法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2018-08-21
授权
授权
2015-01-14
实质审查的生效 IPC(主分类):C07K1/13 申请日:20140811
实质审查的生效
2014-12-24
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种以组氨酸-N-内羧酸酐为聚氨基酸单体,以具有末端氨基的多肽为引发剂,引发组氨酸-N-内羧酸酐的开环聚合,实现聚组氨酸链段与功能性多肽的共价偶联,并以聚组氨酸侧链咪唑基团与量子点壳层螯合连接,形成量子点-多肽复合物。本发明属于化学合成领域。
背景技术
在探索重要生物分子的高灵敏分析检测方法过程中,量子点技术被广泛应用于蛋白质及DNA检测、细胞标记成像、活细胞生命动态过程示踪、活体动物体内肿瘤细胞靶向示踪等生物医学领域。量子点在生命科学中得以广泛应用的前提是,其经过表面化学修饰后可与一个或多个生物靶向分子连接,进而形成集合自身特性和生物活性的生物复合物。
量子点与生物大分子连接的要求可控化、定向化,以获得稳定、高效、特异性强的量子点-多肽复合物。一般以化学反应引入量子点生物分子连接机制,以达到可控定向连接的目的。其中聚组氨酸可通过侧链咪唑基团与量子点壳层的金属阳离子产生螯合作用,作为量子点与多肽的定向连接的桥梁。天然蛋白质中很少含有聚组氨酸,且不会干扰蛋白质和量子点的功能,结合方式为定点连接,是发展量子点生物标记的有效途径。虽然聚组氨酸作为量子点生物标记桥梁取得了一定实际意义的研究成果,可将多肽连接于量子点,但其与功能性肽段连接方式须采用醛和胺的成腙反应,其过程复杂,成腙与成脎反应竞争激烈,产品成脎路径中,易分解为原底物导致连接臂断裂。
自上世纪80年代,由氨基酸-N-内羧酸酐(α-amino acid N-carboxyanhydrides,NCAs)开环聚合得到的氨基酸均聚物或共聚物在研究蛋白质的一二级结构关系中起到了及其重要的作用。所得氨基酸聚合物可形成α螺旋、β折叠、无规卷曲等结构,还可能通过分子内或分子间的相互作用形成超分子结构,这在生物医学和药物制剂中具有重要意义。另一方面,由于氨基酸-N-内羧酸酐在开环过程中存在脱羧驱动力,故反应条件温和、宽泛。热力学方面,氨基酸-N-内羧酸酐开环聚合产物稳定,选择性高,体系中基本无副产物,并可以通过调节单体与引发剂比例精确控制聚氨基酸聚合度。
无论是常见α-氨基酸还是少数β-氨基酸,均可以通过一般酰基化反应制得对应的氨基酸-N-内羧酸酐,这为精确合成指定聚合度的聚氨基酸提供了可靠的方法;也为抗原肽链涉及精确长度以及侧链基团的连接臂,提供了思路。这种设计思路即为:多肽末端氨基在溶液或者固态合成条件下,直接引发N-内羧酸酐开环脱羧,生成肿胺负离子作为活性引发位点,进一步引发体系中其他N-内羧酸酐单体开环,直至体系中环状单体消耗完毕。通过多肽末端氨基 引发N-内羧酸酐开环聚合,形成指定聚合度的聚氨基酸连接臂,以聚氨基酸基团与量子点外壳层的金属离子螯合,合成量子点-多肽复合物。上述过程见式1,此方法目前未见报道。
发明内容
本发明提供了一种量子点-多肽复合物的合成方法。通过多肽末端氨基引发组氨酸-N-内羧酸酐开环聚合,形成指定聚合度的聚组氨酸连接臂,以聚组氨酸侧链的咪唑基团与量子点外壳层的金属离子螯合,合成量子点-多肽复合物。在本发明中,多肽末端氨基在溶液或者固态合成条件下,直接引发组氨酸-N-内羧酸酐开环脱羧,生成肿胺负离子作为活性引发位点,进一步引发体系中其他组氨酸-N-内羧酸酐单体开环,直至体系中环状单体消耗完毕。
为了保证所连接功能性多肽的生物活性,组氨酸-N-内羧酸酐开环聚合过程所选用的溶剂为所述连接功能性多肽所能承受的有机溶剂体系。所述有机溶剂可以是二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、乙醇、甲苯中的一种或者几种。单体组氨酸-N-内羧酸酐与引发剂多肽的摩尔比值为2~200的整数,优选为4~20。聚组氨酸理论聚合度为2~200之间的整数,优选为4~20之间的整数。而所述多肽末端氨基可以为自然的伯胺基团,伯胺氮原子因其具有孤对电子具有路易斯碱性,可对靠近环侧链的羰基碳原子进行亲核进攻。根据对多肽末端氨基的保护要求以及特殊的溶剂极性要求,多肽末端的氨基也可以来源于保护基团去保护后形成的伯胺基。
本发明中所涉及的量子点,可以是本领域技术人员所能理解并实施的含有金属盐壳层的II-VI族或III-V族元素组成的三维纳米颗粒,例如CdSe/ZnS量子点。Cd类纳米颗粒与体材料相比,具有非常大的比表面积,表面具有较多的缺陷和悬键,量子点的光学性质较差。为了提高量子点的荧光量子产率以及增强其发光稳定性,常以宽带隙半导体微粒ZnS为壳层包覆。 ZnS作为壳层包覆时,其外层可以是进一步的金属盐壳层或者聚合物,连接臂碱性位点正是与包覆壳层中的Zn2+形成螯合,实现对量子点的连接。本发明中组氨酸侧链的咪唑基团由于2-位N原子带有富余孤对电子,易于进入包覆壳层中Zn2+的空d轨道,形成螯合作用,起到连接量子点的效果。本发明中所涉及的多肽,可以是本领域技术人员所能理解并实施的多肽。
本发明中所述引入聚组氨酸连接臂的多肽,其分子质量可用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)进行测试。当聚组氨酸连接臂理论聚合度>20时,采用凝胶渗透色谱测定引入聚组氨酸连接臂多肽的数均分子质量。
具体实施方式
用具体实施例来说明本发明的技术方案,但本发明的保护范围不限制于此。
组氨酸-N-内羧酸酐的制备
称取:3.103g组氨酸,2.8g三光气加入三口烧瓶。干燥的四氢呋喃加入三口烧瓶中。磁力搅拌器搅拌,微通氮气。油浴控制在65℃加热,使反应体系达到回流状态。约10至20min后反应液澄清透明,然后猛烈鼓吹氮气,约半小时。反应终止时液澄清透明淡黄色。迅速撤去油浴。趁热将反应液倒入搅拌中的250mL正己烷中。充分混合,有大量白色固体生成。粗产品以四氢呋喃和正己烷重结晶,呈微小针状白色粉末,过滤,真空干燥,产率:77.9%。
实施例1
猪肠毒素源性大肠杆菌K88ac粘附抗原-8单元组氨酸臂-量子点复合物的合成:
将猪肠毒素源性大肠杆菌K88ac粘附抗原0.01mol与组氨酸-N-内羧酸酐0.08mol混合于DMF溶液中,室温下搅拌1小时,期间持续向溶液通如氩气,反应液倒入正己烷中析出白色胶壮固体,过滤后真空干燥滤饼。
选用CdSe/ZnS壳层量子点,于室温下分散在磷酸盐缓冲液,量子点浓度0.1mol/L。以N-羟基硫代琥珀酸亚胺为活化剂,浓度为20mol/L,室温下摇床反应1小时,以中性乙腈洗涤,除去过量活化剂。将抗体多肽链-组氨酸臂:猪肠毒素源性大肠杆菌K88ac粘附抗原-His8臂,加入上述磷酸缓冲液,所得到的反应产物,在高速离心机8000转每分钟的转速下,离心1~2小时,弃去离心上清后,将沉淀分散在磷酸盐缓冲液中,得到猪肠毒素源性大肠杆菌K88ac粘附抗原-8单元组氨酸臂-量子点复合物,产率77%。
实施例2
乙型肝炎病毒核心抗原-300单元组氨酸臂-量子点复合物的合成:
将乙型肝炎病毒核心抗原0.001mol与组氨酸-N-内羧酸酐0.30mol混合于水/乙腈溶中, 室温下搅拌2小时,期间持续向溶液通如氩气,反应液倒入正己烷中析出白色胶壮固体,过滤后真空干燥滤饼。
选用CdSe/ZnS壳层量子点,于室温下分散在磷酸盐缓冲液,量子点浓度0.1mol/L。以N-羟基硫代琥珀酸亚胺为活化剂,浓度为20mol/L,室温下摇床反应1小时,以中性乙腈洗涤,除去过量活化剂。乙型肝炎病毒核心抗原-300单元组氨酸臂。加入上述磷酸缓冲液,所得到的反应产物,在高速离心机5000转每分钟的转速下,离心3小时,弃去离心上清后,将沉淀分散在磷酸盐缓冲液中,得到乙型肝炎病毒核心抗原-300单元组氨酸臂-量子点复合物,产率62.5%。
机译: 具有组氨酸磷酸酶生物学活性的多肽,编码该多肽的DNA。一种针对该多肽的抗体,含有该多肽的药物制剂
机译: 修饰的多聚核苷酸绝缘带,宿主细胞,分离的转基因非人类动物多肽,经过修饰以表达对ALK具有抗性的多肽突变体,与对ALK具有抗性的多肽突变体特异性结合的抗体,试剂盒p用于检测生物样品中对ALK抑制剂具有抗性的突变,以及用于评估生物样品为对ALK抑制剂具有抗性的突变的方法,用于诊断对至少一种对ALK抑制剂具有抗性或可能发展出抗性的癌症激酶小分子ALK,以评估Anto对ALK抑制剂具有抗性的突变的生物样品。用于诊断对至少一种激酶小分子ALK抑制剂具有抗药性或可能产生抗性的癌症,以评估该生物样品作为对ALK抑制剂有抗性的突变,即对狄诺司他抗性或可能对PF产生抗药性的癌症-02341066
机译: 胰岛素多肽低聚物缀合物和胰岛素原多肽低聚物缀合物的合成方法及其合成方法