能防治樱桃病害的生物杀菌剂及所用菌

摘要

本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌菌株BA-07，为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA-07，其保藏号为：CGMCC NO.8466。本发明还同时提供了上述解淀粉芽孢杆菌菌株BA-07的用途：用于制备能防治樱桃病害(叶片细菌性穿孔病害)的生物杀菌剂。本发明还同时提供了上述能防治樱桃病害的生物杀菌剂的制备方法。

说明书

技术领域

本发明属于樱桃病害防治技术领域，具体地说涉及生物防治领域中一种防治樱桃病害的生物杀菌剂及所用菌。

背景技术

樱桃(Cerasus pseudocerasus)属于蔷薇科落叶乔木果树，在我国栽培历史悠久，是落叶果树中成熟期最早的树种之一。近年来，为了实现城乡经济统筹协调发展和富民增收的目标，农业产业结构不断调整，浙江省大力发展特色优质水果，樱桃的种植面积不断增加、生产规模日益扩大。

樱桃在果品中成熟期最早，被誉为“春果第一枝”，其果实色泽鲜艳，晶莹美丽，营养丰富，外观和内在品质俱佳，被誉为“果中极品”，具有极高的经济价值，含有维生素A、B、C及钙、磷、铁等矿物质元素。尤其铁元素的含量每百克樱桃中可达到59毫克，居水果首位。

但是，近年来随着樱桃种植面积的不断扩大，各种病害也相继发生，且有逐年加重的趋势。穿孔病是樱桃树上最常见的叶部病害之一，发病率高，危害严重。其发病部位病斑部分组织脱落，形成穿孔。在沿海、沿湖和排水不良的果园及多雨年份发生严重。易造成大量落叶，减少营养积累，影响花芽的形成，导致当年减产，果实品质差。而且对第二年的产量和品质也有较大影响。当前国内外对樱桃穿孔病的治理主要是以增强果园管理和传统农药防治为主，农药的广泛使用对防治有害生物和提高农业经济效益都起到了不可忽视的作用。

但是随着化学农药的大量使用，农药对果品和果园环境的污染越来越严重，病虫害防治与农药污染的矛盾已成为果树生产中亟待解决的问题。同时，随着人们对食品安全和环境保护意识的增强，化学类杀菌剂的使用范围也越来越受到限制。因此从可持续发展的角度出发，开发新型、高效且安全的有机、绿色的生物杀菌剂具有重大的社会意义和广阔的应用前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种防治樱桃穿孔病害的生物杀菌剂。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌菌株BA-07，为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA-07，其保藏号为：CGMCC NO.8466。

本发明还同时提供了上述解淀粉芽孢杆菌菌株BA-07的用途：用于制备能防治樱桃病害的生物杀菌剂。

作为本发明的解淀粉芽孢杆菌菌株BA-07的用途的改进：所述樱桃病害为叶片细菌性穿孔病害。

本发明还同时提供了能防治樱桃病害的生物杀菌剂的制备方法，包括以下步骤：

1)、斜面菌种：

将保藏号为：CGMCC NO.8466的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA-07在PDA斜面上于27.5～28.5℃培养46～50h(较佳为28℃培养48h)；

备注：取出后于4℃冰箱中保存，严防杂菌污染；

2)、平板活化：

将上述PDA斜面培养所得(保存)的菌种接种到平板培养基上，所述平板培养基为PDA培养基；培养条件为27.5～28.5℃培养46～50h(较佳为28℃培养48h)，且于相同条件下重复传代培养两次(即，共培养2次)；

3)、液体发酵种子：

以NB培养基作为种子培养基；

将活化所得的菌种接种到装有NB培养基的摇瓶中，于27.5～28.5℃(较佳为28℃)、150～250rpm(较佳为200rpm)振荡器中培养22～26h(较佳为24h)；得液体发酵种子；

4)、液体发酵

将上述液体发酵种子以2％(体积％)的接种量接种于NB培养基中，在27.5～28.5℃(较佳为28℃)、150～250rpm(较佳为200rpm)振荡器中培养22～26h(较佳为24h)，得发酵液；

备注说明：步骤3)和步骤4)均为“有氧无菌培养”，即，满足“透气”的条件；

5)、离心过滤：

将上述步骤4)所得的发酵液在7000～9000rpm条件下离心9～11min(较佳为8000rpm条件下离心10min)，去除沉淀得到上清液，所得上清液为能防治樱桃病害的生物杀菌剂。

在本发明中，PDA培养基和NB培养基均属于常规培养基。例如，NB培养基为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，水1000ml，调pH7.0-7.2，121℃灭菌20min。

本发明所用的解淀粉芽孢杆菌BA-07，保藏名称为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，保藏号为：CGMCC NO.8466，保藏日期：2013年11月11日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中科院微生物研究所。

本发明具有如下技术优势：

1、生物杀菌剂微生物易于培养，生长周期短；

2、生物杀菌剂的生产较易，方便收集；

3、生物杀菌剂对环境友好、无污染，不影响人类健康。

4、本发明所得的生物杀菌剂防治樱桃病害(叶片细菌性穿孔病害)效果佳。

本发明的能防治樱桃病害的生物杀菌剂实际使用时，其用法和用量具体如下：将生物杀菌剂(上清液)与无菌水按照1：10～50的体积比混合后，在每年5-6月(或者当新生叶片出现水渍状半透明淡褐色小病斑时)进行喷洒。一般而言，每亩使用作为有效成分的生物杀菌剂5～15L。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为生物杀菌剂与所用菌菌液(10⁶CFU/ml)对樱桃穿孔病菌的平板抑制效果对比图。

图2为生物杀菌剂与所用菌菌液(10⁶CFU/ml)对樱桃穿孔病菌的体外平板抑制效果。

图3为不同浓度生物杀菌剂对樱桃穿孔病菌的体外平板抑制效果。

图4为生物杀菌剂及所用菌菌液(10⁶CFU/ml)对樱桃穿孔病害防治效果。

图5为不同浓度生物杀菌剂对樱桃穿孔病害防治效果。

具体实施方式

实施例1、一种防治樱桃病害的生物杀菌剂，其制备方法为依次进行以下步骤：

1)、斜面菌种：

将保藏号为：CGMCC NO.8466的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA-07在PDA斜面上培养48h(培养温度为28℃)，于4℃冰箱中保存，严防杂菌污染；

2)、平板活化：

将上述PDA斜面保存的菌种接种到平板培养基上，所述平板培养基为PDA培养基。培养条件为于28℃下培养48h，相同条件下重复传代培养两次(即，共培养2次)。

3)、液体发酵种子：

以NB培养基作为种子培养基。

将活化所得的菌种1环接种到装有50ml NB液体培养基(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，调pH7.0-7.2，水1000ml，121℃灭菌20min)的摇瓶中，于28℃、200rpm条件下培养24小时；得液体发酵种子。

4)、液体发酵

将液体发酵种子以2％(体积％)的接种量接种于NB培养基(于摇瓶中)，在28℃、200rpm振荡器中培养24小时；获得发酵液(发酵产物)。

即，液体发酵种子与NB培养基的体积比为2％。

5)、离心过滤：

将上述步骤4)所得的发酵液离心(转速为8000rpm，时间为10min)，去除沉淀得到上清液，所述上清液为能防治樱桃病害的生物杀菌剂。

以下实验中，所用菌菌液均指实施例1步骤5)发酵液离心所得的沉淀并用无菌水调节其浓度为10⁶CFU/ml，生物杀菌剂均指实施例1步骤5)所得的上清液。

实验1、生物杀菌剂及所用菌菌液(Bacillus amyloliquefaciens)对穿孔病菌的体外平板抑制

(1)将樱桃细菌性穿孔病菌(Xanthomonas campestri pv.pruni)按照常规方法进行活化；

(2)将融化的PDA培养基倒入培养皿中，制备9个平板。3个一组共分3组；

(3)挑取活化好的樱桃细菌性穿孔病菌于无菌水中混匀，测其OD值约为0.5。吸取100μL上述菌液到制备好的平板中，用涂布棒将菌液涂匀涂开；

(4)用镊子夹取牛津杯置于平板中心(牛津杯不宜插入培养基太深也不宜太浅)；

(5)各吸取200μL所用菌菌液和生物杀菌剂于牛津杯中，分别放到3个平板中，作为处理；吸取200μL无菌水于牛津杯中，分别放到3个平板中，作为对照；

(6)在28℃培养箱中培养(有氧)2天；

(7)拍照并测量抑菌圈直径。

所得结果如图1与图2所示。

实验2、不同浓度生物杀菌剂对穿孔病菌的体外平板抑制

将生物杀菌剂分别稀释2倍与3倍，然后各吸取200μL生物杀菌剂、200μL稀释2倍后的生物杀菌剂、200μL稀释3倍后的生物杀菌剂于牛津杯中，分别放到3个平板中，作为处理；吸取200μL无菌水于牛津杯中，分别放到平板中，作为对照。

其余内容等同于实验1。

备注说明：生物杀菌剂与无菌水按照1:1的体积比混合，即为将生物杀菌剂稀释2倍；生物杀菌剂与无菌水按照1:2的体积比混合，即为将生物杀菌剂稀释3倍。

所得结果如图3所示。根据图3，我们可以得知，与未经生物杀菌剂处理相比，生物杀菌剂原液、稀释2倍、稀释3倍生物杀菌剂处理均能显著抑制樱桃穿孔病菌的生长，抑菌圈直径分别为对照的4倍、4.1倍和3倍。

实验3、生物杀菌剂与所用菌菌液对樱桃穿孔病害的体内防治

(1)菌液制备：挑取活化好的樱桃细菌性穿孔病菌于无菌水中混匀，测其OD值约为0.5。

(2)将樱桃枝条分为3组，每组10个，每个枝条挑选新生的已经展开的3个叶片，共90个。

(3)将接种针浸入制备好的菌液，在挑选好的叶片上刺孔，形成直径约为0.5cm的圆形。

每次刺之前要重新浸菌液。以此作为对照组。

(4)取步骤(3)所得的已经刺孔的两组叶片，用移液枪分别吸取20μL生物杀菌剂和所用菌菌液涂于圆形针刺面积上，作为实验组。

(5)隔日观察樱桃叶片穿孔病害的发生状况，测量病斑直径并记录病害发生数。

所得结果如图4所示。

实验4、不同浓度生物杀菌剂对樱桃穿孔病害的体内防治

将生物杀菌剂分别稀释10倍与100倍，然后用移液枪分别吸取20μL生物杀菌剂(原液)、20μL稀释10倍后的生物杀菌剂、20μL稀释100倍后的生物杀菌剂涂于圆形针刺面积上，作为实验组。其余内容等同于实验3。

所得结果如图5所示。

根据图5，我们得出，与未经生物杀菌剂处理相比，生物杀菌剂原液、稀释10倍、稀释100倍生物杀菌剂处理均能显著抑制樱桃穿孔病害的发生，生物杀菌剂原液的抑制效果最好；其病害发生率为16％，病斑直径为1.3mm；分别为对照的1/6和1/4。

对比例1、

选用以下现有的解淀粉芽孢杆菌：

解淀粉芽孢杆菌A，来源为中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号：AS 1.1131；

解淀粉芽孢杆菌B，来源为广州佰仕路生物科技有限公司，商品代号：JDF50；

解淀粉芽孢杆菌C，来源为中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号：CICC 21269。

将解淀粉芽孢杆菌A、解淀粉芽孢杆菌B、解淀粉芽孢杆菌C分别替代本发明的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA-07，按照实施例1所述方法制备获得相应的上清液(生物杀菌剂)；按照上述实验1和实验3进行实验(仅检测生物杀菌剂原液)。所得结果如下表1所示。

表1