调控FABP6基因的两个microRNA及其应用

摘要

本发明涉及与绵羊脂肪相关的分子标记的筛选及应用，具体涉及调控FABP6基因的两个microRNA及其应用。发明通过高通量测序和物信息学分析，筛选到调控FABP6基因的两个microRNA，所述的microRNA为miR-29692和ssc-miR-28-3p。进一步进行了分子生物学验证，结果显示miR-29692和ssc-miR-28-3p能有效抑制FABP6基因的表达。本发明公开的两个microRNA可以作为绵羊脂肪相关的分子标记，在遗传辅助育种中具有重要的实际应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及一种与绵羊脂肪酸相关的 分子标记的筛选及应用。

背景技术

绵羊育种中，伴随产肉效率的提高，肉产品的食用品质受到影响，降低了消 费者对肉品质的满意度。嫩度及风味是主要的肉质性状，与肌肉的脂肪酸含量和 组成有关，由微效多基因控制，遗传机理复杂；因性状之间的关联性，以传统的 表型选择难以改善肌肉脂肪酸特性，而利用与绵羊肌肉脂肪酸相关的分子标记， 进行分子标记辅助选择是有效改善肉质的育种方法。参与脂肪酸代谢的基因常用 于肉质性状标记的候选基因。

脂肪酸结合蛋白(fatty acid binding protein，FABPs)参与胞内脂肪酸运输，将 脂肪酸从细胞膜上运送至脂肪酸氧化和甘油三醋，磷脂的合成位点。按基因所表 达的组织或细胞划分，FABPs至少有9种不同的类型，大部分已经成为绵羊肉质 性状的主要候选基因。

miRNA是一类大小约21-23个核苷酸的RNA分子，一般来源于染色体的非 编码区域，由大约70nt大小的可形成发夹结构的前体加工而来，其作用是在转 录后水平上对基因表达产生抑制性作用。通过不断探索，人们逐渐揭示了miRNA 的生物功能：调节生物体内与机体生长、发育、疾病发生过程有关的基因的表达。 随着新一代测序技术的发展，人类对于miRNA在各种生理病理过程中的功能和 调控将会有进一步的认识。然而到目前为止，通过各种不同的实验方法和生物信 息学分析方法发现并证实的miRNA和靶标远远没有达到饱和程度。因此还有很 多潜在的miRNA有待我们去发现验证，并揭示作用的靶标，从而弄清这些非编 码RNA的生物功能。

绵羊对农业方面以及生物学研究来说极其重要，目前对肉用绵羊的遗传育种 研究还略显滞后，寻找与绵羊肌肉脂肪酸品质相关的miRNA分子标记对于遗传 标记辅助育种、改善肉用绵羊的品质具有重要作用。小尾寒羊(HanSheep)是冀、 鲁、预、苏、皖交界地区的一个优良绵羊品种，是当地劳动人民长期选育的地方 良种，具有适应性强，耐粗饲料，肌肉不发达，生长较缓慢，肌内脂肪含量高等 特点。道赛特羊(Dorset)是在澳大利亚和新西兰的肉用型羊，具有生长发育快、 瘦肉率高、肌内脂肪含量低等特点，但肉质欠佳。

本发明通过对上述两种绵羊的脂肪组织进行高通量miRNA测序，筛选与绵 羊肌肉脂肪酸相关的分子标记，经过生物信息学差异基因表达分析初步选定了调 控FABP6基因的两个microRNA，命名为miR-29692和ssc-miR-28-3p。进一步 进行了分子生物学实验验证结果显示本发明所述的两个microRNA可以作为绵 羊肌肉脂肪酸相关的microRNA分子标记。本发明还公开了用于检测所述分子标 记的检测试剂盒，具有重要的实际应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种绵羊育种分子标记miRNA，所述miRNA的靶标基 因是FABP6。

进一步，所述miRNA在优良肉用绵羊品种的脂肪组织中低表达；在普通肉 用绵羊品种的脂肪组织中高表达调控靶基因FABP6低表达。

本发明的目的是提供一种与绵羊肌肉品质相关的microRNA标志物。所述 microRNA为绵羊miR-29692。

本发明的目的是提供绵羊miR-29692序列SEQ IDNO 1：

UGGACCUGGGGCUCUGC。

本发明的目的是提供绵羊miR-29692的靶标基因，所述靶标基因为FABP6。

本发明的目的是提供miR-29692标志物的引物。

进一步，使用茎环法检测miR-29692标志物时，所用的反转录引物(RT primer) 的序列为序列表中SEQ ID NO 2；上游引物(Forward primer)为序列表中SEQ ID  NO 3；下游引物(Reverse primer)为序列表中SEQ ID NO 4。

进一步，使用茎环法检测miR-29692标志物时，可以采用探针法或染料法。

进一步，使用加尾法检测miR-29692标志物时，所用的上游引物(Forward  primer)为序列表中SEQ ID NO 5。

本发明制备的一种检测miR-29692表达水平的荧光定量PCR试剂盒组分包 括：反转录试剂、反转录引物、特异性引物、内参引物、荧光定量PCR反应液。 优选的还包括特异性探针。其中所述的反转录引物序列为SEQ ID NO 2；特异性 引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO 3，下游引物序列为 SEQ ID NO 4。

本发明制备的一种检测miR-29692表达水平的荧光定量PCR试剂盒组分包 括：反转录试剂、反转录引物、特异性上游引物、通用下游引物、内参引物、荧 光定量PCR反应液。其中所述的特异性上游引物序列为SEQ ID NO 5。

上述的试剂盒应用于绵羊肌肉组织中miR-29692的定量检测。

本发明的另一个目的是提供一种与绵羊肌肉品质相关的microRNA标志物。 所述microRNA为绵羊ssc-miR-28-3p。

本发明的目的是提供绵羊ssc-miR-28-3p序列SEQ ID NO 8：

CCUUGUGAGCUCUAUGCAAGGG。

本发明的目的是提供绵羊ssc-miR-28-3p的靶标基因，所述靶标基因为FABP6。

本发明的目的是提供ssc-miR-28-3p标志物的引物。

进一步，使用茎环法检测ssc-miR-28-3p标志物时，所用的反转录引物(RT  primer)的序列为序列表中SEQ ID NO 9；上游引物(Forward primer)为序列表 中SEQ ID NO 10；下游引物(Reverse primer)为序列表中SEQ ID NO 11。

进一步，使用茎环法检测ssc-miR-28-3p标志物时，可以采用探针法或染料 法。

进一步，使用加尾法检测ssc-miR-28-3p标志物时，所用的上游引物(Forward  primer)为序列表中SEQ ID NO 12。

本发明的目的是提供ssc-miR-28-3p标志物或其引物的应用。

为实现上述目的，本发明首先选取Dorset及HanSheep绵羊腹脂各5例，送 往测序公司进行高通量转录组测序，并对测序结果结合国际公认算法EBSeq进 行差异基因表达分析，通过分析挑选出表达差异明显的miR-29692和 ssc-miR-28-3p，序列为SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 8，进一步以miR-29692和 ssc-miR-28-3p为研究对象，通过搜索RNAhybrid数据库，预测出miR-29692和 ssc-miR-28-3p调控的靶基因——FABP6。

根据上述的miRNA的序列和FABP6的序列设计引物序列。

进一步采用RT-PCR方法检测45例Dorset绵羊、45例HanSheep绵羊脂肪组 织中miR-29692、ssc-miR-28-3p及FABP6的表达情况，结果显示Dorset绵羊脂 肪组织中miR-29692、ssc-miR-28-3p的表达明显高于HanSheep绵羊脂肪组织， 前者是后者的近3.23和3.58倍。

更进一步的miRNA对FABP6基因表达的抑制实验结果显示，单独的 miR-29692、ssc-miR-28-3p就能很好的负调控基因FABP6，二者联合能更好的负 调控基因FABP6。表明miR-29692、ssc-miR-28-3p可单独也可联合作为标志物应 用于绵羊肌肉品质相关的遗传育种中。

本发明的目的是提供用于检测上述microRNA标志物和/或检测上述靶标基 因FABP6的检测试剂盒。该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光 定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。

本发明还公开了miR-29692检测方法。

miR-29692检测可采用包括基于核苷酸杂交基础上的方法(如RNA印迹技 术、原位杂交技术、基于微球的流式细胞术和微阵列技术)、夹板连接法和基于 PCR基础上的方法(RNA加尾法、小靶点定量PCR和茎环法)等多种检测方法 进行检测。

RNA印迹技术(Northern blot)一般是先用聚丙烯酰胺电泳(PAGE)分离出总 RNA中长度约200bp以内的小RNA，然后转移至印迹膜上与标记的寡核苷酸探 针杂交，经洗膜显影后对条带进行分析。为了提高杂交反应的亲合性和检测灵敏 度，锁核酸(locked nucleic acid，LNA)探针被应用于microRNA的分析研究。实 验表明，在寡核苷酸探针中每引入1个LNA修饰碱基，其与相应的DNA杂交 时，解链温度会提高1℃-8℃，而在与RNA杂交时解链温度会提高2℃-10℃， 从而提高LNA探针与microRNAs分子的杂交特异性和灵敏度。

miRNAs原位杂交分析是用比色或荧光试剂等标记的核酸探针与细胞或组织 中的microRNAs进行杂交，通过显色或荧光成像检测microRNAs的表达，可直 观地展现microRNAs的时空表达模式。原位杂交技术能够显示miRNA表达的位 置，甚至达到细胞定位的水平，尤其适用于石蜡包埋或福尔马林固定后的标本。

基于微球的流式细胞术(bead-based flow-cytometry)，即液相芯片技术，这种 技术将流式细胞检测与芯片技术有机地结合在一起，使生物芯片反应体系由液相 ——固相反应改变为接近生物系统内部环境的完全液相反应体系。此法利用聚苯 乙烯微球作为反应载体，不同的微球由不同的荧光编码所标记，可被相应检测系 统所识别。微球上可连接核苷酸探针或者蛋白质，检测miRNA时连接的是长约 10-12nt的miRNA捕获探针，此探针与靶miRNA的3‘端互补配对，再加入8-10 nt的报告探针与miRNA的5’端反应。反应结束后，在检测系统中通过两束激光 逐一通过检测流场的微球探针上的分类荧光和报告探针上的标一记荧光进行检 测，从而实现对靶miRNA的定性和定量检测。

微阵列技术(microarray)也称生物芯片、DNA芯片或者基因芯片技术。一般 是在玻璃片等固体支持物上固定高密度已知序列的DNA探针，利用杂交原理， 使多种microRNAs目标分子与微阵列杂交，通过检测杂交信号强度及数据处理， 获得不同标本中特异microRNAs的表达谱，从而全面比较不同物种的不同器官 或组织以及正常和患病组织中microRNAs表达水平的差异。它的优点是高通量， 可以一次分析人的整个基因组，在10分钟内定量获得3万多个基因的表达。

夹板连接法需先设计一段与目标miRNA互补的脱氧核苷酸(桥连片段)，此片 段除了与目的miRNA互补段(3’端)外，其5’端还有一段14nt的外延片段。同时 设计一段与14m外延片段互补的脱氧核普酸(连接片段)，在其5’端用32^P进行标 记。退火时miRNA与连接片段同时与桥连片段互补配对，就产生了一个杂化双 链，其中一链中间有个缺口，即miRNA与连接片段的交界处。用T4DNA连接 酶将此缺口连上，就相当于用32^P对miRNA进行了标记。用磷酸酶除去游离的 32^P标记的连接片段，再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，对放射信号的强弱进行检测， 即可得到对应的miRNA量的信息。据称此方法比Northem blot简便、快速，也 更敏感，可用来进行大量标本的检测。

加尾法。miRNA的长度仅为22nt左右，几乎只相当于一个引物的长度，因 此不能用传统的RT-PCR方法进行检测。可用RNA加尾和引物延伸RT-PCR法 进行miRNA检测。首先提取总RNA，继提取小RNA，在小RNA3’末端由poly A 聚合酶加上一段poly A尾巴，然后用一个3’末端含有一段poly T的长引物将 miRNA逆转录成cDNA，所得到的cDNA的长度比较适合进行荧光定量PCR。

小靶点定量聚合酶链反应包括三个反应步骤：逆转录、DNA模板连接和连 接产物的PCR扩增，每个反应都被热失活所隔开。在逆转录反应时，miRNA被 特异引物逆转录生成cDNA，因各个miRNA之间至少可达到一个碱基的差别，而 差别处大多位于miRNA的3’端，因此引物的末端应尽量位于miRNA的3’端高 变区或附近，引物长度应尽量缩短。在第二步反应中，cDNA与两个寡核苷酸互 补配对，互补配对后，两个寡核苷酸之间的缺口可达到7个核苷酸的长度。每个 寡核苷酸都部分与cDNA配对，其余超出cDNA长度的部分露出在外，称为M13+。 缺口由T4DNA连接酶所填补，连接反应对缺口两端的碱基错配非常敏感，尤其 是3’端，所以应尽可能将缺口的3’端设置于miRNA高变区之外。在第三步反应 中，以连接产物作为模板，以M13+的正、反向引物作为PCR通用引物，与特异 的TaqMan探针一起，进行PCR扩增。由于逆转录和连接反应都以miRNA的中 心和3‘末端即区分miRNA成员的主要区域作为特异的靶标，且T4DNA连接酶 能够对碱基错配进行辨别，因而这种方法具有较高的特异性，交叉反应率低，可 作为定量检测短核苷酸的敏感的检测方法。

茎环法的特征是应用了一个单一的茎环状的引物，避免对目的miRNA进行 加尾。反应过程分两步。首先，茎环状引物与目的miRNA分子的3’端结合，引 物3’端与miRNA3’端有6个互补配对的核苷酸，然后用逆转录酶将之逆转录成 cDNA第一链。其次是PCR反应。cDNA第一链的茎环状结构打开后链的长度增 加了，以其为模板即可进行传统的荧光定量PCR。茎环状引物的茎部为双链结 构，防止引物与pre-miRNA或其他长链RNA的杂交；茎部的碱基堆积增强了 miRNA和DNA异质双链的亲合力，提高了逆转录的效率；且茎环状结构展开后 增加了miRNA的长度，为随后进行的PCR反应提供了合适的模板。

优选的，本发明公开了一种通过荧光定量检测miR-29692和/或ssc-miR-28-3p 表达水平的方法。

优选的，本发明公开了一种通过RT-PCR中的加尾法检测miR-29692表达水 平的方法。

进一步，所述加尾法检测miR-29692表达水平的步骤：(1)提取绵羊肌肉组 织中的小RNA；(2)通过poly(A)聚合酶和反转录酶进行miR-29692加尾和反转 录；(3)采用SEQ ID NO 5及市售适用于加尾法的荧光定量PCR试剂盒进行 miR-29692的扩增。

优选的，加尾法检测miR-29692表达水平的步骤：(1)提取绵羊肌肉组织中 的小RNA；(2)通过Qiagen的miScript II Reverse Transcription Kit(货号218161) 进行miR-29692加尾和反转录；(3)采用SEQ ID NO 5及Qiagen的miScript SYBR  GreenPCRKit(货号218073)进行miR-29692的扩增。

进一步，所述茎环法检测miR-29692表达水平的步骤：(1)提取绵羊肌肉组 织中的总RNA；(2)通过反转录引物SEQ ID NO 2在反转录酶的作用下进行 miR-29692反转录；(3)采用引物SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4及市售适用于茎 环法的荧光定量PCR试剂盒进行miR-29692的扩增。

优选的，本发明公开了一种通过RT-PCR中的加尾法检测ssc-miR-28-3p表达 水平的方法。

进一步，所述加尾法检测ssc-miR-28-3p表达水平的步骤：(1)提取绵羊肌 肉组织中的小RNA；(2)通过poly(A)聚合酶和反转录酶进行ssc-miR-28-3p加 尾和反转录；(3)采用SEQ ID NO 12及市售适用于加尾法的荧光定量PCR试剂 盒进行ssc-miR-28-3p的扩增。

优选的，加尾法检测ssc-miR-28-3p表达水平的步骤：(1)提取绵羊肌肉组 织中的小RNA；(2)通过Qiagen的miScript II Reverse Transcription Kit(货号 218161)进行ssc-miR-28-3p加尾和反转录；(3)采用SEQ ID NO 12及Qiagen 的miScript SYBR Green PCR Kit(货号218073)进行ssc-miR-28-3p的扩增。

进一步，所述茎环法检测ssc-miR-28-3p表达水平的步骤：(1)提取绵羊肌 肉组织中的总RNA；(2)通过反转录引物SEQ ID NO 9在反转录酶的作用下进 行ssc-miR-28-3p反转录；(3)采用引物SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11及市售 适用于茎环法的荧光定量PCR试剂盒进行ssc-miR-28-3p的扩增。

本发明还提供了miR-29692和/或ssc-miR-28-3p作为分子标记在遗传标记辅 助育种、改善肉用绵羊的品质中的应用。

进一步，所述miR-29692和/或ssc-miR-28-3p辅助育种、改善肉用绵羊的品 质中的应用，在目标肉用绵羊肌肉组织中miR-29692和/或ssc-miR-28-3p低表达， FABP6高表达。

miRNA及其前体定义

本发明提供了一类涉及绵羊肉质相关的miRNA。如本文所用，所述的 “miRNA”是一类长度约19～25个核苷酸的非编码单链小分子RNA，广泛存在于 植物、线虫、果蝇和哺乳动物等生物中，主要通过基本上互补的方式与编码蛋白 mRNA的3’-UTR区结合引起靶mRNA的降解、活性降低或翻译受抑，从而在 转录后水平对基因表达进行调控一类RNA分子。成熟的miRNA通常具有19～ 25个核苷酸(nt)(更特别的约19-22nt)，也不排除具有其它数目核苷酸的miRNA 分子。

miRNA可从前体miRNA(Precursor miRNA，Pre-miRNA)加工而来，所述的 前体miRNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构，所述的茎环结构长度一般在 50-100bp之间。所述的前体miRNA可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部 两侧包含基本上互补的两条序列。所述的前体miRNA可以是天然的或是人工合 成的。

前体miRNA可被剪切生成miRNA，所述的miRNA可与编码基因的mRNA 的至少一部分序列基本上互补。如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是 足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环 结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70％的核苷酸是 互补的；优选的，至少有80％的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90％的 核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95％的核苷酸是互补的；如98％、99％ 或100％。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷 酸；优选的，具有最多30个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多20个不匹 配的核苷酸；进一步优选的，具有最多10个不匹配的核苷酸，如具有1、2、3、 4、5、8、11个不匹配的核苷酸。

如本文所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可 形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的 两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至 少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的 两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、 缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形 式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相 互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常 在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该 核酸是否能形成茎环结构。

小RNA测序

小RNA是一类重要的体内调节分子，主要包括miRNA、piRNA和siRNA。 它的功能主要是诱导基因沉默，参与基因转录后调控，从而调节细胞生长、分化， 以及个体发育、生殖等重要生物学过程。小RNA测序技术采用胶分离技术，收 集样品中18-30nt的RNA片段，利用高通量测序技术，一次性获得单碱基分辨 率的数百万条小RNA序列信息，依托强大的生物信息分析平台，鉴定已知小RNA， 并预测新的小RNA及其靶标基因。

本发明还包括miRNA变体和衍生物。此外，广义上的miRNA衍生物也可 包括miRNA变体。本领域的普通技术人员可以使用通用的方法对miR-29692进 行修饰，修饰方式包括(但不限于)：甲基化修饰、烃基修饰、糖基化修饰(如2- 甲氧基-糖基修饰、烃基-糖基修饰、糖环修饰等)、核酸化修饰、肽段修饰、脂类 修饰、卤素修饰、核酸修饰(如“TT”修饰)等。

多核苷酸构建物

根据本发明所提供的miRNA序列，可设计出在被导入后可被加工成可影响 相应的mRNA表达的miRNA的多核苷酸构建物，也即所述多核苷酸构建物能够 在体内上调相应的miRNA的量。所述的多核苷酸构建物可被人细胞转录成前体 miRNA，所述的前体miRNA可被人细胞剪切且表达成所述的miRNA。

通常，所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载 体，它含有所述的miRNA，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还 含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于 构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技 术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因， 以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、 氨苄青霉素抗性。

本发明优点：

(a)本发明提供的miR-29692和/或ssc-miR-28-3p与绵羊肌肉品质具有很好 的相关性，可用于绵羊肌肉品质相关的辅助遗传育种中。

(b)本发明提供的检测miR-29692和/或ssc-miR-28-3p表达水平的荧光定量 PCR试剂盒包含了从RNA提取到荧光定量实验所用的整套试剂，既方便使用， 又保证了结果的一致性。

附图说明

图1.Real-time PCR检测绵羊脂肪组织中miR-29692的相对表达量。

图2.Real-time PCR检测绵羊脂肪组织中ssc-miR-28-3p的相对表达量。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解 为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和 宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范 围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常 按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1高通量转录组测序寻找不同品种绵羊脂肪组织中表达谱差异的 microRNA

选5例Dorset及5例HanSheep绵羊分别取他们的腹脂，组织标本自取出后 分成小块速冻于液氮30秒，然后储存于-70℃冰箱。随后低温送往测序公司进行 小RNA测序。

运用Fast-QC(http：//www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)软件对 测序数据的质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布，质量值的位置分布， GC含量，PCRduplication含量，kmer的frequency等。

将成熟小RNA分析结果的counts数加和小于10的删除，再采用结合国际公 认算法EBSeq进行差异筛选。其中logFC＞1或LogFC＜-1，FDR＜0.05。通过分析 最终挑选出表达差异明显的miR-29692和ssc-miR-28-3p，序列为SEQ ID NO 1 和SEQ ID NO 8，通过搜RNAhybrid数据库，预测出他们调控的靶基因为FABP6。

实施例2Real-time PCR检测绵羊脂肪组织中miR-29692、ssc-miR-28-3p及 FABP6的表达

试剂：

反转录试剂盒：SG One-Step miRNA RT Kit，#33-30120，SinoGene

PCR Mix：2×SG PCR MasterMix，#33-10201，SinoGene

qPCR试剂：2×SG Green qPCR Mix(with ROX)，#22-10102，SinoGene

相关实验物品的去Rnase的处理：

①将所有玻璃器皿应用前均用DEPC冲洗侵泡，120℃高压20min，180℃高 温烤干2小时以上。

②将塑料器皿(如：EP管/枪头)使用前需用0.1％DEPC水侵泡过夜，后控干液 体，120℃高压20min，烤箱烤干备用。

选取45例Dorsetp绵羊脂肪组织、45例HanSheep绵羊脂肪组织，编码后随 机选择提取RNA。

miRNA提取：

(1)从液氮中分别取出冻存绵羊脂肪组织，称重，分别放入离心管中，按50-100mg 组织/ml Trizol的量加入Trizol，组织体积不能超过Trizol体积的10％，充分匀浆 约1-2min；

(2)组织加入Trizol后，15-30℃孵育5min，使其充分裂解；

(3)加入1/10体积的miRNA匀浆添加剂，漩涡数下混合均匀，冰上放置10分钟； (4)向裂解物中加入同体积的三氯甲烷，漩涡30-60s混匀；

(5)室温最大转速(10000g)离心5分钟，使水相有机相分离，中间相析出；中间相 如果没有析出，再次离心；

(6)小心吸取上层水相至新的收集管中，记录水相体积；

(7)向收集管中加入1/3体积的无水乙醇，漩涡或颠倒数下混匀；

(8)将裂解液/乙醇混合液加入过滤芯过滤，过滤芯放入新的收集管中，每个样本 用一个过滤芯；

(9)用移液管将上步中的混合液移入过滤芯，一次可容纳体积700μl。超过700μl 继续用同样的过滤芯再次过滤；

(10)10000g离心15s使液体通过滤芯；

(11)收集滤液，如果裂解液/乙醇体积多于700μl，继续过滤时用新的收集管，直 到所有裂解液/乙醇混合液过滤完毕，收集过滤液，记录体积；

(12)向上一步中收集到的过滤液中加入2/3体积的室温无水乙醇；

(13)将过滤液/乙醇混合液加入第二个过滤芯中过滤，弃去过滤液，每个样本用一 个过滤芯，将过滤芯放入提供的收集管中；

(14)用移液管将上步中的混合液移入过滤芯，一次可容纳体积700μl时。超过 700μl继续用同样的过滤芯再次过滤；

(15)10000g离心15s使液体通过滤芯；

(16)弃去过滤出的液体，留过滤芯用于下一步洗脱；

(17)向过滤芯中加入700μl的miRNA洗液1(工作液中加入乙醇)，离心5-10s，弃 去洗脱出的液体，收集管继续使用；

(18)向过滤芯中加入500μl的miRNA洗液2/3(工作液中加入乙醇)，离心5-10s， 弃去洗脱出的液体；

(19)重复上一步骤；

(20)将过滤芯放入新的收集管(试剂盒中提供)中。向过滤芯中心加入100μl 95℃ 预热的洗脱液或不含核酸酶的水，最大转速离心20-30s收集RNA溶解液。

miRNA的RT-PCR体系的配制：

2×SG Green qPCR Mix 10μl Forward Primer(10μM) 0.4μl Reverse Primer(10μM) 0.4μl ROX 0.4μl cDNA 1μl Water，nuclease-free 7.8μl Total volμme 20μl

miRNAs的表达检测每次设置3个平行管反应，以U6作为内参。

PCR程序：

95℃10min；45个循环(95℃15s，60℃15s，72℃45s)；95℃15s，60℃30s， 95℃15s。

统计学分析

采用OriginPro8.1软件进行分析。统计方法均数间比较采用t检验，P＜0.05(差 异显著)和P＜0.01(差异非常显著)定为有统计学意义，分析不同品种绵羊脂肪 组织样本中miR-29692和ssc-miR-28-3p和FABP6的表达水平，结果如图1、图 2及表1显示：miR-29692和ssc-miR-28-3p在Dorset绵羊脂肪组织中的表达都 明显高于HanSheep绵羊肌肉组织，其中miR-29692在Dorset绵羊脂肪组织中的 表达是HanSheep绵羊肌肉组织的3.23倍，hr1_3855_mature@ssc-miR-28-3p在 Dorset绵羊脂肪组织中的表达是HanSheep绵羊肌肉组织的3.58倍。

表1miRNA相对表达量统计结果

样本 chr13_29692 ssc-miR-28-3p 小尾寒羊 1.057±0.0895 1.000±0.1353 道赛特羊 3.23±0.3002 3.577±0.2341

实施例3两种miRNA对FABP6基因表达的抑制

1.质粒的构建及miRNA的合成

载体质粒为pcDNA3.1，通过EcoRI及NotI将GFP连接到载体上，再通过酶 切位点为XhoI及XbaI将FABP6基因3’UTR连到载体上形成载体pcDNA3.1- GFP-3’UTR。3’UTR序列是指从FABP6基因终止密码子后的第一个碱基开始到 mRNA最后一个碱基。送公司合成miR-29692和ssc-miR-28-3p，将公司合成的 miRNA mimics稀释到备用。

2.GFP报告基因实验

转染前一天以每孔约2.5×10⁵个/mL的密度将小鼠成纤维细胞接种于24孔板， 用含有10％胎牛血清的DMEM培养液，37℃、5％CO₂和饱和湿度下过夜培养细 胞至70％-80％汇合时，吸除细胞培养液，细胞用预热至37℃的PBS缓冲液洗涤 2次后进行转染，各孔取载体pcDNA3.1-GFP-3’UTR，200ng-500ng，100nM合 成的miRNA混匀，用100μL无抗无血清的DMEM稀释后，同时用100μL无抗 无血清的DMEM稀释脂质体2000(Lipo-fectamin(TM)2000)转染试剂，按1∶2.5 的比例，将含载体、合成的miRNA和脂质体的DMEM充分混合，室温下孵育 20min以形成复合物；将复合物加入细胞，轻轻混匀，37℃、5％CO₂培养箱孵 育5h，更换含有2％的胎牛血清DMEM培养液。在转染后24h、48h后荧光显 微镜下观察，根据相同视野中共转染细胞培养中GFP阳性细胞数量及荧光强度 减少程度进行判断。

3.结果

在转染后24h，转染的细胞中开始出现荧光阳性细胞；转染后48h的荧光显 微镜观察结果显示：相对于仅转染载体pcDNA3.1-GFP-3’UTR的阳性对照，转 载体pcDNA3.1-GFP-3’UTR+合成的miRNA(miR-29692或ssc-miR-28-3p)的 转染细胞培养中的GFP阳性细胞数均有下降，而转载体pcDNA3.1-GFP-3’UTR+ 合成的miRNA(miR-29692和ssc-miR-28-3p)的转染细胞培养中的GFP阳性细 胞数下降最显著。

实施例4一种miR-29692的检测试剂盒(加尾法)

小RNA提取试剂盒：mirVana^TM miRNA Isolation Kit

反转录及RT-PCR：

实施例5一种miR-29692的检测试剂盒(茎环法)

总RNA提取试剂：TRIzol，美国Invitrogen公司

反转录及RT-PCR：

实施例6一种ssc-miR-28-3p的检测试剂盒(加尾法)

小RNA提取试剂盒：mirVana^TM miRNA Isolation Kit

反转录及RT-PCR：

实施例7一种ssc-miR-28-3p的检测试剂盒(茎环法)

总RNA提取试剂：TRIzol，美国Invitrogen公司

反转录及RT-PCR：

本发明采用生物信息学方法成功的对高通量测序结果进行分析，筛选出可用 于肉用绵羊遗传辅助育种的分子标记miR-29692，并提供了检测miR-29692表达 水平的荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒包含了从RNA提取到反转录到荧光定 量实验所用的整套试剂，既方便使用，又保证了结果的一致性，具有很好的应用 前景。