一种广谱抑菌酵母菌及提高其抑菌效果的方法

摘要

一种广谱抑菌酵母菌及提高其抑菌效果的方法。它涉及一种酵母菌及提高其抑菌效果的方法。其为德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2013277。提高抑菌效果的方法：德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8用YEPD液体培养基发酵培养，发酵培养分为两阶段，发酵第一阶段发酵培养时间为12h，发酵培养温度为28℃；发酵第二阶段发酵培养时间为0.5～1h，发酵培养温度为60±2℃，并向YEPD液体培养基中投加蛋白酶，蛋白酶选自胰蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶。本发明应用于微生物领域。

说明书

技术领域

本发明涉及一种酵母菌及提高其抑菌效果的方法。

背景技术

酵母是一种单细胞微生物，属于高等微生物的真菌类，在有氧和无氧环境下都能生存， 属于兼性厌氧菌。酵母是人类直接食用量最大的一种微生物。

人工合成防腐剂(或农药)仍是我国对果蔬采摘后病害防治最常用的方法，如抑霉唑、 TBZ等常在粮食栽种及后期处理过程中使用。虽然这类药剂抑菌效果显著，但会对环境造成 污染且对人体组织造成严重损伤，对人畜无毒无害，并且具有广谱抑菌效果的绿色防腐剂的 研发迫在眉睫。

发明内容

本发明是为了解决人工合成防腐剂污染环境、对人体组织造成严重损伤等问题，而提供 一种广谱抑菌酵母菌及提高其抑菌效果的方法。

本发明广谱抑菌酵母菌为德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8，保藏于中国 典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2013277。

提高上述广谱抑菌酵母菌抑菌效果的方法：德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii) M8用YEPD液体培养基发酵培养，发酵培养分为两阶段，发酵第一阶段发酵培养时间为12h， 发酵培养温度为28℃；发酵第二阶段发酵培养时间为0.5～1h，发酵培养温度为60±2℃，并 向YEPD液体培养基中投加蛋白酶，蛋白酶选自胰蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶；

其中YEPD液体培养基按比例由1g酵母膏、2g蛋白胨、2g葡萄糖和100mL蒸馏水组成， YEPD液体培养基pH值为7；发酵第二阶段投加中性蛋白酶YEPD液体培养基pH值调节为 7，发酵第二阶段投加胰蛋白酶YEPD液体培养基pH值调节为8，发酵第二阶段投加碱性蛋 白酶YEPD液体培养基pH值调节为9。

德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8为圆丘形、单边芽殖，菌体直径为3.25μm； 菌落为圆丘状、表面光滑、边缘整齐，白色、不透明、湿润。

德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念 珠球菌、志贺氏菌、沙门氏菌和枯草芽孢杆菌均具有稳定、优异的抑菌效果。

酵母菌生存营养需求简单，繁殖速度快，不会产生威胁人类和环境安全的有害物质，而 且被人或动物食用后可以促进消化，因此是天然、安全的食品防腐剂和抑菌剂。

德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8能够在较干燥的果蔬表面生存，并与病 菌竞争营养与空间，对其它抗菌剂影响小；而且所产生抑菌物质多是水果、蔬菜上的正常菌 落成分，对人体安全。

德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8中的抑菌物质可做为天然防腐剂添加到 果汁、牛奶等饮品中，利用其抑菌形成延长产品的保质期

德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8中的可以制成发酵剂，其发酵产品可以 抑制肠道常见致病菌。

与用YEPD液体培养基发酵培养、发酵培养温度为28℃，发酵培养时间为13h的德尔布 有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8相比，本发明方法可以提高德尔布有孢圆酵母 (Torulaspora delbrueckii)M8的抑菌效果(抑菌圈直径)达2倍以上，具有显著提高。

广谱抑菌酵母菌德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8为德尔布有孢圆酵母 (Torulaspora delbrueckii)，属于球孢酵母属(Torulaspora)；保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，保藏地址是武汉大学，保藏日期为2013年6月23日，保藏号为CCTCC NO： M2013277。

附图说明

图1是实施例1中对志贺氏菌的抑菌效果图，图1中A中加入的是德尔布有孢圆酵母 (Torulaspora delbrueckii)M8，B中加入的是效价为5IU的Nisin。

图2是实施例1中对大肠杆菌的抑菌效果图，图2中A中加入的是德尔布有孢圆酵母 (Torulaspora delbrueckii)M8，B中加入的是效价为5IU的Nisin。

图3是实施例1中对白色念珠菌的抑菌效果图，图3中A中加入的是德尔布有孢圆酵母 (Torulaspora delbrueckii)M8，B中加入的是效价为5IU的Nisin。

图4是实施例1中对沙门氏菌的抑菌效果图，图4中A中加入的是德尔布有孢圆酵母 (Torulaspora delbrueckii)M8，B中加入的是效价为5IU的Nisin。

图5是实施例1中对枯草芽孢杆菌的抑菌效果图，图5中A中加入的是德尔布有孢圆酵 母(Torulaspora delbrueckii)M8，B中加入的是效价为5IU的Nisin。

图6是实施例1中对金黄色葡萄球菌的抑菌效果图，图6中A中加入的是德尔布有孢圆 酵母(Torulaspora delbrueckii)M8，B中加入的是效价为5IU的Nisin。

图7是实施例2①中第二阶段不同发酵温度条件下德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8对志贺氏菌的抑菌效果图，图7中A中德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8发酵第二阶段温度为28℃，图7中B中德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8发酵第二阶段温度为60℃，图7中C中德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8发酵第二阶段温度为80℃。

图8是实施例2①中第二阶段不同发酵温度条件下德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8对志贺氏菌的抑菌效果图，图8中B¹中德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8发酵第二阶段温度为100℃，图8中C¹中德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8发酵第二阶段温度为120℃。

图9是实施例2①中第二阶段不同发酵温度条件下德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8对大肠杆菌的抑菌效果图，图9中A中德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8发酵第二阶段温度为28℃，图9中B中德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8发酵第二阶段温度为60℃，图9中C中德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8发酵第二阶段温度为80℃，图9中D中德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8发酵第二阶段温度为100℃。

图10是实施例2①中第二阶段不同发酵温度条件下德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8对大肠杆菌的抑菌效果图，图10中A中德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8发酵第二阶段温度为28℃，图10中E中德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8发酵第二阶段温度为100℃，图10中F中德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8发酵第二阶段温度为120℃。

图11是实施例2②中第二阶段不同发酵pH条件下德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8对志贺氏菌的抑菌效果图，图11中A中德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8发酵第二阶段pH值为7，图11中B中德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8发酵第二阶段pH值为4，图11中C中德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8发酵第二阶段pH值为6，图11中D中德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8发酵第二阶段pH值为8。

图12是实施例2②中第二阶段不同发酵pH条件下德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8对志贺氏菌的抑菌效果图，图11中A中德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8发酵第二阶段pH值为7，图11中E中德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8发酵第二阶段pH值为10，图11中F中德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8发酵第二阶段pH值为12。

图13是实施例2②中第二阶段不同发酵pH条件下德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8对大肠杆菌的抑菌效果图，图13中A中德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8发酵第二阶段pH值为7，图13中B中德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8发酵第二阶段pH值为4，图13中C中德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8发酵第二阶段pH值为6，图13中D中德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8发酵第二阶段pH值为8。

图14是实施例2②中第二阶段不同发酵pH条件下德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8对大肠杆菌的抑菌效果图，图14中A中德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8发酵第二阶段pH值为7，图14中E中德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8发酵第二阶段pH值为10，图14中F中德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8发酵第二阶段pH值为12。

图15是实施例2③中第二阶段投加不同蛋白酶条件下德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8对志贺氏菌的抑菌效果图，图15中A中德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8发酵第二阶段未加入蛋白酶，图15中B中德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8发酵第二阶段加入胰蛋白酶，图15中C中德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8发酵第二阶段加入中性蛋白酶，图15中D中德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8发酵第二阶段加入碱性蛋白酶。

图16是实施例2③中第二阶段投加不同蛋白酶条件下德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8对大肠杆菌的抑菌效果图，图16中A中德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8发酵第二阶段未加入蛋白酶，图16中B中德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8发酵第二阶段加入胰蛋白酶，图16中C中德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8发酵第二阶段加入中性蛋白酶，图16中D中德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8发酵第二阶段加入碱性蛋白酶。

图17为德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8和相近菌株进行同源性比对构 建的系统发育树图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组 合。

具体实施方式一：本实施方式广谱抑菌酵母菌为德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2013277。

德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8采集自西藏，从我国传统发酵乳制品西 藏灵菇中分离获得。将西藏灵菇置于10％的脱脂乳中传代培养，活化后将其发酵液涂于含氯 霉素的YEPD固体培养基中划线分离得到德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8。

德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8的26s rDNA D1/D2区碱基长度为566bp， 碱基序列如SEQ ID NO：1所示，18S rDNA长度为1192bp，碱基序列如SEQ ID NO：2所 示；经26S rDNA D1/D2区序列和18S rDNA序列比对，并通过微生物形态和生理生化指标 鉴定，确认广谱抑菌酵母菌M8为球孢酵母属(Torulaspora)德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)，与Torulaspora delbrueckii CBS 1146同源性最为接近。

Torulaspora delbrueckii CBS 1146的生化试验结果如表1所示，Torulaspora delbrueckii  CBS 1146菌落为黄色或紫色。

表1

德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8的生化试验结果如表2所示，菌落为白 色。

表2

根据生化实验结果和菌落形态等比较，可以确定德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8为一株德尔布有孢圆酵母新菌株。

德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8可抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白 色念珠球菌、志贺氏菌、沙门氏菌和枯草芽孢杆菌，可用于食品发酵，抑制有害菌的生长， 减少致病菌对人体的危害。

德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8可用YEPD固体培养基培养、保存，YEPD 固体培养基按比例由1g酵母膏、2g蛋白胨、2g葡萄糖、2g琼脂和100mL蒸馏水组成，并调 解pH值为7。德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8的培养温度为28～30℃。

德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8采集自传统发酵乳制品西藏灵菇，对人 畜和环境无毒无害。

具体实施方式二：本实施方式提高上述广谱抑菌酵母菌抑菌效果的方法：德尔布有孢圆 酵母(Torulaspora delbrueckii)M8用YEPD液体培养基发酵培养，发酵培养分为两阶段，发 酵第一阶段发酵培养时间为12h，发酵培养温度为28℃；发酵第二阶段发酵培养时间为 0.5～1h，发酵培养温度为60±2℃，并向YEPD液体培养基中投加蛋白酶，蛋白酶选自胰蛋白 酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶；

其中YEPD液体培养基按比例由1g酵母膏、2g蛋白胨、2g葡萄糖和100mL蒸馏水组成， YEPD液体培养基pH值为7；发酵第二阶段投加中性蛋白酶YEPD液体培养基pH值调节为 7，发酵第二阶段投加胰蛋白酶YEPD液体培养基pH值调节为8，发酵第二阶段投加碱性蛋 白酶YEPD液体培养基pH值调节为9。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二的不同点在于：每升YEPD液体培养基 中投加1.5mg蛋白酶，胰蛋白酶的酶活力为250U/mg、碱性蛋白酶的酶活力为200U/mg、中 性蛋白酶的酶活力为60U/mg。其他步骤及参数与实施方式二相同。

实施例1 抑菌实验：

制作抑菌实验平板：在灭菌平板中倒入8mL素琼脂，待凝固后在琼脂上放上牛津杯；分 别向含有大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠球菌、志贺氏菌、沙门氏菌和枯草芽孢杆菌 的斜面培养基中加入4ml生理盐水，然后震荡，再从中取0.5ml注入4.5ml无菌生理盐水中， 充分震荡，再重复上述梯度稀释3次，制备10^-3的菌悬液；用漩涡振荡器将菌悬液震荡均匀 后取1ml加入25ml营养培养基中，混匀倒入上述待用琼脂平板中，等琼脂凝固后拔出牛津杯， 在所留下的孔中加入100μl德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8的浓缩发酵液(在 所留下的孔中加入100μl Nisin溶液，完成Nisin对比)，即制成抑菌实验平板；

其中，所述素琼脂由4g琼脂加入200ml蒸馏水中制成；

所述营养培养基1000mL由3～5g牛肉膏、10g蛋白胨、5g氯化钠、7.5g琼脂和余量的蒸 馏水制成，调解pH值为7.0、121℃条件下灭菌20min；

德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8的浓缩发酵液：德尔布有孢圆酵母 (Torulaspora delbrueckii)M8用YEPD液体培养基发酵培养，发酵培养分为两阶段，发酵第 一阶段发酵培养时间为12h，发酵培养温度为28℃；发酵第二阶段发酵培养时间为1h，发酵 培养培养基pH值为7，发酵培养温度为60℃，并向YEPD液体培养基中投加中性蛋白酶， 每升YEPD液体培养基投加1.5g中性蛋白酶，中性蛋白酶的酶活为60U/mg；然后将德尔布 有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8发酵液在4000r/min条件下离心10min，将上清液 置于旋转蒸发仪中真空度660mmHg、55℃下浓缩至原体积的1/16，即得到德尔布有孢圆酵母 (Torulaspora delbrueckii)M8的浓缩发酵液；

其中，所述Nisin溶液为110mgNisin加入10mL水中，溶解后定容到100mL，即得到Nisin 溶液。

将抑菌实验平板置于37℃的恒温培养箱培养12h，然后进行观察，抑菌效果如图1～图6 所示，德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8抑菌圈数据如表3所示。

表3

实验结果表明德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8的抑菌效果为：对志贺氏 菌的抑菌圈直径平均值为24.30mm，抑菌圈非常清晰、透明；对大肠杆菌的抑菌圈直径平均 值23.72mm，抑菌圈清晰、透明；对白色念珠球菌的抑菌圈直径平均值为23.08mm，抑菌圈 清晰、透明；对沙门氏菌的抑菌圈直径平均值为18.53mm，抑菌圈相对清晰、透明；对枯草 芽孢杆菌的抑菌圈直径平均值为16.68mm，抑菌圈清晰、透明；对金黄色葡萄球菌的抑菌圈 直径平均值为16.66mm，抑菌圈一般清晰、透明。德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii) M8对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠球菌、志贺氏菌、沙门氏菌和枯草芽孢杆菌均有 良好的抑菌效果，说明德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8具有广谱抑菌性。

实施例2 提高抑菌效果实验：

①德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8用YEPD液体培养基发酵培养，发酵 培养分为两阶段，发酵第一阶段发酵培养时间为12h，发酵培养温度为28℃；发酵第二阶段 分别在120℃、100℃、80℃、60℃和28℃环境中发酵培养时间为0.5h，并投加中性蛋白酶(中 性蛋白酶的酶活力为60U/mg)；

其中YEPD液体培养基按比例由1g酵母膏、2g蛋白胨、2g葡萄糖和100mL蒸馏水组成， YEPD液体培养基pH值为7。

在灭菌平板中倒入8mL素琼脂，待凝固后在琼脂上放上牛津杯；分别向含有志贺氏菌和 大肠杆菌的斜面培养基中加入4ml生理盐水，然后震荡，再从中取0.5ml注入4.5ml无菌生 理盐水中，充分震荡，再重复上述梯度稀释3次，制备10^-3的菌悬液；用漩涡振荡器将菌悬 液震荡均匀后取1ml加入25ml营养培养基中，混匀倒入上述待用琼脂平板中，等琼脂凝固后 拔出牛津杯，在所留下的孔中分别加入上述100μl德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii) M8的浓缩发酵液；

其中，所述素琼脂由4g琼脂加入200ml蒸馏水中制成；

所述营养培养基1000mL由3～5g牛肉膏、10g蛋白胨、5g氯化钠、7.5g琼脂和余量的蒸 馏水制成，调解pH值为7.0、121℃条件下灭菌20min；

德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8的浓缩发酵液：将不同条件下培养的德 尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8发酵液在4000r/min条件下离心10min，将上 清液置于旋转蒸发仪中真空度660mmHg、55℃下浓缩至原体积的1/16，即得到德尔布有孢圆 酵母(Torulaspora delbrueckii)M8的浓缩发酵液。

将上述实验平板置于37℃的恒温培养箱培养12h，然后进行观察，发酵第二阶段不同发 酵温度条件下德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8对志贺氏菌的抑菌效果如图7 和图8所示，对大肠杆菌的抑菌效果如图9和图10所示。

实验结果：发酵第二阶段温度为28℃的德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8 对志贺氏菌产生的抑菌圈直径平均值为19.031mm，发酵第二阶段温度为60℃的德尔布有孢 圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8对志贺氏菌产生的抑菌圈直径平均值为20.158mm，发 酵第二阶段温度为80℃的德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8对志贺氏菌产生的 抑菌圈直径平均值为15.405mm，发酵第二阶段温度为100℃的德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8对志贺氏菌产生的抑菌圈直径平均值为8.941mm，发酵第二阶段温度为120 ℃的德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8对志贺氏菌产生的抑菌圈直径平均值为 0mm。

发酵第二阶段温度为28℃的德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8对大肠杆菌 产生的抑菌圈直径分别为19.363mm和18.762mm，发酵第二阶段温度为60℃的德尔布有孢圆 酵母(Torulaspora delbrueckii)M8对大肠杆菌产生的抑菌圈直径平均值为20.957mm，发酵 第二阶段温度为80℃的德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8对大肠杆菌产生的抑 菌圈直径平均值为10.168mm，发酵第二阶段温度为100℃的德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8对大肠杆菌产生的抑菌圈直径分别为10.547mm和7.516mm，发酵第二阶段 温度为120℃的德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8对大肠杆菌产生的抑菌圈直 径平均值为0mm。

本试验发酵第二阶段温度为60℃德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8的抑菌 效果提高最为显著。

②德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8用YEPD液体培养基发酵培养，发酵 培养分为两阶段，发酵第一阶段发酵培养时间为12h，发酵培养温度为28℃；发酵第二阶段 发酵培养时间为1h，发酵培养温度为28℃；

其中YEPD液体培养基按比例由1g酵母膏、2g蛋白胨、2g葡萄糖和100mL蒸馏水组成， 发酵第一阶段YEPD液体培养基pH值为5.5，发酵第二阶段YEPD液体培养基分别调节发酵 液pH值为pH为12、10、8、7、6、4，实验前再调节至中性。

在灭菌平板中倒入8mL素琼脂，待凝固后在琼脂上放上牛津杯；分别向含有志贺氏菌和 大肠杆菌的斜面培养基中加入4ml生理盐水，然后震荡，再从中取0.5ml注入4.5ml无菌生 理盐水中，充分震荡，再重复上述梯度稀释3次，制备10^-3的菌悬液；用漩涡振荡器将菌悬 液震荡均匀后取1ml加入25ml营养培养基中，混匀倒入上述待用琼脂平板中，等琼脂凝固后 拔出牛津杯，在所留下的孔中分别加入上述100μl德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii) M8的浓缩发酵液；

其中，所述素琼脂由4g琼脂加入200ml蒸馏水中制成；

所述营养培养基1000mL由3～5g牛肉膏、10g蛋白胨、5g氯化钠、7.5g琼脂和余量的蒸 馏水制成，调解pH值为7.0、121℃条件下灭菌20min；

德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8的浓缩发酵液：将不同条件下培养的德 尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8发酵液在4000r/min条件下离心10min，将上 清液置于旋转蒸发仪中真空度660mmHg、55℃下浓缩至原体积的1/16，即得到德尔布有孢圆 酵母(Torulaspora delbrueckii)M8的浓缩发酵液。

将上述实验平板置于37℃的恒温培养箱培养12h，然后进行观察，发酵第二阶段不同发 酵pH条件下德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8对志贺氏菌的抑菌效果如图11 和图12所示，对大肠杆菌的抑菌效果如图13和图14所示。

实验结果：发酵第二阶段pH值为4的德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8 对志贺氏菌产生的抑菌圈直径平均值为11.362mm，发酵第二阶段pH值为6的德尔布有孢圆 酵母(Torulaspora delbrueckii)M8对志贺氏菌产生的抑菌圈直径平均值为12.112mm，发酵 第二阶段pH值为7的德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8对志贺氏菌产生的抑 菌圈直径分别为12.136mm和14.175mm，发酵第二阶段pH值为8的德尔布有孢圆酵母 (Torulaspora delbrueckii)M8对志贺氏菌产生的抑菌圈直径平均值为9.158mm，发酵第二阶 段pH值为10的德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8对志贺氏菌产生的抑菌圈直 径平均值为7.693mm，发酵第二阶段pH值为12的德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii) M8对志贺氏菌产生的抑菌圈直径平均值为0.021mm。

发酵第二阶段pH值为4的德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8对大肠杆菌 产生的抑菌圈直径平均值为10.261mm，发酵第二阶段pH值为6的德尔布有孢圆酵母 (Torulaspora delbrueckii)M8对大肠杆菌产生的抑菌圈直径平均值为14.245mm，发酵第二 阶段pH值为7的德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8对大肠杆菌产生的抑菌圈 直径分别为14.367mm与15.863mm，发酵第二阶段pH值为8的德尔布有孢圆酵母(Torulaspora  delbrueckii)M8对大肠杆菌产生的抑菌圈直径平均值为13.638mm，发酵第二阶段pH值为 10的德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8对大肠杆菌产生的抑菌圈直径平均值为 5.053mm，发酵第二阶段pH值为12的德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8对大 肠杆菌产生的抑菌圈直径平均值为0mm。

本试验发酵第二阶段pH值为7德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8的抑菌 效果提高最为显著。

③德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8用YEPD液体培养基发酵培养，发酵 培养分为两阶段，发酵第一阶段发酵培养时间为12h，发酵培养温度为28℃；发酵第二阶段 发酵培养时间为1h，且发酵第二阶段中按每升YEPD液体培养基1.5g蛋白酶的比例投加蛋白 酶(不投加蛋白酶的设置为对照)；

其中YEPD液体培养基按比例由1g酵母膏、2g蛋白胨、2g葡萄糖和100mL蒸馏水组成， 发酵第一阶段YEPD液体培养基pH值为7；

第一组发酵第二阶段投加胰蛋白酶，发酵第二阶段发酵温度为37℃，发酵第二阶段YEPD 液体培养基pH值为8，每升YEPD液体培养基投加1.5mg胰蛋白酶，胰蛋白酶的酶活为 250U/mg；

第二组发酵第二阶段投加中性蛋白酶，发酵第二阶段发酵温度为40℃，发酵第二阶段 YEPD液体培养基pH值为7，每升YEPD液体培养基投加1.5mg中性蛋白酶，中性蛋白酶的 酶活为60U/mg；

第三组发酵第二阶段投加碱性蛋白酶，发酵第二阶段发酵温度为40℃，发酵第二阶段 YEPD液体培养基pH值为9，每升YEPD液体培养基投加1.5mg碱性蛋白酶，碱性蛋白酶的 酶活为200U/mg；

第四组为对照组，不投加蛋白酶，发酵培养温度为28℃，发酵培养时间为1h。

在灭菌平板中倒入8mL素琼脂，待凝固后在琼脂上放上牛津杯；分别向含有志贺氏菌和 大肠杆菌的斜面培养基中加入4ml生理盐水，然后震荡，再从中取0.5ml注入4.5ml无菌生 理盐水中，充分震荡，再重复上述梯度稀释3次，制备10^-3的菌悬液；用漩涡振荡器将菌悬 液震荡均匀后取1ml加入25ml营养培养基中，混匀倒入上述待用琼脂平板中，等琼脂凝固后 拔出牛津杯，在所留下的孔中分别加入上述100μl德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii) M8的浓缩发酵液；

其中，所述素琼脂由4g琼脂加入200ml蒸馏水中制成；

所述营养培养基1000mL由3～5g牛肉膏、10g蛋白胨、5g氯化钠、7.5g琼脂和余量的蒸 馏水制成，调解pH值为7.0、121℃条件下灭菌20min；

德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8的浓缩发酵液：将不同条件下培养的德 尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8发酵液在4000r/min条件下离心10min，将上 清液置于旋转蒸发仪中真空度660mmHg、55℃下浓缩至原体积的1/16，即得到德尔布有孢圆 酵母(Torulaspora delbrueckii)M8的浓缩发酵液。

将上述实验平板置于37℃的恒温培养箱培养12h，然后进行观察，发酵第二阶段投加不 同蛋白酶条件下德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8对志贺氏菌的抑菌效果如图 15所示，对大肠杆菌的抑菌效果如图16所示。

实验结果：发酵第二阶段未加入蛋白酶的德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii) M8对志贺氏菌产生的抑菌圈直径平均值为10.853mm，发酵第二阶段加入胰蛋白酶的德尔布 有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8对志贺氏菌产生的抑菌圈直径平均值为15.913mm， 发酵第二阶段加入中性蛋白酶的德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8对志贺氏菌 产生的抑菌圈直径平均值为14.139mm，发酵第二阶段加入碱性蛋白酶的德尔布有孢圆酵母 (Torulaspora delbrueckii)M8对志贺氏菌产生的抑菌圈直径平均值为13.227mm。

发酵第二阶段未加入蛋白酶的德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8对大肠杆 菌产生的抑菌圈直径平均值为9.471mm，发酵第二阶段加入胰蛋白酶的德尔布有孢圆酵母 (Torulaspora delbrueckii)M8对大肠杆菌产生的抑菌圈直径平均值为16.974mm，发酵第二 阶段加入中性蛋白酶的德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8对大肠杆菌产生的抑 菌圈直径平均值为15.843mm，发酵第二阶段加入碱性蛋白酶的德尔布有孢圆酵母 (Torulaspora delbrueckii)M8对大肠杆菌产生的抑菌圈直径平均值为16.159mm。

④德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8用YEPD液体培养基发酵培养，发酵 培养分为两阶段，发酵第一阶段发酵培养时间为12h，发酵培养温度为28℃；发酵第二阶段 发酵培养时间为1h，且发酵第二阶段中按每升YEPD液体培养基1.5g蛋白酶的比例投加蛋白 酶(不投加蛋白酶的设置为对照)；

其中YEPD液体培养基按比例由1g酵母膏、2g蛋白胨、2g葡萄糖和100mL蒸馏水组成， 发酵第一阶段YEPD液体培养基pH值为7；

第一组发酵第二阶段发酵温度为40℃，先调节YEPD液体培养基pH值为9加入碱性蛋 白酶1mg，碱性蛋白酶的酶活为200U/mg，发酵培养时间为0.5h；然后调节YEPD液体培养 基pH值为7加入中性蛋白酶0.5mg，中性蛋白酶的酶活为60U/mg，继续发酵培养时间为0.5h；

第二组先调节YEPD液体培养基pH值为8加入胰蛋白酶0.5mg，胰蛋白酶的酶活为 250U/mg，在37℃条件下发酵培养0.5h；然后调节YEPD液体培养基pH值为9加入碱性蛋 白酶1mg，碱性蛋白酶的酶活为200U/mg，在40℃条件下继续发酵培养时间为0.5h；

在灭菌平板中倒入8mL素琼脂，待凝固后在琼脂上放上牛津杯；分别向含有志贺氏菌和 大肠杆菌的斜面培养基中加入4ml生理盐水，然后震荡，再从中取0.5ml注入4.5ml无菌生 理盐水中，充分震荡，再重复上述梯度稀释3次，制备10^-3的菌悬液；用漩涡振荡器将菌悬 液震荡均匀后取1ml加入25ml营养培养基中，混匀倒入上述待用琼脂平板中，等琼脂凝固后 拔出牛津杯，在所留下的孔中分别加入上述100μl德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii) M8的浓缩发酵液；

其中，所述素琼脂由4g琼脂加入200ml蒸馏水中制成；

所述营养培养基1000mL由3～5g牛肉膏、10g蛋白胨、5g氯化钠、7.5g琼脂和余量的蒸 馏水制成，调解pH值为7.0、121℃条件下灭菌20min；

德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8的浓缩发酵液：将不同条件下培养的德 尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8发酵液在4000r/min条件下离心10min，将上 清液置于旋转蒸发仪中真空度660mmHg、55℃下浓缩至原体积的1/16，即得到德尔布有孢圆 酵母(Torulaspora delbrueckii)M8的浓缩发酵液。

将上述实验平板置于37℃的恒温培养箱培养12h，实验结果：第一组对志贺氏菌产生的 抑菌圈直径平均值为14.002mm，对大肠杆菌产生的抑菌圈直径平均值为16.027mm；第二组 对志贺氏菌产生的抑菌圈直径平均值为14.522mm，对大肠杆菌产生的抑菌圈直径平均值为 16.536mm。

本试验发酵第二阶段加入蛋白酶的德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)M8的抑 菌效果有显著提高。