一种提高脂肪酶酯化活力及重复利用的方法

摘要

本发明提供了一种油脂加工方法，该方法包括将油脂与酰基供体、脂肪酶和氯化钙接触，进行酯化的步骤。该方法不需要对固定化载体进行额外的处理，只需将氯化钙添加入油脂中，后续进行分离，方法简单，便于生产操作，而且能够明显提高液体脂肪酶的酯化活性，能够提高液体脂肪酶的重复利用次数，节约成本。

说明书

技术领域

本发明涉及食用油脂加工领域，更具体地涉及脂肪酶用于油脂加工，特别涉及提 高液体脂肪酶酯化活力及重复利用的方法。

背景技术

为了保证油脂在后期使用过程中无酸败味道，在煎炸过程中不会产生大量的油 烟，所以在油脂精炼过程中必须对油脂进行脱酸处理，从而使得油脂的各项指标符合 国标规定。因此对于高酸值油脂，在碱炼的过程中就必须加入大量的碱进行中和游离 脂肪酸，但是在加入碱之后在降低游离脂肪酸的同时会导致有益的微量成分大量损 失，降低了其价值，而且还能造成中性油的损失。

对于高酸值油脂而言，如何将油脂中的游离脂肪酸降低而同时保留有益的微量成 分是一技术难题。以米糠油为例，由于米糠中存在脂肪酶，如果米糠不能及时处理， 则米糠中的油脂很容易被脂肪酶水解为游离脂肪酸，从而造成稻米油的酸价升高，酸 价可以达到15-80mgKOH/g，限制了稻米油的加工和利用。油脂工业中常用的碱炼脱 酸和物理脱酸方法用于高酸值米糠油都存在损耗过高的问题，化学精炼还会造成油脂 中谷维素等营养成分的大量损失，此外还将产生大量的有机废水，污染环境。

对于含油大量游离脂肪酸的稻米油来说，能够将其中的游离脂肪酸酯化转变为甘 三酯是增加产量，提高其利用率的最佳途径。在酯化过程中，常用的酯化方法分为化 学酯化和生物酯化两种。由于化学酯化需要高温，对油脂中活性物质如维生素E、甾 醇等破坏严重，而且会产生大量污染环境的废水等，因此在实际生产中无法应用。而 生物酯化是利用脂肪酶的高效催化活性在低温情况下催化酯化，同时无废水产生。现 在常用的脂肪酶为诺维信公司的固定化脂肪酶Novozymes435、Lipozyme RM IM、 Lipozyme TL IM，而这些固定化脂肪酶在使用过程中主要是经济成本过高，不太适合 用于高酸值油脂的生物脱酸过程。除了固定化脂肪酶还有液体脂肪酶也可以用于高酸 值油脂的生物酯化脱酸过程，对于液体脂肪酶在酯化过程的应用有些学者也进行了研 究。

Marchetti J M等公开了(Marchetti J M,Errazu A F.Comparison of different  heterogeneous catalysts and different alcohols for the esterification reaction of oleic acid[J]. Fuel,2008,87(15):3477-3480.采用液体脂肪酶CALB(南极假丝酵母脂肪酶B)进行 催化油酸和醇的酯化反应，在这些反应较为容易的体系中经过25h的反应游离脂肪酸 的转化率为95％左右。但作者在结论中同时也指出，对于高酸值的油脂利用液体脂肪 酶进行酯化，由于无法重复利用而造成生产成本昂贵。

由于液体脂肪酶CALB在使用过程中比较昂贵，因此有人研究将其固定化，降低 生产成本，例如：

Tufvesson P等公开了(Tufvesson P,U,Carvalho J,et al.Towards a  cost-effective immobilized lipase for the synthesis of specialty chemicals[J].Journal of  Molecular Catalysis B:Enzymatic,2011,68(2):200-205.)将液体脂肪酶CALB进行固定 化的技术。Tufvesson P等选用粒径为250-500μm的载体MP1000分别用乙醇(3ml/g) 和磷酸钠缓冲液清洗后加入液体脂肪酶CALB，震荡搅拌8h后分离液体，再次用缓 冲液冲洗去除游离蛋白脂肪酶，然后在真空状况下干燥12h后得到成品。

CN101736000B中公开了一种提高固定化脂肪酶活性和稳定性的方法。其固定化 方法主要为：用1mol/L HCl将载体于室温下浸泡3h后水洗至中性，然后将1g经预处 理的固定化载体加入30～50ml酶液中，于30℃、150rpm振荡吸附2h，过滤分离得 湿固定化酶，于4℃放置24h，在20～50ml极性有机溶剂中加入1g湿固定化酶，于 25～35℃、150rpm振荡处理1～1.5h，抽滤得处理过的固定化酶，于4℃放置24h后 得到成品。

上述专利和文献通过各种工艺研究脂肪酶的酯化活性及提高利用率。但由于液体 脂肪酶在油脂的酯化过程中由于脂肪酶是水溶性蛋白质，而游离脂肪酸为油溶性物 质，从而造成二者不能完全接触，酯化活性低，反应时间太长；此外，为了提高脂肪 酶的重复利用率而采用的固定化技术对载体进行多次的化学处理，处理过程步骤多， 过程繁琐，从而造成生产效率低。

因此，有必要对脂肪酶的酯化工艺加以改进。

发明内容

本发明提供了一种油脂加工方法，该方法不需要对固定化载体进行额外的处理， 只需将氯化钙添加入油脂中，后续进行分离，方法简单，便于生产操作，而且能够明 显提高液体脂肪酶的酯化活性，能够提高液体脂肪酶的重复利用次数，节约成本。

本发明提供方法包括以下步骤：

将所述油脂与酰基供体、脂肪酶和氯化钙接触，进行酯化。

在本发明的一个实施方案中，使用的油脂为高酸价油脂。在本发明的一个实施方 案中，使用的高酸价油脂优选为高酸价稻米油、高酸价棉籽油、高酸价鱼油、和/或高 酸价棕榈油。

在本发明的一个实施方案中，使用的酰基供体为甲醇、乙醇、乙二醇、丙醇、丙 三醇、甘油、单甘脂、甘二酯、正己醇、异丙醇、正丁醇和/或苯酚，优选为甘油、单 甘脂和/或甘二酯。

在本发明的一个实施方案中，使用的脂肪酶为液体脂肪酶，优选为Lipase CALB、 Lipase PALATASE100L、或Lipase TL100L。

在本发明的一个实施方案中，以所述油脂重量计，所述脂肪酶的加入量为 523.6-5236U/100g油脂，优选加入1570.8-4188.8U/100g油脂。

在本发明的一个实施方案中，以所述油脂重量计，所述氯化钙的加入量为 1-10wt％，，优选为加入2-8wt％，更优选为加入3-5wt％。

本发明还提供了一种油脂酯化方法，该方法包括在进行酯化前，将所述油脂与酰 基供体、脂肪酶和氯化钙接触。

在本发明的一个实施方案中，使用的油脂为高酸价油脂。在本发明的一个实施方 案中，使用的高酸价油脂优选为高酸价稻米油、高酸价棉籽油、高酸价鱼油、和/或高 酸价棕榈油等。

在本发明的一个实施方案中，使用的酰基供体为甲醇、乙醇、乙二醇、丙醇、丙 三醇、甘油、单甘脂、甘二酯、正己醇、异丙醇、正丁醇和/或苯酚，优选为甘油、单 甘脂和/或甘二酯。

在本发明的一个实施方案中，使用的脂肪酶为液体脂肪酶，优选为Lipase CALB、 Lipase PALATASE100L、或Lipase TL100L。

在本发明的一个实施方案中，以所述油脂重量计，所述脂肪酶的加入量为 523.6-5236U/100g油脂，优选加入1570.8-4188.8U/100g油脂。

在本发明的一个实施方案中，以所述油脂重量计，所述氯化钙的加入量为 1-10wt％，优选为加入2-8wt％，更优选为加入3-5wt％。

本发明还提供了一种脂肪酶组合物，该组合物包括脂肪酶与氯化钙。

在本发明的一个实施方案中，以所述氯化钙的重量计，所述脂肪酶的加入量为 52.36-5236U/g氯化钙，优选为261.8-1570.8U/g氯化钙。

本发明还提供了一种油脂加工方法，该方法包括将上述的脂肪酶组合物与所述油 脂和酰基供体接触，进行酯化。

本发明还提供了一种油脂酯化方法，该方法包括在进行酯化前，将所述油脂与酰 基供体、上述的脂肪酶组合物接触。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的技术方案和有益效果，下文结合实施例对本发明的优选 实施方式进行了更详细地说明。应当理解，这些说明仅为示例性的，而不应理解为以 任何方式对本发明构成限制。

本文所公开的“范围”以下限和上限的形式，例如一个或多个下限与一个或多个上 限的形式给出。给定范围可通过选择一个下限和一个上限来进行限定，选定的下限和 上限限定了给定范围的边界。所有以这种方式限定的范围是包含和可组合的，即任何 下限可与任何上限组合形成一个范围。例如，针对特定参数列出了60-110和80-120 的范围，理解为60-120和80-110的范围也是可预料到的。此外，如果列出的下限为 1和2而列出的上限为3，4和5，则下面的范围都是可预料到的：1-3、1-4、1-5、2-3、 2-4和2-5。

在本文中，除非有其他说明，数值范围“a-b”表示a到b之间的任意实数组合的缩 略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“0-5”表示本文中已经全部列出了“0-5” 之间的全部实数，“0-5”只是这些数值组合的缩略表示。

在本文中，除非有其他说明，术语“其组合”或“它们的组合”表示所列出的各选择 要素的任意组合，例如两种、三种、四种以及直到最大可能数量的选择要素的组合， 如混合物。

如果没有特别指出，本说明书所用的术语“一种(个)”指“至少一种(个)”。

在本文中，除非有其他说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方式可以 相互组合形成新的技术方案。

在本文中，除非有其他说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互 组合形成新的技术方案。

在本文中，除非有其他说明，术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”和类似措词 表示开放式，但是也应当理解为同时明确公开了封闭式的情形。例如，“包括”表示还 可以包含没有列出的其他要素，但是也同时明确公开了仅包括所列出的要素的情形。

在本文中，除非有其他说明，实施例中记载的具体步骤、具体数值以及具体物质 可与说明书其它部分的其他特征结合。例如，说明书发明内容或具体实施方式部分提 到反应的温度为10-100℃，而实施例记载的具体反应温度为20℃，那么可以认为本文 已经具体公开了10-20℃的范围，或者20-100℃的范围，且该范围可以与说明书其它 部分的其他特征结合起来形成新的技术方案。

本发明的发明人在研发过程中发现，在利用脂肪酶进行酯化过程中，普遍存在酯 化活性低，反应时间长，固定化步骤繁琐等缺点，因此，有必要对现有利用脂肪酶进 行酯化的方法进行改进。发明人通过研发发现，在利用脂肪酶进行油脂脱酸酯化过程 中加入氯化钙，不仅能够明显提高液体脂肪酶的酯化活性，而且能够提高液体脂肪酶 的重复利用次数，节约成本。同时该方法能够避免对固定化载体进行多久的处理，只 需将氯化钙添加入油脂中，后续进行分离，方法简单，便于生产操作。

基于此，发明人提供了一种油脂加工方法，该方法包括以下步骤：

将所述油脂与酰基供体、脂肪酶和氯化钙接触，进行酯化。

在本发明中，使用的油脂为动物油脂和/或植物油脂。

在本发明的一个实施方案中，使用的油脂为高酸价油脂。

在本发明的一个实施方案中，使用的高酸价油脂优选为高酸价稻米油、高酸价棉 籽油、高酸价鱼油、和/或高酸价棕榈油。

在本发明的一个实施方案中，使用的酰基供体为甲醇、乙醇、乙二醇、丙醇、丙 三醇、甘油、单甘脂、甘二酯、正己醇、异丙醇、正丁醇和/或苯酚，优选为甘油、单 甘脂和/或甘二酯。

在本发明的一个实施方案中，使用的脂肪酶为液体脂肪酶，优选为Lipase CALB、 Lipase PALATASE100L、或Lipase TL100L。

在本发明的一个实施方案中，以所述油脂重量计，所述脂肪酶的加入量为 523.6-5236U/100g油脂。发明人发现，当脂肪酶的加入量为1570.8-4188.8U/100g油脂 时，高酸价稻米油的利用率，保留稻米油的营养价值等方面的效果更为明显，因此， 在本发明的一个实施方案中，以所述油脂重量计，所述脂肪酶的加入量优选为 1570.8-4188.8U/100g油脂。

在本发明的一个实施方案中，以所述油脂重量计，所述氯化钙的加入量为 1-10wt％，综合考虑酯化效率、生产操作等因素，氯化钙的加入量优选为加入2-8wt％， 更优选为加入3-5wt％。

在本发明的一个实施方案中，所述油脂中游离脂肪酸与所述酰基供体的摩尔比为 5:1-1:2优选为3:1-1:1。

本发明还提供了一种油脂酯化方法，该方法包括在进行酯化前，将所述油脂与酰 基供体、脂肪酶和氯化钙接触。

在本发明中，使用的油脂为动物油脂和/或植物油脂。

在本发明的一个实施方案中，使用的油脂为高酸价油脂。在本发明的一个实施方 案中，使用的高酸价油脂优选为高酸价稻米油、高酸价棉籽油、高酸价鱼油、和/或高 酸价棕榈油。

在本发明的一个实施方案中，使用的酰基供体为甲醇、乙醇、乙二醇、丙醇、丙 三醇、甘油、单甘脂、甘二酯、正己醇、异丙醇、正丁醇和/或苯酚，优选为甘油、单 甘脂和/或甘二酯。

在本发明的一个实施方案中，使用的脂肪酶为液体脂肪酶，优选为Lipase CALB、 Lipase PALATASE100L、或Lipase TL100L。

在本发明的一个实施方案中，以所述油脂重量计，所述脂肪酶的加入量为 523.6-5236U/100g油脂，优选加入1570.8-4188.8U/100g油脂。

在本发明的一个实施方案中，以所述油脂重量计，所述氯化钙的加入量为 1-10wt％，优选为加入2-8wt％，更优选为加入3-5wt％。

在本发明的一个实施方案中，所述油脂中游离脂肪酸与所述酰基供体的摩尔比为 4:1-1:2，优选为3:1-1:1。

本发明还提供了一种脂肪酶组合物，该组合物包括脂肪酶与氯化钙。

在本发明的一个实施方案中，以所述氯化钙重量计，所述脂肪酶的加入量为 52.36-5236U/g氯化钙，优选为261.8-1570.8U/g氯化钙。

本发明还提供了一种油脂加工方法，该方法包括将上述的脂肪酶组合物与所述油 脂和酰基供体接触，进行酯化。

本发明还提供了一种油脂酯化方法，该方法包括在进行酯化前，将所述油脂与酰 基供体、上述的脂肪酶组合物接触。

在本发明中，术语“油脂”具有本领域通常接受的含义，特别是表示植物或动物 来源的以高级脂肪酸甘油酯为主要成分的混合物，例如，可以包括但不限于，茶籽油、 稻米油、棉籽油、蓖麻油、玉米油、棕榈油、菜籽油、鲸鱼油、牛脂、奶油、大豆油、 红花籽油、亚麻油、杏仁油葵花籽油、芝麻油、玉米胚芽油、橄榄油、花生油、椰子 油、棕榈仁油、猪油、鱼油等等。适用于本发明工艺的油脂优选为高酸价油脂，例如 可以包括但不限于高酸价稻米油、高酸价棕榈油、高酸价鱼油、高酸价棉籽油等。

在本发明中，术语“高酸价油脂”指的是采用国标GB/T5530-2005《动植物油脂 酸值和酸度测定》滴定法测得酸价大于等于5mgKOH/g，例如酸价高于2mgKOH/g的 油脂，优选酸价高于5mgKOH/g的油脂。在本发明中，“高酸价油脂”包括但不限于 高酸价的稻米油、棕榈油、鱼油、棉籽油、大豆油、菜籽油、茶油、葵籽油、玉米油 等。

在本发明中，术语“酰基供体”指的是含油羟基的烷烃类，例如，包括但不限于 甲醇、乙醇、乙二醇、丙醇、丙三醇、甘油、单甘脂、甘二酯、正己醇、异丙醇、正 丁醇、苯酚等。

在本发明中，术语"脂肪酶"指的是任何能够催化酯交换反应或酯化反应的酶，在 本发明中，术语“液体脂肪酶”指的是含有脂肪酶的液体，例如包括但不限于：包含 脂肪酶的溶液(例如商品化销售的脂肪酶酶活或其稀释液)，表达脂肪酶的菌株或重 组菌株的发酵液、发酵上清液等。在本发明中，使用的脂肪酶可以使用菌株发酵表达 的脂肪酶，例如包括但不限于：假丝酵母南极脂肪酶(Candida antarctica lipase)、 thermomyces lanuginosa脂肪酶、荧光假单胞菌脂肪酶(pseudomonas fluorescens lipase)、 假单胞杆菌脂肪酶(pseudomonas cepacia lipase)、chromobacterium viscosum脂肪酶、 P.aeruginosa脂肪酶、P.fluorescens脂肪酶、Pseudomonas脂肪酶、B.cepacia脂肪酶、 C.viscosum脂肪酶、Bacillus subtilis脂肪酶、Achromobacter sp.脂肪酶、Alcaligenes 脂肪酶和Serratia marcescens脂肪酶以及来自真菌的C.antarctica B脂肪酶和C.rugosa 脂肪酶等，也可以使用商品化销售的脂肪酶，例如包括但不限于：Lipase A"Amano"6、 Lipase AY"Amano"30SD、Lipase G"Amano"50、Lipase R"Amano"、Lipase DF "Amano"15、Lipase MER"Amano"、Newlase F、Lipase CALB、Lipase PALATASE100L、 或Lipase TL100L等。

在本发明中，油脂与酰基供体、脂肪酶和氯化钙接触，既可以将油脂、酰基供体、 脂肪酶、氯化钙一同混合，也可分别混合，例如，将油脂、酰基供体混合后，再与脂 肪酶、氯化钙一同混合；或使脂肪酶和氯化钙接触，然后再与油脂、酰基供体接触； 或向油脂中分别加入酰基供体、脂肪酶和氯化钙，也可采用本领域的技术人员所熟知 或方便使用的方式，使油脂与酰基供体、脂肪酶和氯化钙接触。

在本发明中，酯化反应为酶法酯化，具体工艺为本领域的技术人员所熟知或可通 过实验确定。例如，在本发明的一个实施方案中，酯化反应的反应温度为30-100℃， 优选为50-90℃。在本发明的一个实施方案中，酯化反应于真空度小于5000Pa条件下 进行，优选在小于3000Pa条件下进行，更优选在小于1000Pa条件下进行。

为了使表述更加简洁，在说明书中本发明的各种优选实施方式是分开单独描述 的，但是本领域技术人员可以理解，在不相矛盾的情况下，各优选实施方式的技术特 征可以重新组合形成其它的或者更进一步优选的实施方式，这些实施方式应当视为已 经被本文明确公开并且落入本发明的保护范围内。

实施例

以下通过实施例对本发明作了示例性的描述，应当理解这些实施例仅用于说明目 的而不构成对本发明的限制。

在本发明的下述实施例中，使用的高酸值稻米油采用罗晓岚,朱文鑫.浸出米糠 油精炼工艺及难点分析[J].中国油脂,2008,33(11):57-60.的方法制备，经检测，其酸 价为28.72mgKOH/g；使用的原料稻米油通过市场购买获得。

在本发明的下述实施例中，使用的CALB购自诺维信(中国)投资有限公司济南 分公司创新与发展中心。

在本发明的下述实施例中，碱炼脱酸的具体方法为：取100g高酸价稻米油，搅 拌加热至80℃，然后在半小时内缓慢加入理论计算的浓度为10％的KOH溶液，之后 在8000rpm转速下离心分离皂脚和油脂，将分离的油脂水洗三次，然后干燥脱水即为 碱炼脱酸稻米油。

在本发明的下述实施例中，酸价的检测方法为：GB/T5530-2005《动植物油脂酸 值和酸度测定》；

酯化率的计算方法如下：

酯化率＝(AV₀-AV₁)/AV₀

其中：AV₀为酯化前AV；AV₁为酯化反应后AV。

在本发明的下述实施例中，CALB液体脂肪酶的酶活测定方法为丁酸丁醇法，具 体过程如下：

底物：丁酸丁醇正庚烷混合物，其中丁酸浓度为0.16M和丁醇浓度为0.33M。

底物配制方法：将1.35ml丁酸(butyric acid)和2.7ml丁醇(butanol)溶于85.95ml 正庚烷(n-heptane)混匀即可。

酯化反应过程

取两个50ml具塞三角瓶，分别加入3ml上述底物，样品瓶加50vl酶液，对照 瓶不加。于50℃水浴,220rpm反应1小时，分别加1ml甲醇终止，对照瓶补加50vl 酶液。分别加2-3滴酚酞溶液，用0.02M NaOH滴定至淡粉红色。

3,计算公式：酯化活力单位：μmol/min.ml lipase

V:NaOH滴定体积差(ml)；

M:NaOH浓度(vmol/ml)＝0.02mol/L＝20vmol/ml；

E:酶液体积(ml)＝50vl＝0.05ml；

T:反应时间(min)＝1h＝60min。

在本发明的下述实施例中，甾醇的检测方法为：《GB/T25223-2010动植物油脂甾 醇组成和甾醇总量的测定气相色谱法》。

在本发明的下述实施例中，谷维素的检测方法按照范国欣,孙晓薇,潘希荣.米糠 油中谷维素含量的测定[J].粮油食品科技,2010,18(1):20-21进行检测。

实施例1

取50g酸价为28.72mgKOH/g的高酸值稻米油，然后按照游离脂肪酸与甘油摩尔 比为3:1的量加入甘油0.78g，并加入2.5g液体脂肪酶CALB(1309U)(5％)后在 10000-15000rpm下搅拌均质3min使物料完全混合。

升温至40℃后加入2.5g(添加量5％)氯化钙，然后在真空度为900Pa下进行反 应，每隔2h取样，检测不同时间点样品酸值并计算酯化率，结果如下表1所示。

表1

时间(h) 2 4 6 酸价(mgKOH/g) 16.04 12.27 10.36 酯化率(％) 44.15 57.28 63.93

分别检测毛稻米油、碱炼脱酸稻米油、实施例1制备的酶法酯化稻米油的甾醇、 谷维素含量，结果如表2所示。

表2

  甾醇(ppm) 谷维素(ppm) 毛稻米油 16086 20074 碱炼脱酸稻米油 13793 15778 酶法酯化稻米油 15769 19637

根据表2结果，与常规的碱炼脱酸相比，酶法酯化脱酸对稻米油中的甾醇、谷维 素等微量成分都有很好的保留作用，产品中有益成分含量高。

实施例2

取50g酸价为28.72mgKOH/g的高酸值稻米油，然后按照游离脂肪酸与甘油摩尔 比为3:1的量加入甘油0.78g，并加入5g液体脂肪酶CALB(2618U)(10％)后在 10000-15000rpm下搅拌均质3min使物料完全混合。

升温至40℃后加入2.5g(添加量5％)氯化钙，然后在真空度为900Pa下进行反 应，每隔2h取样，检测不同时间点样品酸值并计算酯化率，结果如下表3所示。

表3

时间(h) 2 4 6 酸价(mgKOH/g) 14.27 11.69 9.82 酯化率(％) 50.31 59.30 65.81

实施例3、

取30g酸价为18.15mgKOH/g的高酸值稻米油，然后按照游离脂肪酸与甘油摩尔 比为1:1的量加入甘油0.89g，并加入1.5g液体脂肪酶CALB(785.4U)(5％)后在 10000-15000rpm下搅拌均质3min使物料完全混合。

升温至50℃后加入1.5g(添加量5％)氯化钙，在真空度为900Pa下进行反应， 每隔2h取样，检测不同时间点样品酸值并计算酯化率，结果如下表4所示。

表4

时间(h) 2 4 6 酸价(mgKOH/g) 8.83 7.61 6.49 酯化率(％) 51.37 58.06 64.32

实施例4、

取30g酸价为18.15mgKOH/g的高酸值稻米油，然后按照游离脂肪酸与甘油摩尔 比为2:1的量加入甘油0.44g，并加入1.5g液体脂肪酶CALB(785.4U)(5％)后在 10000-15000rpm下搅拌均质3min使物料完全混合。

升温至50℃后加入1.5g(添加量5％)氯化钙，在真空度为900Pa下进行反应， 每隔2h取样，检测不同时间点样品酸值并计算酯化率，结果如下表5所示。

表5

时间(h) 2 4 6 酸价(mgKOH/g) 9.02 7.83 6.56 酯化率(％) 50.29 56.83 63.88

实施例5

取30g酸价为18.15mgKOH/g的高酸值稻米油，然后按照游离脂肪酸与甘油摩尔 比为3:1的量加入甘油0.30g，并加入0.3g液体脂肪酶CALB(157.08U)(1％)后在 10000-15000rpm下搅拌均质3min使物料完全混合。

升温至50℃后加入0.9g(添加量3％)氯化钙，在真空度为3000Pa下进行反应， 每隔2h取样，检测不同时间点样品酸值并计算酯化率，结果如下表6所示。

表6

时间(h) 2 4 6 酸价(mgKOH/g) 17.78 16.94 16.23 酯化率(％) 2.06 6.67 10.58

实施例6

取30g酸价为18.15mgKOH/g的高酸值稻米油，然后按照游离脂肪酸与甘油摩尔 比为3:1的量加入甘油0.30g，并加入2.4g液体脂肪酶CALB(1256.64U)(8％)后在 10000-15000rpm下搅拌均质3min使物料完全混合。

升温至50℃后加入0.9g(添加量3％)氯化钙，在真空度为3000Pa下进行反应， 每隔2h取样，检测不同时间点样品酸值并计算酯化率，结果如下表7所示。

表7

时间(h) 2 4 6 酸价(mgKOH/g) 11.07 8.94 6.93 酯化率(％) 39.02 50.74 61.82

实施例7

取30g酸价为18.15mgKOH/g的高酸值稻米油，然后按照游离脂肪酸与甘油摩尔 比为3:1的量加入甘油0.30g，并加入3g液体脂肪酶CALB(1570.8U)(10％)后在 10000-15000rpm下搅拌均质3min使物料完全混合。

升温至50℃后加入0.9g(添加量3％)氯化钙，在真空度为3000Pa下进行反应， 每隔2h取样，检测不同时间点样品酸值并计算酯化率，结果如下表所8示。

表8

时间(h) 2 4 6 酸价(mgKOH/g) 11.02 8.82 7.09 酯化率(％) 39.27 51.39 60.91

实施例8

取30g酸价为18.15mgKOH/g的高酸值稻米油，然后按照游离脂肪酸与甘油摩尔 比为3:1的量加入甘油0.30g，并加入0.9g液体脂肪酶CALB(471.24U)(3％)后在 10000-15000rpm下搅拌均质3min使物料完全混合。

升温至50℃后加入3g(添加量10％)氯化钙，在真空度为900Pa下进行反应， 每隔2h取样，检测不同时间点样品酸值并计算酯化率，结果如下表9所示。

表9

时间(h) 2 4 6 酸价(mgKOH/g) 10.13 9.35 8.91 酯化率(％) 44.17 48.49 50.89

实施例9

取30g酸价为18.15mgKOH/g的高酸值稻米油，然后按照游离脂肪酸与甘油摩尔 比为3:1的量加入甘油0.30g，并加入0.9g液体脂肪酶CALB(471.24U)(3％)后在 10000-15000rpm下搅拌均质3min使物料完全混合。

升温至50℃后加入0.9g(添加量3％)氯化钙，在真空度为900Pa下进行反应， 每隔2h取样，检测不同时间点样品酸值并计算酯化率，结果如下表10所示。

表10

时间(h) 2 4 6 酸价(mgKOH/g) 8.34 7.54 7.24 酯化率(％) 54.06 58.48 60.08

实施例10

取30g酸价为18.15mgKOH/g的高酸值稻米油，然后按照游离脂肪酸与甘油摩尔 比为3:1的量加入甘油0.30g，并加入0.9g液体脂肪酶CALB(471.24U)(3％)后在 10000-15000rpm下搅拌均质3min使物料完全混合。

升温至50℃后加入0.9g(添加量3％)氯化钙，在真空度为900Pa下进行反应， 每隔2h取样，检测不同时间点样品酸值并计算酯化率，结果如下表11所示。

表11

时间(h) 2 4 6 酸价(mgKOH/g) 7.72 7.39 6.99 酯化率(％) 57.44 59.26 61.46

实施例11

取30g酸价为18.15mgKOH/g的高酸值稻米油，然后按照游离脂肪酸与甘油摩尔 比为3:1的量加入甘油0.30g，并加入0.9g液体脂肪酶CALB(471.24U)(3％)后在 10000-15000rpm下搅拌均质3min使物料完全混合。

升温至50℃后加入0.9g(添加量3％)氯化钙，在真空度为2000Pa下进行反应， 每隔2h取样，检测不同时间点样品酸值并计算酯化率，结果如下表12所示。

表12

时间(h) 2 4 6

酸价(mgKOH/g) 7.86 7.34 7.03 酯化率(％) 56.67 59.53 61.24

实施例12

取30g酸价为18.15mgKOH/g的高酸值稻米油，然后按照游离脂肪酸与甘油摩尔 比为3:1的量加入甘油0.30g，并加入0.9g液体脂肪酶CALB(471.24U)(3％)后在 10000-15000rpm下搅拌均质3min使物料完全混合。

升温至50℃后加入0.9g(添加量3％)氯化钙，在真空度为3000Pa下进行反应， 每隔2h取样，检测不同时间点样品酸值并计算酯化率，结果如下表13所示。

表13

时间(h) 2 4 6 酸价(mgKOH/g) 8.05 7.39 7.22 酯化率(％) 55.62 59.26 60.19

实施例13、重复使用

实施例13-1、第一次利用

取50g酸价为28.72mgKOH/g的高酸值稻米油，然后按照游离脂肪酸与甘油摩尔 比为3:1的量加入甘油0.78g，并加入2.5g液体脂肪酶CALB(1309U)(5％)后在 10000-15000rpm下搅拌均质3min使物料完全混合。

升温至50℃后加入2.5g氯化钙(添加量5％)在真空度为900Pa下反应6h，每隔 2h取样，检测不同时间点样品酸值并计算酯化率，结果如下表15所示。

表15

时间(h) 2 4 6 酸价(mgKOH/g) 15.32 10.92 8.92 酯化率(％) 46.66 61.98 68.94

终止反应，将底物在10000rpm转速下离心分离，分别收集稻米油和氯化钙。

实施例13-2、第二次重复利用

取50g酸价为28.62mgKOH/g的高酸值稻米油，然后按照游离脂肪酸与甘油摩尔 比为3:1的量加入甘油0.78g，在10000-15000rpm下搅拌均质1min使物料完全混合。

升温至50℃后加入实施例13-1分离得到的固体氯化钙，在真空度为900Pa下进 行反应，每隔2h取样，检测不同时间点样品酸值并计算酯化率，结果如下表16所示。

表16

时间(h) 2 4 6 酸价(mgKOH/g) 17.32 14.38 10.90 酯化率(％) 39.69 49.93 62.05

终止反应，将底物在10000rpm转速下离心分离，分别收集稻米油和氯化钙。

实施例13-3、第三次重复利用

取50g酸价为28.62mgKOH/g的高酸值稻米油，然后按照游离脂肪酸与甘油摩尔 比为3:1的量加入甘油0.78g，在10000-15000rpm下搅拌均质1min使物料完全混合。

升温至50℃后加入实施例13-2中分离得到的固体氯化钙，在真空度为900Pa下 进行反应，每隔2h取样，检测不同时间点样品酸值并计算酯化率，结果如下表17所 示。

表17

时间(h) 2 4 6 酸价(mgKOH/g) 20.89 18.81 16.71 酯化率(％) 27.26 34.51 43.70

检测实施例2-13中制备的稻米油的甾醇、谷维素含量，结果显示所制备的稻米油 中的甾醇、谷维素均得到了很好的保留。

对比实施例1

取50g酸价为28.72mgKOH/g的高酸值稻米油，然后按照游离脂肪酸与甘油摩尔 比为3:1的量加入甘油0.78g，并加入2.5g液体脂肪酶CALB(1309U)(5％)后在 10000-15000rpm下搅拌均质3min使物料完全混合。

升温至50℃后在真空度为900Pa下进行反应，每隔2h取样，检测不同时间点样 品酸值并计算酯化率，结果如下表18所示。

表18

时间(h) 2 4 6 酸价(mgKOH/g) 27.36 25.04 24.17 酯化率(％) 4.73 12.81 15.84

对比实施例2

取50g酸价为28.72mgKOH/g的高酸值稻米油，然后按照游离脂肪酸与甘油摩尔 比为3:1的量加入甘油0.78g，并加入2.5g液体脂肪酶CALB(1309U)(5％)后在 10000-15000rpm下搅拌均质3min使物料完全混合。

升温至40℃后在真空度为900Pa下进行反应，每隔2h取样，检测不同时间点样 品酸值并计算酯化率，结果如下表19所示。

表19

时间(h) 2 4 6 酸价(mgKOH/g) 28.17 27.43 26.57 酯化率(％) 1.91 4.49 7.49

对比实施例3

取50g酸价为28.72mgKOH/g的高酸值稻米油，然后按照游离脂肪酸与甘油摩尔 比为3:1的量加入甘油0.78g，并加入5g液体脂肪酶CALB(2618U)(10％)后在 10000-15000rpm下搅拌均质3min使物料完全混合。

升温至40℃后在真空度为900Pa下进行反应，每隔2h取样，检测不同时间点样 品酸值并计算酯化率，结果如下表20所示。

表20

时间(h) 2 4 6 酸价(mgKOH/g) 27.19 25.33 22.98 酯化率(％) 5.33 11.80 19.99

与未添加氯化钙的对比实施例相比，使用本发明的方法，不仅使得高酸值稻米油 的酸价降低明显，提高了高酸值稻米油的酯化率，而且由于将游离脂肪酸酯化转变为 甘三酯，因此增加了稻米油的产量，因此提高了高酸价稻米油的利用率。同时，酶法 酯化的方法可以有效保留稻米油中的有益活性成分，如甾醇、谷维素等，提高稻米油 的营养价值。

以上参照实施例对本发明的优选实施方式作了具体描述，然而这些描述仅为说明 性的而非限制性的。本领域技术人员在不偏离本发明精髓和范围的前提下，可以对这 些优选实施方式作出各种显而易见的变更和修改，这些变更或修改后的实施方式仍然 落在本发明的保护范围内。