一种纳米超薄生物膜差异修饰前后表面的人工角膜及制作方法

摘要

本发明涉及一种纳米超薄生物膜差异修饰前后表面的人工角膜及制作方法。目的是提供的人工角膜具有减少人工角膜术后并发症，所提供的制备方法应简单易行无污染。技术方案是：一种纳米超薄生物膜修饰的前后表面差异改性的可折叠人工角膜，光学部的前表面依次反复沉积有聚阳离子层及表皮生长因子层；光学部的后表面由内而外依次反复沉积有聚阳离子层以及HA层，最外层为HA层。一种纳米超薄生物膜修饰的前后表面差异改性的可折叠人工角膜的制备方法，依次包括以下步骤：1)使人工角膜表面荷以负电荷；2)使得聚阳离子和表皮生长因子交替吸附在人工角膜前表面；3)使得聚阳离子和HA交替吸附在人工角膜后表面；4)干燥、密封包装即可。

说明书

技术领域

本发明涉及医疗领域，尤其是人工角膜及其制作方法。

背景技术

角膜病是世界上仅次于白内障的第二位致盲眼病。全世界4500万盲人中，有800 万为角膜病致盲，且平均每年新增150-200万例因角膜溃疡和外伤致盲的患者。角 膜移植是目前严重角膜病的主要治疗手段，虽然我国的角膜病致盲患者超过100万， 但每年角膜移植术不足5000例，角膜供体的缺乏一直是并越来越成为角膜移植的重 要制约因素；某些严重角膜疾病如化学烧伤、干细胞缺陷、眼疤痕性类天疱疮、 Stevens-Johnson综合症等，角膜移植无法成功。因此角膜替代物的研究显得尤为重 要，对于无法进行角膜移植的严重角膜疾病患者，人工角膜成为其唯一的治疗选择 和复明希望。人工角膜具有化学稳定性与光学性能优良、疾病传播与术后变形风险 低等优点，但迄今已报道的人工角膜生物相容性欠佳，术后并发症风险较高，难以 维持术后长期复明效果。同时，近年来的人工角膜大多由光学镜柱和光学支架组成， 设计及制备方法复杂，手术切口大，植入方式繁琐，这些限制了其临床应用。

Aldave等统计表明后表面人工角膜后膜(RPM)(44％)和前表面永久性上皮缺损 (38％)为最常见的术后并发症，RPM直接影响术后远期视力恢复，而上皮缺损会大 大增加感染、人工角膜脱落、角膜溶解等的机率。因此研制具有良好生物相容性的 人工角膜，减少术后并发症，对于维持清晰视觉、提高患者术后远期视力和生存质 量具有极其重要的意义。近十多年来通过材料表面改性方法改善人工角膜生物相容 性的探索引起了高度重视。其中尤为关注促进前表面的上皮化，原因在于前表面直 接接触外界环境，理想的上皮化能成为角膜的第一道屏障，维持眼表湿润、阻止微 生物入侵及上皮细胞向下长入角膜层间，进而减少感染、角膜溶解坏死、人工角膜 脱落的发生。与前表面需要支持上皮化不同的是，人工角膜后表面由于离前房较近， 来自前房的炎症反应会引起后表面出现细胞粘附和纤维蛋白沉积，形成影响视轴透 明度的RPM，直接引起术后视力下降，因此抑制RPM形成对于提高术后远期视力 至关重要。

目前已经通过美国FDA批准进入临床应用的商业化人工角膜包括硬性PMMA 材料的Boston人工角膜和软性pHEMA材料的Alphacor人工角膜。PMMA和pHEMA 均存在与本体性能相关的不可逆缺点，前者为硬性疏水性材料，植入后无法测量眼 压，易被Nd:YAG激光损伤，生物相容性差，后者则对眼表要求较高，机械强度较 差，容易出现光学部钙化及沉着等导致人工角膜混浊发生率较高。两者设计均相对 复杂，Boston人工角膜为“镜柱-支架”型结构，由三部分组成，结合部强度较差， 容易房水渗漏等；Alphacor由透明的光学部和不透明的周边部组成，虽然两部分均 为pHEMA成分，但无法一体成型。同样两者均存在如前所述的因前表面无法支持 角膜上皮细胞生长，后表面人工角膜后膜形成而导致术后远期效果不佳，并发症风 险高的问题。另外，两者均存在角膜切口大(Boston手术切口约25mm，Alphacor 约为16mm)，手术时间长(大于1小时)的问题，而Boston的植入仍需要供体角膜 的支持，Alphacor需要两次手术才能完成人工角膜的植入。

中国发明专利201110218237.3“一种人工角膜”，通过共价结合或静电吸附方法 在光学区内外表面设有氟-肝素表面修饰层，有利于防止病理性细胞和组织吸附；但 该专利未考虑到人工角膜前后表面所处环境的差异及其对生物相容性需求的差异， 前后表面均用抑制粘附的氟-肝素修饰，仍然存在前表面上皮化困难的问题。中国 发明专利02116963.2“聚乙烯醇工具体水凝胶软性人工角膜的制备方法”，也提出通 过载能离子束联合低温等离子体表面涂覆技术在人工角膜主体的非周边部内侧面涂 敷上低分子肝素；但该专利只提出在内表面涂覆低分子肝素，未考虑到前表面上皮 化的需要。而前表面上皮缺损恰恰是感染、人工角膜脱落、角膜溶解等严重并发症 的根本原因。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种人工角膜及其制备方法的改进，所提供 的人工角膜具有减少人工角膜术后并发症，可维持术后视力的特点，所提供的制备 方法应简单易行无污染。

本发明提供的技术方案是：一种纳米超薄生物膜修饰的前后表面差异改性的可 折叠人工角膜，为光学部和围绕在光学部四边的周边部组成的透明膜片，其特征在 于：光学部的前表面由内而外依次反复沉积有聚阳离子层以及表皮生长因子层，最 外层为表皮生长因子层；光学部的后表面由内而外依次反复沉积有聚阳离子层以及 HA层，最外层为HA层。

所述光学部的前表面的聚阳离子层厚度约为4-20nm，表皮生长因子层厚度约为 5-50nm。

所述光学部的后表面的聚阳离子层厚度约为4-20nm，HA层厚度约为3-15nm。

所述周边部上设置有若干个用于固定人工角膜用的固定孔。

一种纳米超薄生物膜修饰的前后表面差异改性的可折叠人工角膜的制备方法， 依次包括以下步骤：

1)将制作成型的人工角膜分别用丙酮、去离子水清洗后，接着用超声清洗仪清 洗5-10分钟，在10-40摄氏度温度下干燥后将其放入低温等离子体发生器进行处理， 使人工角膜表面荷以负电荷；

2)将上述表面带负电荷的人工角膜的前表面浸入带正电荷的浓度为 1-10mg/mL的聚阳离子水溶液中，吸附60-120分钟然后用去离子水漂洗并氮气吹干； 再将该人工角膜的前表面浸入带负电荷的浓度为10-100ug/mL的表皮生长因子的磷 酸盐缓冲溶液中，吸附60-120分钟，然后用磷酸盐缓冲液漂洗，氮气吹干；

重复前述步骤6-10次，使得聚阳离子和表皮生长因子交替吸附在人工角膜前表 面，并保证最外层为表皮生长因子层；

3)将上述人工角膜的后表面浸入带正电荷的浓度为1-10mg/mL的聚阳离子水溶 液中，吸附60-120分钟后用去离子水漂洗并氮气吹干；接着将该人工角膜的后表面 浸入浓度为1-10mg/mL的透明质酸钠的磷酸盐缓冲溶液中吸附60-120分钟，然后用 磷酸盐缓冲液漂洗并氮气吹干；

重复前述步骤6-10次，使得聚阳离子和HA交替吸附在人工角膜后表面，并保 证最外层为HA层；

4)将经过前后表面差异改性的人工角膜，在10-40摄氏度温度下干燥、密封包 装即可；

所述聚阳离子为壳聚糖或聚赖氨酸(PLL)；

所述步骤2)、步骤3)同时进行或者分开单独进行。

所述步骤1)中等离子体发生器处理时的参数为：发生器功率20-60W，气体压 力40-50pa，等离子体光辉放电10s-10min。

所述的干燥是真空干燥，真空压力为200-500Pa。

所述人工角膜采用硅凝胶或聚丙烯酸酯制成。

本发明的有益效果是：人工角膜前表面构建带有重组人表皮生长因子(hEGF； hEGF具有广泛的生物学效应，能极强地促进各种表皮组织生长)的生物膜后，能够 促进并维持人工角膜表面角膜上皮细胞的生长，从而在人工角膜前表面形成上皮细 胞层；显著减小了接触角(接触角越小，表示润湿性越好，液体容易润湿人工角膜)； 同时，在人工角膜后表面构建带有强亲水性的透明质酸钠(HA)后，可抑制炎症细 胞和蛋白粘附，有效地抑制了人工角膜后膜的形成。

采用静电层层自组装方法在人工角膜的前后表面进行差异改性，简单易行无污 染，具有足够的生物稳定性，制备条件温和，并且组装过程所采用的均为天然聚电 解质或者生物分子，无细胞毒性无免疫原性；因而制成的人工角膜对眼内其他组织 无毒副作用，拥有良好的生物相容性。该方法制造出的人工角膜手术创口小，手术 时间短，生物相容性良好，可达到预防和减少并发症、提高人工角膜移植的成功率、 使众多角膜病患者重见光明的目的。

附图说明

图1是人工角膜的主视结构示意图。

图2是人工角膜的俯视结构示意图。

图3是人工角膜前表面各沉积层的表面接触角检测效果示意图。

图4为人工角膜前后表面角膜上皮细胞生长的扫描电镜图。

图5是前后表面差异改性方法之一示意图。

具体实施方式

本发明提供的人工角膜为软性硅凝胶或聚丙烯酸酯制成，这种材料可折叠，本 体性能优良，具有良好的透氧性、透光率、生物学稳定性和力学性能，并能通过改 性提高营养物质传输及改善疏水性。人工角膜由光学部1和周边部2组成，为一膜 片结构，可一次冲压成型，光学部和周边部均透明，光学部厚度略高于周边部。周 边部设有10-20个固定孔3，用于术中缝线固定人工角膜。由于材料为软性可折叠材 料，人工角膜可折叠在特定的推注器中，通过3-4mm的角膜切口推注入患者角膜， 自动展开后缝线固定即可，大大缩短手术时间(半小时以内)，植入过程一次完成， 无需依赖供体角膜，无需二次手术。以上结构与现有人工角膜相同。

本发明为了同时克服上皮化困难和人工角膜后膜形成的问题，在人工角膜的前 表面4设计构建了带有重组人表皮生长因子(hEGF)的生物膜；hEGF具有广泛的 生物学效应，能极强地促进各种表皮组织生长，在医学上己用于角膜损伤、烧烫伤、 溃疡、各类创伤等的治疗；所以利用hEGF来促进并维持人工角膜表面角膜上皮细 胞的生长，从而在人工角膜表面形成上皮细胞层。同时，在人工角膜的后表面5构 建带有强亲水性的透明质酸钠(HA)来抑制人工角膜后膜的形成；HA是广泛存在 于动物和人体的生理活性物质，其超强的亲水性使其具有极强的抗粘附能力，且作 为人体本身人体内分布最广的一种酸性黏糖无致炎性及免疫原性。

利用静电层层自组装技术来同时构建前后表面不同的纳米超薄生物膜的具体过 程如下：

1)将制作成型的人工角膜分别用丙酮、去离子水清洗后，再用超声清洗仪清 洗5-10分钟，然后在10-40摄氏度温度下干燥；接着将其放入等离子体发生器中处 理，处理参数：发生器功率20-60W，气体压力40-50pa，等离子体光辉放电10s-10min (推荐参数：发生器功率为40W，射频为13kHz，气体压力维持在40-50pa，等离子 体光辉放电3分钟)，然后取出人工角膜，使该人工角膜的表面带负电荷；

2)将上述表面带负电荷的人工角膜前表面浸入带正电荷的浓度为1-10mg/mL 的聚阳离子(壳聚糖或PLL)的水溶液中，吸附60-120分钟然后用去离子水漂洗并 氮气吹干；再将该人工角膜前表面浸入与此前聚电解质所带电荷相反的浓度为 10-100ug/mL的表皮生长因子EGF的磷酸盐缓冲溶液(磷酸盐缓冲溶液由EGF与磷 酸盐缓冲液即PBS组成，pH＝7.4)中，吸附60-120分钟，然后用PBS溶液漂洗， 氮气吹干；

重复以上步骤6-10次，使得聚阳离子和EGF交替吸附在人工角膜前表面，并 保证最外层为EGF层；

3)将上述人工角膜的后表面浸入带正电荷的浓度为1-10mg/mL的聚阳离子(壳 聚糖或PLL)的水溶液中，吸附60-120分钟然后用去离子水漂洗并氮气吹干；再将 该人工角膜浸入浓度为1-10mg/mL的透明质酸钠的磷酸盐缓冲溶液中(磷酸盐缓冲 溶液由透明质酸钠与磷酸盐缓冲液组成)，吸附60-120分钟，然后用PBS溶液漂洗， 并氮气吹干；

重复以上步骤6-10次，使得聚阳离子和HA交替吸附在人工角膜前表面，并保 证最外层为HA层；

4)如上制得前后表面差异改性的人工角膜，然后在10-40摄氏度温度下干燥、 密封包装即可。

以上所述干燥为真空干燥，真空压力推荐为200-500Pa。

经过前述前后表面差异改性的人工角膜，其光学部的前表面4由内而外依次反 复沉积了聚阳离子层以及表皮生长因子层，其中的聚阳离子层厚度约为4-20nm，表 皮生长因子层厚度约为5-50nm。其光学部的后表面5由内而外依次反复沉积了聚阳 离子层以及HA层，其中的聚阳离子层厚度约为4-20nm，HA层厚度约为3-15nm。

以上所述的磷酸盐缓冲液，可自制或者直接外购获得；自制时推荐采用以下方法： KCl 0.20g，KH₂PO₄0.2g，NaCl 8.00g，Na₂HPO₄·7H₂O 1.56g；搅拌均匀，双蒸水定 容1000mL，调至pH＝7.4,高压灭菌，4℃保存。

以上处理过程中，步骤2)和步骤3)可分开进行或同时进行。

步骤2)和步骤3)分开进行，一般无需增加制备工具，只需在前表面或后表面 制备过程中，注意不要让处理溶液影响到另一面即可。

步骤2)和步骤3)同时进行，则需要专用工具6；图5中显示了其中的一种工 具。由图可知，该工具包括两个弯管，弯管的一端管口贴紧在人工角膜的周边部， 保证制备过程中制备溶液能够接触前后表面但不泄露；另一端管口6-1用于注入和 倾倒制备溶液(绕水平轴线转动180度使管口6-1朝下即可将制备溶液倒出，以便 更换成另一种制备溶液)。两个弯管左右对夹着人工角膜后，就可同时进行处理了。

静电层层自组装技术是近年来倍受关注的表面改性前沿技术，它可在室温下利 用带相反电荷的聚电解质的交替吸附来构建稳定的超薄多层膜，在纳米级别上实现 对生物材料表面特异性生物活性作用的精确控制；它不影响组装成分的天然构象， 甚至能在干态下保持其活性；其制备方法温和，交替浸涂工艺简单，容易通过调节 组装条件控制膜的微纳结构及性质；适用基体材料种类多，可实现工业化生产；已 被用于多种医用材料的表面改性。因此静电层层自组装技术是进行人工角膜表面改 性设想的理想技术。

静电层层自组装技术简单易行无污染，足够的生物稳定性，制备条件温和，并 且组装过程所采用的均为天然聚电解质或者生物分子，无细胞毒性无免疫原性，所 以本发明提供的人工角膜对眼内其他组织无毒副作用，拥有良好的生物相容性。而 且该人工角膜手术创口小，手术时间短，生物相容性良好，可达到预防和减少并发 症、提高人工角膜移植的成功率、使众多角膜病患者重见光明的目的。

为检验静电层层自组装效果，本发明对人工角膜前表面的纳米超薄生物膜进行 了检测，获得的数据(如图3所示)表明：人工角膜表面接触角未改性前约为120 度，前表面在自组装过程中随着壳聚糖和EGF的逐层交替沉积后，其接触角明显下 降，并呈现交替锯齿状变化，证实了EGF在人工角膜前表面的成功组装。

图4提示了人工角膜前后表面的细胞生长情况；其中的左图A中，人工角膜前 表面组装了EGF后，角膜上皮细胞生长增殖成片；右图B中，人工角膜后表面组装 了HA后，细胞粘附增殖极少，无法连接成片；证明组装成功的EGF和HA能够发 挥预期的生物学效应。