一种自体富血小板血浆触变分离凝胶的制备及应用

摘要

本发明涉及一种自体富血小板血浆触变分离凝胶的制备及应用，属高分子化学和生物医学领域。它是以丙烯酸酯单体、纳米二氧化硅和硅烷化活性剂为原料，在氮气保护下搅拌加热反应，反应时间1~4小时，反应温度60~140℃；然后加入光引发剂，紫外光辐照，制得触变性复合高分子基胶，再将触变性复合高分子基胶与邻苯二甲酸二辛酯和span80进行共混，真空脱泡，然后经钴-60γ射线辐照制备得到的。其具有优异的触变性、生物相容性和稳定性，适用于生物医学上安全、简便、完全地提取自体富血小板血浆等生物活性物质。

说明书

技术领域

    本发明涉及自体富血小板血浆触变分离凝胶的制备及应用，属高分子化学和生物医学领域。

背景技术

自体富血小板血浆(Platelet-rich plasma, PRP)是自体血经分离产生的血小板浓缩物，自体PRP来源于自体，安全性能好，可从根本上排除了疾病传播和免疫排斥等问题。大量临床研究报道，PRP含有大量的各种血小板源性细胞生长因子，具有促进多种组织修复的作用，能促进骨和软组织的修复。PRP促进骨缺损修复可能主要基于以下两种机制：一种为PRP在激活剂作用下活化为富血小板凝胶(Platelet-rich gel, PRG)，其中含有大量纤维蛋白原，能封闭创面，促进组织收缩和愈合；另一种为聚合过程中血小板收缩、脱颗粒释放多种高浓度生长因子，包括血小板衍生生长因子(PDGF)、转移生长因子(TGF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子(EGF)等，这些细胞生长因子中最重要的是PDGF和TGF-β，PRP的作用是多种生长因子通过不同途径形成一系列信号转导，激活相应基因表达来完成的, 在组织修复与重建中起着重要作用：PDGF可刺激骨髓基质干细胞的有丝分裂，增加成骨细胞数量；还可刺激内皮细胞的有丝分裂，促进移植区的毛细血管生长，并增加胶原蛋白合成的能力；TGF-β则可促进前成骨细胞增殖并抑制骨吸收。PRG中其他生长因子也同时具有良好的促进骨与软骨修复和再生的作用。因而国外许多发达国家已将PRP用于临床治疗退化性关节炎，通过关节腔注射自体PRP，治疗有效率达到80%以上。所以，自体PRP在生物医学上具有重要的应用价值和广阔的开发前景。

然而，传统PRP制备方法是通过手工吸取方式分离得到PRP。该方法是在开放系统内离心制备PRP，并经过多个容器转移，过程较繁琐，易被外界污染；不同离心次数、离心力和离心时间制作的中血小板和生长因子浓度及活性也各不相同；而且手工吸取方式易使血小板激活，影响生长因子的有效获得。所以传统PRP制备方法不能确保PRP安全、有效地提取，因而影响了自体PRP在生物医学领域的开发应用。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的缺点和不足提供一种自体富血小板血浆触变分离凝胶的制备及应用。其具有很好的稳定性，适用于对安全性要求极高的自体富血小板血浆触变分离凝胶的提取制备。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

自体富血小板血浆触变分离凝胶，其特征在于：它是以丙烯酸酯单体、纳米二氧化硅和硅烷化活性剂为原料，在氮气保护下搅拌加热反应，反应时间1~4小时，反应温度60~140℃；然后加入光引发剂，紫外光辐照，制得触变性复合高分子基胶，再将触变性复合高分子基胶与邻苯二甲酸二辛酯和span80进行共混，真空脱泡，然后经钴-60γ射线辐照制得自体富血小板血浆触变分离凝胶。

按上述方案，所述的触变分离凝胶真空脱泡后填充于真空离心分离管底部后，再经钴-60γ射线辐照制备自体富血小板血浆触变分离凝胶。

按上述方案，所述丙烯酸酯单体为丙烯酸丙酯和丙烯酸羟乙酯的混合，或为丙烯酸丙酯、丙烯酸羟乙酯和丙烯酸异戊酯的混合，所述丙烯酸酯单体为丙烯酸丙酯和丙烯酸羟乙酯时，两种的质量比为1: 0.02-0.04；为丙烯酸丙酯、丙烯酸羟乙酯和丙烯酸异戊酯时，三者的质量比为1:0.03-0.05:0.1-0.5。

按上述方案，所述纳米二氧化硅的粒径为30-50nm，其用量为丙烯酸酯单体总质量的1-15wt%。

按上述方案，所述硅烷化活性剂为十二烷基三甲氧基硅氧烷，其用量为纳米二氧化硅质量的5-20wt%。

按上述方案，所述光聚合反应的光引发剂为艳固佳（Irgacure）2595，其用量为丙烯酸酯单体总质量的0.10～0.30wt%。

按上述方案，所述的紫外光辐照波长为365nm，辐照功率为30mWcm^-2，辐照时间为3-20min。

按上述方案，所述邻苯二甲酸二辛酯和span80用量均为触变性复合高分子基胶质量的0.5-5.0wt%。

按上述方案，所述钴-60γ射线辐照剂量为20~30kGy。

按上述方案，所述自体富血小板血浆触变分离凝胶的表观粘度为1~20×10⁴ mPa·s（旋转粘度计测试所得，测试温度25℃，测试转速0.3rpm），比重为1.09~1.15。

自体富血小板血浆触变分离凝胶在用于自体富血小板血浆制备中的应用，其应用方法为：在底部填充有自体富血小板血浆触变分离凝胶的真空离心分离管中，加入抗凝血剂溶液抽真空后，引入待提取制备自体富血小板血浆的自体全血，然后离心分离制备自体富血小板血浆。

本发明的有益效果：

1）本发明提供的自体富血小板血浆触变分离凝胶是一种既有氢键等物理交联、又有化学键交联的聚丙烯酸酯复合纳米凝胶，其具有很好的稳定性，与抗凝血剂溶液接触，无凝胶成分溶出。同时具有优异的触变性和生物相容性。适用于生物医学上安全、简便、完全地提取对安全性要求极高的自体富血小板血浆。目前虽然有血清分离胶的报道，但现有的血清分离胶都是以氢键等物理交联的复合凝胶，稳定性较差，不能适用于PRP的分离制备。

2）本发明通过利用自体富血小板血浆触变分离凝胶的触变性和PRP与血球比重差别，可在离心力的作用下实现PRP的有效分离、隔离和提取。经血小板计数检测，与全血相比，该PRP中血小板浓度增加3倍以上。

3）本发明可使整个PRP提取操作全部在一个密闭的无菌试管如真空离心分离管中完成，且操作效率大大提高，为生物医学提取自体PRP提供了一个极为安全、稳定和便捷的方法。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的发明内容作详细说明。

实施例1

将100g丙烯酸丙酯、2.0g丙烯酸羟乙酯、6.0g纳米二氧化硅和1.0g硅烷化活性剂投入到250ml四口瓶中，装上温度计、机械搅拌器、蒸馏头及冷凝收集装置，导入高纯氮气，打开冷凝水，并开始缓缓加热至60~80℃。在氮气保护下搅拌反应1小时。再加入光引发剂0.2g 艳固佳（Irgacure）2595，用紫外光（365nm, 30mWcm^-2）辐照3分钟，反应制得触变性复合高分子基胶。然后与2.0g 邻苯二甲酸二辛酯和0.6g span80进行共混，真空脱泡，填充于真空离心分离管底部，经钴-60γ射线辐照（30kGy），制备得到触变性复合高分子凝胶。

该凝胶的表观黏度为1.885×10⁵mPa﹒s（旋转粘度计测试所得，测试温度25℃，转速0.3rpm），触变指数3.61，比重1.13。取其约2g填充于真空离心分离管底部，加入抗凝血剂溶液抽真空后，引入待提取制备自体富血小板血浆的自体全血10毫升，然后离心分离制备自体富血小板血浆。经血小板计数检测，与全血相比，该PRP中血小板浓度增加3.12倍。

实施例2

将100g丙烯酸丙酯、4.0g丙烯酸羟乙酯、4.0g纳米二氧化硅和0.6g硅烷化活性剂投入到250ml四口瓶中，装上温度计、机械搅拌器、蒸馏头及冷凝收集装置，导入高纯氮气，打开冷凝水，并开始缓缓加热至70~90℃。在氮气保护下搅拌反应1.5小时。再加入光引发剂0.3g艳固佳（Irgacure）2595，用紫外光（365nm, 30mWcm^-2）辐照5分钟，反应制得触变性复合高分子基胶。然后与3.5g 邻苯二甲酸二辛酯和0.8g span80进行共混。填充于真空离心分离管底部，真空脱泡, 钴-60γ射线辐照（20kGy），制备得到触变性复合高分子凝胶。

该凝胶的表观黏度为1.045×10⁵mPa﹒s（旋转粘度计测试所得，温度25℃，转速0.3rpm），触变指数3.45，比重1.09。取上述底部填充有触变性复合高分子凝胶的真空离心分离管，向其中加入抗凝血剂溶液抽真空后，引入待提取制备自体富血小板血浆的自体全血，然后离心分离制备自体富血小板血浆。经血小板计数检测，与全血相比，该PRP中血小板浓度增加3.54倍。

实施例3

将100g丙烯酸丙酯、3.0g丙烯酸羟乙酯、20g丙烯酸异戊酯、7.5g纳米二氧化硅和1.1g硅烷化活性剂投入到250ml四口瓶中，装上温度计、机械搅拌器、蒸馏头及冷凝收集装置，导入高纯氮气，打开冷凝水，并开始缓缓加热至80~90℃。在氮气保护下搅拌反应2小时。再加入光引发剂0.3g 艳固佳（Irgacure）2595，用紫外光（365nm, 30mWcm^-2）辐照5分钟，反应制得触变性复合高分子基胶。然后与5.0g 邻苯二甲酸二辛酯和0.6g span80进行共混。真空脱泡，经钴-60γ射线辐照（25kGy）制备得到触变性复合高分子凝胶。

所得凝胶的表观黏度为1.132×10⁵mPa﹒s（温度25℃，转速0.3rpm），触变指数3.70，比重1.10。取其约2g填充于真空离心分离管底部，加入抗凝血剂溶液抽真空后，引入待提取制备自体富血小板血浆的自体全血10毫升，然后离心分离制备自体富血小板血浆。经血小板计数检测，与全血相比，该PRP中血小板浓度增加3.68倍。

实施例4

将100g丙烯酸丙酯、4.0g丙烯酸羟乙酯、6.0g纳米二氧化硅和1.0g硅烷化活性剂投入到250ml四口瓶中，装上温度计、机械搅拌器、蒸馏头及冷凝收集装置，导入高纯氮气，打开冷凝水，并开始缓缓加热至60~80℃。在氮气保护下搅拌反应1小时。再加入光引发剂0.2g艳固佳（Irgacure）2595，用紫外光辐照3分钟，反应制得触变性复合高分子基胶。然后与4.0g 邻苯二甲酸二辛酯和0.5g span80进行共混，真空脱泡，经钴-60γ射线辐照（30kGy）制备得到触变性复合高分子凝胶。

所得凝胶的表观黏度为1.625×10⁵mPa﹒s（温度25℃，转速0.3rpm），触变指数3.35，比重1.10。取其约2g填充于真空离心分离管底部，加入抗凝血剂溶液抽真空后，引入待提取制备自体富血小板血浆的自体全血10毫升，然后离心分离制备自体富血小板血浆。经血小板计数检测，与全血相比，该PRP中血小板浓度增加3.18倍。

实施例5

将100g丙烯酸丙酯、3.0g丙烯酸羟乙酯、20g丙烯酸异戊酯、8.5g纳米二氧化硅和1.4g硅烷化活性剂投入到250ml四口瓶中，装上温度计、机械搅拌器、蒸馏头及冷凝收集装置，导入高纯氮气，打开冷凝水，并开始缓缓加热至80~90℃。在氮气保护下搅拌反应2小时。再加入光引发剂0.3g艳固佳（Irgacure）2595，用紫外光照5分钟，反应制得触变性复合高分子基胶。然后与3.0g 邻苯二甲酸二辛酯和1.0g span80进行共混。真空脱泡，经钴-60γ射线辐照（25kGy）制备得到触变性复合高分子凝胶。

所得凝胶的表观黏度为1.832×10⁵mPa﹒s（温度25℃，转速0.3rpm），触变指数3.75，比重1.14。取其约2g填充于真空离心分离管底部，加入抗凝血剂溶液抽真空后，引入待提取制备自体富血小板血浆的自体全血10毫升，然后离心分离制备自体富血小板血浆。经血小板计数检测，与全血相比，该PRP中血小板浓度增加3.78倍。