一种提高基因工程菌异戊二烯及其衍生物产量的方法及应用

摘要

本发明公开了一种提高基因工程菌异戊二烯及其衍生物产量的方法及应用，属于基因工程技术领域。本发明所提供的方法是在含有异戊二烯MVA生物合成途径的基因工程菌中过表达磷酸转酮酶基因fxpk和果糖1,6-二磷酸酶基因fbp。其中，基因工程菌可共表达乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因、甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因、异戊烯焦磷酸异构酶基因，以及异戊二烯合成酶或异戊二烯衍生物合成酶。利用本发明所提供的方法可大幅提高基因工程菌异戊二烯及其衍生物的产量，其中异戊二烯产量的提高了80.7％，异戊二烯衍生物香叶醇、桧烯和蒎烯产量分别提高了1.5倍、9倍和1.2倍。

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高基因工程菌异戊二烯及其衍生物产量的方法及应用，属于基因工程 技术领域。

背景技术

异戊二烯是一种重要的化工平台化合物，其95％用于合成橡胶；也是丁基橡胶的第二单 体。此外，还可广泛应用于农药、医药、香料及粘结剂等领域。目前，异戊二烯的来源主要 是通过石油基原料异戊烷、异戊烯脱氢法、化学合成法(包括异丁烯-甲醛法、乙炔-丙酮法、丙 烯二聚法)和裂解C5馏分萃取蒸馏法。然而，随着化石资源的日益枯竭，原料来源是利用石 油基原料制备异戊二烯的重要瓶颈问题。以可再生的生物质为原料，利用生物转化技术合成 异戊二烯，因具有可持续性、环境友好、品质优异等优势，已成为国际上的研究热点。

目前，生物基异戊二烯的生物合成路线主要是以葡萄糖为原料，利用甲羟戊酸(MVA) 或甲基赤藓糖-5-磷酸(MEP)途径合成异戊二烯。其中，MVA途径因效率较高，是目前异 戊二烯生物合成的主要途径。然而，与MEP途径相比，MVA的产率较低。

其主要原因是1分子葡萄糖经过糖酵解途径生成2分子乙酰辅酶A，同时会产生2分子 二氧化碳。I.W.,Bogorad等人(2013)提出细胞除了在有氧的条件存在糖酵解途径(MEP途 径)以外，在厌氧条件下还存在一条非氧化的糖酵解途径(NOG途径)，该途径可将1分子 葡萄糖转化为3分子乙酰磷酸，进而合成3分子乙酰辅酶A。该研究在体外构建了NOG途径， 并证明以葡萄糖6磷酸为底物，利用NOG途径可提高乙酸(乙酰磷酸的下游产物)的产量， 同时，在细胞体内，以木糖为原料，通过过表达磷酸转酮酶基因(fxpk)和果糖1,6二磷酸酶 基因(fbp)并敲除乳酸脱氢酶(ldhA)、frdBC、adhE、pflB和frdBC后，可以使乙酸的摩 尔产率达到2.2接近利用NOG途径的乙酸理论摩尔产率2.5。虽然该研究证明了NOG途径的 可行性，然而，该研究并没有以葡萄糖为底物，在体内利用NOG途径合成异戊二烯及其衍 生物的研究。葡萄糖降解所需的磷酸葡萄糖转移酶系统(PTS)涉及到复杂的调控机制，NOG 途径是否适合以葡萄糖为原料的体内代谢无法得知。此外，该研究仅报道了乙酸的变化，乙 酰磷酸合成乙酸仅为一步反应，而从乙酰磷酸合成乙酰辅酶A，再由乙酰辅酶A为底物合成 异戊二烯及其衍生物却需要经过7步酶反应，过表达磷酸转酮酶基因(fxpk)和果糖1,6二磷 酸酶基因(fbp)是否适用于如此复杂的代谢途

本发明为了解决异戊二烯及其衍生物生物合成过程中存在碳损失、产率低的瓶颈问题， 提供了一种提高基因工程菌异戊二烯及其衍生物产量的方法，采取的技术方案如下：

本发明的一个目的在于提供一种提高基因工程菌异戊二烯及其衍生物产量的方法，该方 法是在含有异戊二烯MVA生物合成途径的基因工程菌中过表达磷酸转酮酶基因fxpk和果糖 1,6-二磷酸酶基因fbp。

所述含有异戊二烯MVA生物合成途径的基因工程菌，是共表达乙酰辅酶A酰基转移酶/羟 甲基戊二酰辅酶A还原酶基因、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因、甲羟戊酸激酶基因、甲羟 戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因、异戊烯焦磷酸异构酶基因，以及以下 任意一种基因的基因工程菌：

1)异戊二烯合成酶基因；

2)异戊二烯衍生物合成酶基因。

所述异戊二烯衍生物合成酶基因，是香叶醇合成酶基因、桧烯合成酶基因、蒎烯合成酶 基因、甲羟戊酸合成酶基因或橙花醇合成酶基因。

所述基因工程菌，优选敲除了乙酸激酶基因ackA、D-乳酸脱氢酶基因ldhA、乙醛乙醇脱 氢酶基因adhE、丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB和延胡索酸盐还原酶铁硫蛋白和膜蛋白基因frdBC 的大肠杆菌的大肠杆菌。

所述磷酸转酮酶基因fxpk，优选来自青春双歧杆菌，GeneBank登录号为AY518212.1，或 者来自凝结芽孢杆菌Gene ID为11174923；或者来自蒙氏肠球菌Gene ID为17696722；

所述果糖1，6-二磷酸酶基因fbp，优选来自大肠杆菌，GeneBank登录号为ACT 45889.1； 或者来自酿酒酵母，GeneBank登录号为AAA34603.1；或者来自枯草芽孢杆菌，NCBI参考序 列号为WP_003243329.1；或来自拟南芥，GeneBank登录号为AEE79180.1。

所述方法的步骤如下：

1)构建含有乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因、3-羟-3-甲基戊二酰 辅酶A合酶基因、甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶 基因、异戊烯焦磷酸异构酶基因，以及异戊二烯合成酶基因或异戊二烯衍生物合成酶基因的 MVA途径上下游重组质粒；

2)构建含有磷酸转酮酶基因fxpk和果糖1，6-二磷酸酶基因fbp的重组质粒；

3)将步骤1)和步骤2)所得的重组质粒导入到宿主菌中，过表达磷酸转酮酶基因fxpk和 果糖1，6-二磷酸酶基因fbp。

步骤1)所述乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因和3-羟-3-甲基戊二酰 辅酶A合酶基因来自于粪肠球菌；所述甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羟 戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因、异戊烯焦磷酸异构酶基因来自于酿酒酵母。

所述方法的具体步骤如下：

1)将乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A 合酶基因和异戊二烯合成酶基因克隆到质粒pACYCDuet-1上，获得MVA途径上游质粒 pACY-mvaE-mvaS-isps4；

所述乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因和3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A 合酶基因来自于粪肠球菌Enterococcus faecalis；

2)将甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因、 异戊烯焦磷酸异构酶基因克隆到pTrcHis2B，获得MVA途径下游质粒pTrc_low；

所述甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因、异 戊烯焦磷酸异构酶基因来源于酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae；

3)将磷酸转酮酶基因fxpk和果糖1,6-二磷酸酶基因fbp克隆到质粒pCOLADUet-1上，获得 重组质粒pCOLA-fbp-fxpk；

4)将步骤1)、步骤2)和步骤3)所得的质粒导入到敲除了乙酸激酶基因ackA、D-乳酸 脱氢酶基因ldhA、乙醛乙醇脱氢酶基因adhE、丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB和延胡索酸盐还原 酶铁硫蛋白和膜蛋白基因frdBC的大肠杆菌中进行共表达。

所述方法用于生产异戊二烯及其衍生物。

本发明的另一目的是提供了一种利用所述方法生产异戊二烯及其衍生物的方法，该方法 的步骤如下：

1)将乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A 合酶基因以及异戊二烯合成酶基因或异戊二烯衍生物合成酶基因克隆到质粒上，构建MVA途 径上游质粒；

2)将甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因、 异戊烯焦磷酸异构酶基因克隆到质粒上，构建MVA途径下游质粒；

3)将磷酸转酮酶基因fxpk和果糖1,6-二磷酸酶基因fbp克隆到质粒pCOLADUet-1上，构建 重组质粒pCOLA-fbp-fxpk；

4)将步骤1)、步骤2)和步骤3)所得的重组质粒导入到敲除了乙酸激酶基因ackA、D- 乳酸脱氢酶基因ldhA、乙醛乙醇脱氢酶基因adhE、丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB和延胡索酸盐 还原酶铁硫蛋白和膜蛋白基因frdBC的大肠杆菌中，获得重组菌；

5)发酵步骤4)所得重组菌，分离提取发酵产物中的异戊二烯或异戊二烯衍生物。

本发明获得的有益效果如下：

本发明针对异戊二烯及其衍生物生物合成过程中存在碳损失、产率低的瓶颈问题，在含 有异戊二烯MVA生物合成途径的基因工程菌中过表达磷酸转酮酶基因fxpk和果糖1,6-二磷酸 酶基因fbp，构建了一条新的异戊二烯合成途径，大幅提高了基因工程菌的异戊二烯及其衍生 物的产量。其中异戊二烯产量的提高了80.7％，异戊二烯衍生物香叶醇、桧烯和蒎烯的产量分 别提高了1.5倍、9倍和1.2倍。

附图说明

图1为本发明所用的质粒pCOLA-fbp-Fxpk的遗传图谱。

图2为实施例2所得异戊二烯的气质检测图。

图3为实施例4所得香叶醇的气质检测图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

以下实施例中涉及的材料、试剂、仪器、方法，未经特别说明，均为本领域常规材料、 试剂、仪器和方法，可以通过商业渠道获得。

实施例1：质粒pCOLA-fbp-fxpk的构建

(1)果糖1‘6-二磷酸酶基因的克隆和表达载体的构建

以大肠杆菌为模板，扩增基因片段，同时连入酶切位点AatⅡ和XhoI。以

fbp-F-AatⅡ:5’-ATCGGACGTCATGAAAACGTTAGGTGAATTTATTG-3’

fbp-R-XhoI:5’-CCGCTCGAGTTACGCGTCCGGGAACTC-3’为引物，以大肠杆菌的 DNA为模板进行扩增。PCR产物纯化后，利用内切酶AatⅡ和XhoI进行双酶切，再连接到 同样进行双酶切的pCOLADUet-1载体上，形成了质粒pColA-fbp

连接产物转化E.coli DH5α，然后涂布加有50μg·mL^-1卡那霉素的LB固体平板，PCR筛 选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒后，再通过限制性酶切和测序鉴定。

(2)磷酸转酮酶基因的克隆和表达载体的构建

以Fxpk-F-EcoRⅠ:5’-CCGGAATTCC ATGACGAGTCCTGTTATTGG-3’

Fxpk-R-HindⅢ:5’-CCCAAGCTT TTATCGCCAGCGGTTGC-3’为引物

以青春双歧杆菌(CGMCC NO.1.2190)DNA为模板进行扩增。PCR产物纯化后，利用 内切酶EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切，并连接在同样双酶切后的质粒pCOLA-fbp上，构建出 pCOLA-fbp-Fxpk(图1)。

实施例2：摇瓶发酵合成异戊二烯

(1)E.coli重组菌株的构建

将MVA上游质粒(pACY-MvaE-MVAS-isps4)和下游途径质粒(pTrc-low)及 pCOLA-fbp-fxpk(共同热击转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于加有氯霉素、卡那霉 素和氨苄霉素抗生素的LB固体平板，通过PCR筛选获得阳性克隆，由此获得工程大肠杆菌 LWNOG1。

将MVA上游(pACY-MvaE-MVAS-isps4)和下游途径(pTrc-low)(共同热击转化E.coli  BL21(DE3)感受态细胞，涂布于加有氯霉素和氨苄霉素抗生素的LB固体平板，由此获得工程 大肠杆菌LWIP1作为对照菌。

MVA上游(pACY-MvaE-MVAS-isps4)的构建方法同文献(Jianming Yang，Enhancing  Production of Bio-Isoprene Using Hybrid MVA Pathway and Isoprene Synthase in E.coli.PLoS  ONE，2012，7(4)：e33509)中质粒pYJM20的构建；下游途径pTrc-low的构建方法同 文献(Jianming Yang，Enhancing Production of Bio-Isoprene Using Hybrid MVA Pathway and  Isoprene Synthase in E.coli.PLoS ONE，2012，7(4)：e33509)中质粒pYJM14的构建。

(2)摇瓶发酵产异戊二烯

挑取步骤(1)获得的LWNOG1的白色单克隆(12h内长出的)在3ml LB(Cm+Amp+Kan,1‰) 中，于37℃摇床培养活化。菌液浓度为1.0左右转接至30ml LB(Amp+Cm+Kan)中进行扩 培，作为种子。

取扩培后的菌液按1％接种量接入100ml发酵培养基(K₂HPO₄·3H₂O 0.98g；一水合柠檬 酸0.21g；柠檬酸铁铵0.03g；MD牛肉粉0.9g；葡萄糖0.2g；MgSO₄(1M)200ul；微量元素 100μl((NH₄)6Mo₇O24·4H₂O 7.4g/L，ZnSO₄·7H2O 5.8g/L，H₃BO₄49.4g/L，CuSO₄·5H₂O 5g/L， MnCl₂·4H₂O 31.6g/L)；氨苄青霉素50μg/mL；氯霉素34μg/mL)，37℃摇菌，菌浓长至 1.0左右加入终浓度为0.5mM的IPTG，通入过滤后的氮气，加瓶塞，进行厌氧发酵。30℃， 180rpm摇菌。

对照菌LWIP1培养同上，仅抗生素为(Amp+Cm)。

(3)产物检测

发酵24-48h后，抽上层气体进行GC-MS检测异戊二烯。结果表明菌株LWPYC1可合成 4.5g/L，产率达22.5％，明显高于对照菌LWIP1(异戊二烯产量2.49g/L，产率12.5％)。检 测图谱将图2。

实施例3：5L发酵罐合成异戊二烯

M9种子培养基(/L)：20g葡萄糖，6g Na₂HPO₄，3g KH₂PO₄，1g NH₄Cl，0.5gNaCl， 0.24g MgSO₄，121℃高压蒸汽灭菌15min。

发酵培养基(/2L)：19.6g K₂HPO₄·3H₂O，4.2g citric acid·H₂O，0.6g柠檬酸铁铵，0.8ml 浓硫酸，40g葡萄糖，0.123mg(NH₄)₆Mo₇O₂·4H₂O，0.097mg ZnSO₄·7H₂O，0.823mg H₃BO₄， 0.083mg CuSO₄·5H₂O，0.527mg MnCl₂·4H₂O，4ml 1M MgSO₄，1900ml蒸馏水。

挑取菌株LWNOG1单克隆到50ml M9种子培养基中，37℃、180rpm活化过夜(18-24h)。 将种子按10％的接种量接种至含有2L发酵培养基的5L小型发酵罐中，转速400rpm，37℃ 培养至OD₆₀₀约为12时，添加终浓度为0.1-1mM的IPTG，关闭通气，并于25℃-37℃培养， 以氨水调pH，控制pH在7.0，每隔8h补加一次IPTG。得到的异戊二烯产物通过GC-MS 对其进行定性和定量分析。培养过程中对发酵液中残余葡萄糖进行检测，并通过变速流加浓 度为800g/L的糖液，维持残糖浓度在0.5g/L以下。每4h取发酵液5ml，测定细胞OD600、 葡萄糖浓度；每15min取尾气1ml,利用气相色谱检测产物异戊二烯和二氧化碳浓度。直到OD 不再变化，产物不再产生为止。对照菌为LWIP1。

结果表明菌株LWPYC1可合成24.7g/L，产率达26％，明显高于对照菌LWIP1(异戊二 烯产量18g/L，产率15％)。

实施例4：发酵产香叶醇

(1)E.coli重组菌株的构建

根据基因序列GenBank:AY362553.1合成香叶醇合成酶基因(GES)，并连入pGH载体上 形成pGH-GES载体。以pGH-GES为模版，GES-rbs-Bgl II和GES-xhol I为引物，PCR扩增， PCR扩增条件：98℃预变性30s；98℃变性5s，57℃退火5s，72℃延伸1min30s，以上变性、 退火、延伸三步重复进行35个循环后，72℃延伸10min。利用胶回收试剂盒(购自Fermentas， Cat.No.K0692)回收目的基因片段。

将回收的基因片段与pYJM26载体分别用BglII和XhoI进行双酶切，载体与外源片段按 摩尔比1:5的比例，4℃连接过夜或16℃连接4～6h，连接产物转化E.coli DH5α，然后涂布 加有34μg·mL-1氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒 pLWG1(pACY-mvaE-mvaS-GPPS2-GES)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。

将pLWG1、pYJM14(该质粒构建过程参见文献：Jianming Yang，Enhancing Production of  Bio-Isoprene Using Hybrid MVA Pathway and Isoprene Synthase in E.coli.PLoS ONE，2012，7 (4)：e33509)和pCOLA-fbp-Fxpk重组质粒共同热击转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞， 涂布于加有氯霉素、卡那霉素和氨苄霉素抗生素的LB固体平板，通过PCR筛选获得阳性克 隆，由此获得工程大肠杆菌LWNOG2。以只含质粒pLWG1和pYJM14的菌株LWG1作为对 照菌。

(2)发酵产香叶醇

M9种子培养基(/L)：20g葡萄糖，6g Na₂HPO₄，3g KH₂PO₄，1g NH₄Cl，0.5gNaCl， 0.24g MgSO₄，121℃高压蒸汽灭菌15min。

发酵培养基(/2L)：19.6g K₂HPO₄·3H₂O，4.2g citric acid·H₂O，0.6g柠檬酸铁铵，0.8ml 浓硫酸，40g葡萄糖，0.123mg(NH₄)₆Mo₇O₂·4H₂O，0.097mg ZnSO₄·7H₂O，0.823mg H₃BO₄， 0.083mg CuSO₄·5H₂O，0.527mg MnCl₂·4H₂O，4ml 1M MgSO₄，1900ml蒸馏水。

挑取单克隆到50ml M9种子培养基中，37℃、180rpm活化过夜(18-24h)。将种子按10％ 的接种量接种至含有2L发酵培养基的5L小型发酵罐中，转速400rpm，37℃培养至OD₆₀₀约为12时，添加终浓度为0.1-1mM的IPTG，25℃-37℃诱导表达，并按1:10的比例加入 肉豆蔻异丙酯，以氨水调pH，控制pH在7.0，同时停止通气。培养过程中对发酵液中残余 葡萄糖进行检测，并通过变速流加浓度为800g/L的糖液，维持残糖浓度在0.5g/L以下。每 4h取发酵液5ml，测定细胞OD600、葡萄糖浓度。当工程菌株诱导48h后，离心取有机层， 按1：10加入乙酸乙酯稀释，利用GC-MS定性检测。最终菌株获得了3g/L香叶醇，产率达 6％，对照菌LWG1获得了1.2g/L的香叶醇，产率为1.2％。检测图谱如图3所示。

实施例5：发酵产桧烯

(1)E.coli重组菌株的构建

将pHB7(Zhang et al.Microbial Cell Factories 2014,13:20)、pYJM14(Yang et al.，PLoS  ONE，2012，7(4)：e33509)和pCOLA-fbp-Fxpk重组质粒共同热击转化E.coli BL21(DE3) 感受态细胞，涂布于加有氯霉素、卡那霉素和氨苄霉素抗生素的LB固体平板，通过PCR筛 选获得阳性克隆，由此获得工程大肠杆菌LWNOG3。以只含质粒pLWG1和pYJM14的菌株 LWG1作为对照菌。

(2)发酵产桧烯

培养基：40％葡萄糖5mL、1mol/LMgSO4 200uL、微量元素100uL、抗生素100uL、 菌液1mL，置于37℃、180rpm摇床中震荡培养。1000×微量元素400mL中含有以下无机 盐：四水钼酸铵1.48g；七水硫酸锌1.16g；硼酸9.88g；五水硫酸铜1g；四水氯化锰6.32g。 加时按1‰的量加。菌液OD600至0.5左右时，补加20％的IPTG诱导，至终浓度为0.05～0.25 mM。同时加瓶塞，形成厌氧环境。将摇瓶转入28～37℃、100～160rpm摇瓶中培养12～24h， 利用气相-质谱测定桧稀。

经检测，菌株LWNOG3产率为1％；对照菌合成桧烯产率为0.1％。

实施例6：发酵产蒎烯

(1)E.coli重组菌株的构建

将pYJM27(Yang et al.Biotechnology for Biofuels 2013,6:60)和pYJM14(Jianming Yang， Enhancing Production of Bio-Isoprene Using Hybrid MVA Pathway and Isoprene Synthase in E. coli.PLoS ONE，2012，7(4)：e33509)和pCOLA-fbp-Fxpk重组质粒共同热击转化E.coli  BL21(DE3)感受态细胞，涂布于加有氯霉素、卡那霉素和氨苄霉素抗生素的LB固体平板，通 过PCR筛选获得阳性克隆，由此获得工程大肠杆菌LWNOG4。以只含质粒pLWG1和pYJM14 的菌株LWG1作为对照菌。

(2)发酵产蒎烯

培养基：40％葡萄糖5mL、1mol/LMgSO4 200uL、微量元素100uL、抗生素100uL、 菌液1mL，置于37℃、180rpm摇床中震荡培养。1000×微量元素400mL中含有以下无机 盐：四水钼酸铵1.48g；七水硫酸锌1.16g；硼酸9.88g；五水硫酸铜1g；四水氯化锰6.32g。 加时按1‰的量加。菌液OD600至0.5左右时，补加20％的IPTG诱导，至终浓度为0.05～0.25 mM。同时加瓶塞，形成厌氧环境。将摇瓶转入28～37℃、100～160rpm摇瓶中培养12～24h， 利用气相-质谱测定蒎烯。

经检测，菌株LWNOG4的产率为5.8％；对照菌合成桧烯产率为2.6％。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的 人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应 该以权利要求书所界定的为准。

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