一种蕲蛇酶的生产方法

摘要

本发明涉及一种蕲蛇酶的生产方法，包括以下步骤：(1)将蕲蛇毒冻干粉溶解于过量的0.05mol/L、pH值为8.5的Tris‐HCl缓冲液中；(2)将所述蕲蛇毒溶液上DEAE‐Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，进行洗脱分离；(3)将步骤(2)获得的溶液上SOURCE 30Q凝胶柱，进行层析；然后上phenyl sepharose high performance柱层析分离；(4)将步骤(3)获得的溶液上Hiload 26/60Superdex75PG柱，收集具有凝血酶样酶活力的第二个蛋白峰，即为蕲蛇酶溶液。本发明的蕲蛇酶的生产方法制得的蕲蛇酶溶液为单一组分，具有纯度高的优点。

说明书

技术领域

本发明涉及生物制药领域，特别涉及一种蕲蛇酶的生产方法。

背景技术

蕲蛇酶是从尖吻蝮蛇毒中分离纯化的一种凝血酶样酶，是丝氨酸型蛋白水 解酶混合物。蕲蛇酶具有凝血酶样酶活力，其分子量为24000～30000道尔顿， 等电点为4.5～5.0。蕲蛇酶制剂‐‐蕲蛇酶注射液可用于治疗急性脑梗塞及各种血栓 性疾病，临床上采用静脉滴注给药。

关于蕲蛇酶生产工艺已有文献，中国专利申请公开号为CN1229136A的专利 文件公开蕲蛇酶及其生产工艺，用已知的缓冲液溶解上葡聚糖凝胶G‐75柱，收 集具有凝血酶样酶活力的A、B峰，用DEAE‐葡聚糖凝胶A‐50柱层析，分别收集 具有凝血酶样酶活力的V、Ⅵ、Ⅶ峰。将收集到的具有凝血酶样酶活力的V、Ⅵ、 Ⅶ峰分别用CM‐葡聚糖凝胶C‐50柱层析，分别收集具有凝血酶样酶活力的CM1、 CM2、CM3峰。将收集到的有凝血酶样酶活力的CM1、CM2、CM3峰分别用 superdex75PG柱过滤，各得a，b两峰，收集具有高凝血酶样酶活力的b峰，混 合为分子量24000～30000道尔顿及等电点4.5～5.0的蕲蛇酶。该生产工艺制备的 蕲蛇酶的纯度有待进一步提高，且生产工艺过程复杂、生产周期长，不易于产 业化推广。

现有技术中也存在采用初步经凝胶过滤色谱层析，再经离子交换色谱层析 所得的目的组分，该组分用凝胶电泳检测为一个蛋白组分，其实际是分子量和 等电点相近的蛋白质或多肽的混合物，需做进一步纯化，即存在获得的蕲蛇酶 的纯度不够高的问题。此外，现有的蕲蛇酶生产工艺普遍存在生产工艺周期长 的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种纯度高、生产周期短的蕲蛇酶的 生产方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种蕲蛇酶的生产方法，包括以下步骤：

(1)在温度为4～10℃条件下将蕲蛇毒冻干粉溶解于0.04～0.06mol/L、pH 值为8～9的Tris‐HCl缓冲液中，静置60min，0～10℃条件下离心获得上清液， 将上清液用0.01mol/L、pH值为8～9的Tris‐HCl缓冲液进行透析，获得蕲蛇毒溶 液；

(2)将所述蕲蛇毒溶液上DEAE‐Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，进行洗 脱分离，收集蛋白峰中具有凝血酶样酶活力的蛋白峰，将收集的蛋白峰合并， 然后用0.01mol/L、pH值为7～8的Tris‐HCl缓冲液进行透析。

(3)将步骤(2)获得的溶液经0.22μm微孔滤膜过滤后，上SOURCE 30Q 凝胶柱，进行层析，收集具有凝血酶样酶活力的蛋白峰，将收集的蛋白峰溶液 合并后上phenyl sepharose high performance层析柱，进行层析，将层析后具有 高凝血酶样酶活力的蛋白峰，在真空度‐0.08MPa以下、5～10℃条件下进行浓缩， 然后用0.01mol/L、pH值为7～8的Tris‐HCl缓冲液进行透析，将透析后得到的溶 液在真空度‐0.08MPa以下，5～10℃条件下减压浓缩，浓缩液经0.22um微孔滤 膜过滤；

(4)将步骤(3)获得的溶液上Hiload 26/60Superdex75PG柱，收集具有凝 血酶样酶活力的第二个蛋白峰，即为蕲蛇酶溶液。

本发明的有益效果在于：

(1)制得的蕲蛇酶溶液为单一组分，纯度在凝胶电泳上为单一条带且经高 效液相检测为一个单峰，纯度大于98％；

(2)生产周期短，生产工艺重现性好。

附图说明

图1为本发明实施例的蕲蛇酶的生产方法的蕲蛇毒用DEAE‐Sepharose Fast  Flow柱层析的色谱图；

图2为本发明实施例的蕲蛇酶的生产方法收集到的具有凝血酶样酶活力的 Ⅷ和Ⅸ蛋白峰用SOURCE 30Q柱层析的色谱图；

图3为本发明实施例的蕲蛇酶的生产方法收集到的具有凝血酶样酶活力的 S2峰和S3峰用phenyl sepharose high performance柱层析的色谱图；

图4为本发明实施例的蕲蛇酶的生产方法收集到的具有凝血酶样酶活力的 P3峰用Hiload 26/60Superdex75PG柱层析的色谱图；

图5为本发明实施例的蕲蛇酶的生产方法的蕲蛇酶溶液(批号01)亚基分 子量的薄层扫描图；

图6为本发明实施例的蕲蛇酶的生产方法的蕲蛇酶溶液(批号01)电泳法 纯度检查的薄层扫描图；

图7为本发明实施例的蕲蛇酶的生产方法的蕲蛇酶溶液(批号01)高效液 相色谱法纯度检查的色谱图。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并 配合附图予以说明。

本发明最关键的构思在于：通过对蕲蛇毒冻干粉溶解、离心、透析，经柱 层析、透析等的配合操作，制备出高纯度的蕲蛇酶溶液。

本发明的一种蕲蛇酶的生产方法，包括以下步骤：

(1)在温度为4～10℃条件下将蕲蛇毒冻干粉溶解于0.04～0.06mol/L、pH 值为8～9的Tris‐HCl缓冲液中，静置60min，0～10℃条件下离心获得上清液， 将上清液用0.01mol/L、pH值为8～9的Tris‐HCl缓冲液进行透析，获得蕲蛇毒溶 液；

(2)将所述蕲蛇毒溶液上DEAE‐Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，收集蛋 白峰中具有凝血酶样酶活力的蛋白峰，将收集的蛋白峰合并，然后用0.01mol/L、 pH值为7～8的Tris‐HCl缓冲液进行透析。

(3)将步骤(2)获得的溶液经0.22μm微孔滤膜过滤后，上SOURCE 30Q 凝胶柱，进行层析，收集具有凝血酶样酶活力的蛋白峰，将收集的蛋白峰合并 后上phenyl sepharose high performance层析柱，进行层析，将层析后具有高凝 血酶样酶活力的蛋白峰，在真空度‐0.08MPa以下5～10℃条件下浓缩，然后用 0.01mol/L、pH值为7～8的Tris‐HCl缓冲液进行透析，将透析后得到的溶液在真 空度‐0.08MPa以下，5～10℃条件下减压浓缩，浓缩液经0.22um微孔滤膜过滤；

(4)将步骤(3)获得的溶液上Hiload 26/60Superdex75PG柱，收集具有凝 血酶样酶活力的第二个蛋白峰，即为蕲蛇酶溶液。

本发明的技术构思：蕲蛇毒所含的蛋白成分复杂，蕲蛇酶原先的生产工艺 依次采用SephadexG‐75、DEAE SephadexA‐50以及SephadexG‐75进行分离纯化， 得到三个同功酶。采用本专利的生产工艺可以有效去除非目标蛋白组分和细菌 内毒素，得到单一的蛋白组分，产品的纯度高，并且生产周期短、工艺过程易 于控制、重现性好。

从上述描述可知，本发明的有益效果在于：

(1)制得的蕲蛇酶溶液为单一组分，纯度在凝胶电泳上为单一条带且经高 效液相色谱检测为一个单峰，纯度大于98％；

(2)生产周期短，生产工艺重现性好。

进一步的，将步骤(1)中所述蕲蛇毒溶于Tris‐HCl缓冲液后于0～10℃条件 下进行离心，所得的上清液再用Tris‐HCl缓冲液透析。

由上述描述可知，所述离心具有进一步除杂的作用。

进一步的，所述透析采用透析袋进行，所述透析袋的截留分子量为7000道 尔顿。

进一步的，将步骤(1)中透析处理后的液体用0.22μm微孔滤膜进行过滤。

由上述描述可知，用0.22μm微孔滤膜进行过滤为对透析后的液体的初步 过滤处理，可便利后续操作的进行。

进一步的，将步骤(1)中所述蕲蛇毒溶液溶解于Tris‐HCl缓冲液，然后于 0～10℃条件下进行离心，所得的上清液用Tris‐HCl缓冲液进行透析。

进一步的，将步骤(3)中收集的具有凝血酶样酶活力的蛋白溶液先于真空 度‐0.08M Pa以下、5～10℃条件下进行浓缩，再用Tris‐HCl缓冲液透析。

进一步的，将步骤(3)中透析后的溶液于真空度‐0.08MPa以下、5～10℃ 条件下进行浓缩。

进一步的，将步骤(3)获得的浓缩液上Hiload 26/60Superdex75PG柱，收 集具有凝血酶样酶活力的第二个蛋白峰，即为蕲蛇酶溶液。

本发明的实施例一为：

步骤1：在温度为4～10℃下，将蕲蛇毒冻干粉溶解于过量的0.04～ 0.06mol/L、pH值为8～9的Tris‐HCl缓冲液中，静置60min以上，0‐10℃下离心 获得上清液，取上清液置透析袋中(截留分子量7000道尔顿)，用0.01mol/L、 pH值为8～9的Tris‐HCl缓冲液透析，以除去盐及生物小分子杂质；将经透析好 的蕲蛇毒溶液用0.22μm微孔滤膜过滤。

步骤2：将步骤1获得的溶液用DEAE‐Sepharose Fast Flow阴离子交换柱洗 脱分离，以去除含出血毒物质。图1为DEAE‐Sepharose Fast Flow柱层析的色谱 图，其横坐标为时间(min)，纵坐标为响应值(mAU)。如图1所示，得11个 蛋白峰，分别收集具有凝血酶样酶活力的Ⅷ峰和Ⅸ的前半高峰，合并Ⅷ峰和Ⅸ 的前半高峰收集液，再用浓度为0.01mol/L、pH值为7～8的Tris‐HCl缓冲液进行 透析，所用的透析袋的截留分子量为7000道尔顿，以除去盐和氨基酸。本步骤 DEAE‐Sepharose Fast Flow柱分离时间仅用6～7小时，具有效率高的优点。

步骤3：将透析好的具有凝血酶样酶活力的Ⅷ峰和Ⅸ的前半高峰，用SOURCE 30Q柱层析，图2为SOURCE 30Q柱层析的色谱图，其横坐标为时间(min)，纵 坐标为响应值(mAU)。如图2所示，得多个蛋白峰，分别收集具有凝血酶样酶 活力的S2、S3蛋白峰；将收集到的具有凝血酶样酶活力的S2、S3蛋白峰混合一 起用phenyl sepharose high performance层析分离，以去除S2、S3中的杂质。图 3为phenyl sepharose high performance柱层析的色谱图，其横坐标为时间(min)， 纵坐标为响应值(mAU)。如图3所示，收集具有凝血酶样酶活力的P3蛋白峰 后，经旋转蒸发器，真空度‐0.08MPa以下，5～10℃条件下减压浓缩。浓缩液装 入透析袋中，透析袋的截留分子量为7000道尔顿。用0.01mol/L、pH值为7‐8 的Tris‐HCl缓冲液透析，除盐，再在真空度‐0.08MPa以下，5～10℃条件下进行 减压浓缩，浓缩液经0.22um微孔滤膜过滤。

步骤4：将过滤后的P3蛋白峰用Hiload 26/60Superdex75PG柱进行过滤， 以去除热原及大分子杂质。图4为Hiload 26/60Superdex75PG柱层析的色谱图， 其横坐标为时间(min)，纵坐标为响应值(mAU)。如图4所示，收集高纯度的 具有凝血酶样酶活力的第二个蛋白峰后，经0.22μm微孔滤膜无菌抽滤，即为 蕲蛇酶溶液。

蕲蛇酶的质量分析：

1、比活力测定

1.1效价测定

参考品溶液的制备

取蕲蛇酶溶液参考品，加0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液(取三羟甲基 氨基甲烷0.121g，氯化钠0.878g，加水适量溶解，用0.5mol/L盐酸溶液调节pH 至7.4，加水至100ml制得)分别制成浓度为每1ml中含0.4、0.6、0.8、1.0单 位的溶液。

测定法

取试管(10mm×100mm，内径应为8.0mm±0.2mm)4支，各加入人纤维 蛋白原溶液0.1ml，置37℃±0.5℃水浴中保温2min，分别依次加入4种浓度的 参考品溶液0.4ml，立即摇匀计时，于37℃±0.5℃水浴中观察纤维蛋白的初凝 时间。每种浓度测定5次，求平均值(5次测定最大与最小值之差不得超过平均 值的10％，否则重测)。以参考品浓度的对数为横坐标，初凝时间的对数为纵坐 标，绘制标准曲线或计算回归方程(相关系数r≥0.990)。所述人纤维蛋白原溶 液为：取人纤维蛋白原1支，加上述缓冲液(pH7.4)制成每1ml中含人纤维蛋 白原4mg的溶液，置37℃水浴30～60分钟使充分溶解。取本品按上述方法测 定，由标准曲线或回归方程求得单位数。

1.2蛋白含量：精密量取本品适量，用0.9％氯化钠溶液制成每1ml中约含 0.1mg蛋白的溶液作为供试品溶液，精密量取供试品溶液1.0ml，用福林酚法(中 国药典(2010年版二部)附录ⅦM蛋白质含量测定法第二法)测定蛋白含量。

1.3比活力：按下式计算

比活力＝每1ml供试品效价单位数/每1ml供试品中蛋白mg数

表1为蕲蛇酶溶液比活力测定表。

表1

由表1可知，蕲蛇酶溶液批号01、02和03三批比活力分别为14.8u/mg、 13.4u/mg和13.6u/mg。

2、亚基分子量测定：

取本品适量，用SDS‐聚丙烯酰胺凝胶电泳法(中国药典(2010年版二部) 附录V F电泳法第五法)测定其亚基分子量。标准品为SDS‐聚丙烯酰胺凝胶电 泳低分子量标准蛋白质，成分包括：兔磷酸化酶B(分子量：97400道尔顿)、 牛血清白蛋白(分子量：66200道尔顿)、兔肌动蛋白(分子量：43000)、牛碳 酸酐酶(分子量：31000道尔顿)、胰蛋白酶抑制剂(分子量：20100道尔顿)、 鸡蛋清溶菌酶(分子量：14400道尔顿)。将电泳后的凝胶板在岛津双波长飞点 薄层扫描仪(CS‐9301PC型)上扫描，参比波长700nm，测定波长580nm，得到 蕲蛇酶溶液(批号01、02和03)三批亚基分子量分别为14327.166、14263.507、 14184.903。蕲蛇酶溶液批号01亚基分子量的薄层扫描图见图5，图5的横坐标 为展距(mm)，纵坐标为吸光度。

3、纯度检查

3.1SDS‐聚丙烯酰胺凝胶电泳法

取本品，依照SDS‐聚丙烯酰胺凝胶电泳法(中国药典(2010年版二部)附 录V F电泳法第五法)检查，点样20ul，将电泳后的凝胶板在岛津双波长飞点 薄层扫描仪(CS‐9301PC型)上扫描，参比波长700nm，测定波长580nm，按峰 面积归一化法计算，得到蕲蛇酶溶液(批号01、02和03)三批电泳法主带含量 分别为99.276％、99.576％、98.294％，均大于98％。图6为蕲蛇酶溶液批号01 电泳法纯度检查薄层扫描图，图6的横坐标为展距(mm)，纵坐标为吸光度。

3.2高效液相色谱法

用凝胶为填充剂(TSK gel G3000SW，7.5mm×300mm)，以0.02mol/L磷酸 盐缓冲液(取磷酸氢二钠4.37g和磷酸二氢钠1.22g，溶解于1000ml水中，调节 pH值为7.0制得)制成的0.1mol/L硫酸钠溶液为流动相；流速为每分钟1.0ml， 检测波长为280nm。蕲蛇酶溶液(批号01、02和03)三批经高效液相色谱检测， 纯度分别为98.908％、99.341％、98.623％，均大于98％。蕲蛇酶溶液批号01批 的高效液相色谱图见图7，横坐标为时间(min)，纵坐标为响应值(uV)；

综上所述，本发明提供的蕲蛇酶的生产方法制得的蕲蛇酶溶液为单一组分， 纯度在凝胶电泳上为单一条带且经高效液相色谱检测为一个单峰，纯度大于 98％；该生产方法的生产周期短，生产工艺重现性好。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利 用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术 领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。