糖氧化酶浓缩液12μL，葡萄糖水溶液50μL(反应体系中N-羟基丁二酰亚胺和葡萄糖的摩尔浓度比为1.8，葡萄糖和葡萄糖氧化酶的摩尔浓度比为52000)，快速混匀，密闭静置得到浅白色半透明水凝胶，成胶时间30min。

实施例9

1)配制前驱液：步骤同实施例8。

2)水凝胶的制备：在上述前驱液中依次加入N-羟基丁二酰亚胺水溶液25μL，葡萄糖氧化酶浓缩液50μL，葡萄糖水溶液50μL(反应体系中N-羟基丁二酰亚胺和葡萄糖的摩尔浓度比为0.29，葡萄糖和葡萄糖氧化酶的摩尔浓度比为12500)，快速混匀，密闭静置得到浅白色半透明水凝胶，成胶时间8min45s。

实施例10

1)配制前驱液：步骤同实施例8。

2)水凝胶的制备：在上述前驱液中依次加入N-羟基丁二酰亚胺水溶液25μL，葡萄糖氧化酶浓缩液200μL，葡萄糖水溶液50μL(反应体系中N-羟基丁二酰亚胺和葡萄糖的摩尔浓度比为1.8，葡萄糖和葡萄糖氧化酶的摩尔浓度比为3125)，快速混匀，密闭静置得到浅白色半透明水凝胶，成胶时间4min。

实施例11

1)配制前驱液：取N-异丙基丙烯酰胺0.15～0.17g，粘土纳米片0.15～0.25g，去离子水1.5～1.7g加入样品瓶中，高速磁力搅拌1.5h混合均匀。

3)水凝胶的制备及性能测试：在上述前驱液中依次加入N-羟基丁二酰亚胺水溶液25μL，葡萄糖氧化酶浓缩液50μL，葡萄糖水溶液25μL(反应体系中N-羟基丁二酰亚胺和葡萄糖的摩尔浓度比为3.6，葡萄糖和葡萄糖氧化酶的摩尔浓度比为6250)，快速混匀，密闭静置得到浅白色半透明水凝胶(含10wt％纳米粘土片)，成胶时间9min。上述水凝胶制成圆柱状样品(直径15.7mm，高7.3mm)后，使用电子万能试验机测得压缩强度为2250kPa(压缩应变98％)，测试后未断裂且可部分恢复原状。

实施例12

1)制备乙烯基修饰的牛血清白蛋白：取牛血清白蛋白(BSA)600mg，N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺54mg，溶解于30mL去离子水中，在室温下磁力搅拌反应2.5h。将反应混合物转移至透析袋中，置于去离子水中透析3天，冷冻干燥得到白色固体产物即为乙烯基修饰的牛血清白蛋白。根据文献(J.Biosci.人oeng.，2005,100,551-555)报道的方法，测得平均每个牛血清白蛋白分子上大约修饰4个双键。

2)配制前驱液:取N-乙烯基吡咯烷酮0.09～0.11g，纳米二氧化硅水分散液(21wt%)1.6～1.7g,乙烯基修饰的牛血清白蛋白0.055～0.065g加入样品瓶中，用旋涡混合器混合均匀。

3)水凝胶的制备及性能测试:在上述前驱液中依次加入N-羟基丁二酰亚胺水溶液25μL，葡萄糖氧化酶浓缩液100μL，葡萄糖水溶液50μL(反应体系中N-羟基丁二酰亚胺和葡萄糖的摩尔浓度比为1.74，葡萄糖和葡萄糖氧化酶的摩尔浓度比为6250)，快速混匀，密闭静置得到浅黄色半透明水凝胶(含17wt％纳米二氧化硅)，成胶时间4min30s。上述水凝胶制成圆柱状样品(直径15.7mm，高7.5mm)后，使用电子万能试验机测得压缩强度为1250kPa(压缩应变98%)，测试后可恢复原状。

如图1所示，在用α-(4-吡啶基-1-氧)-N-叔丁基硝基酮(POBN)作为自旋捕捉剂的情况下，本发明的三元引发体系(其中N-羟基丁二酰亚胺和葡萄糖的摩尔浓度比为0.29，葡萄糖和葡萄糖氧化酶的摩尔浓度比为12500)产生的ESR扫描信号为POBN自由基加合物的6个特征峰(其超精细分裂常数a^N＝15.7G，a^H=2.5G)，说明体系中产生了由糖类化合物衍生的碳中心自由基从而引发聚合反应进行。

以上对本发明做了示例性的描述，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制。其他的任何未背离本发明的原理实质下所作的修改、替换、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。