一种与PSMA膜外区靶向性结合的多肽、放射性核素标记多肽及其应用

摘要

本发明属于医学领域，公开了一种与PSMA膜外区靶向性结合的多肽、放射性核素标记多肽及其应用。该多肽的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示，该多肽通过偶联剂来介导放射性核素进行标记，可用于制备治疗或诊断前列腺癌的靶向性药物。

说明书

技术领域

本发明属于医学领域，涉及一种与PSMA膜外区靶向性结合的多肽、放射性核素标记多肽及其应用。

背景技术

前列腺癌(PCa)已成为目前危害全球男性健康的主要恶性肿瘤，早期主要通过外科手术和放射治疗，但早期发现困难，就诊时多数已发生远处转移。未经治疗的PCa细胞多为雄激素依赖性，即通过阻断雄激素促使雄激素依赖性癌细胞凋亡，但雄激素依赖性PCa经过一段时间(平均14-30月)内分泌治疗后，大多数转为非激素依赖性前列腺癌(androgen independent prostate cancer,AIPC)，最终转化为激素难治性前列腺癌(Hormone refractory prostate cancer,HRPC)，目前对于HRPC及其转移灶尚无有效的治疗方法，临床统称为难治性前列腺癌，是导致PCa预后差、死亡率高的主要原因。

¹²⁵I、¹⁰³Pd粒子近距离放射治疗及外放疗是HRPC的治疗手段，但主要限于局部病灶。针对多发病灶的靶向内放射性治疗近年来备受关注，¹⁷⁷Lu是理想靶向内放射治疗性核素，常用于抗体、多肽及其类似物等的标记，且¹⁷⁷Lu通过反应堆辐射产生，具有低成本和易得性，具有适宜的物理半衰期(6.7d)，发射的β-粒子传能线密度及生物学效应高于¹²⁵I，组织平均射程小于200μm，适合杀死癌细胞，发射的γ射线可用于SPECT显像，以监测和指导治疗过程，因此，如何增加理想治疗性核素¹⁷⁷Lu在HRPC及转移灶的靶向性聚集和滞留是改善其预后亟待解决的难题，其中受体和配体的选择尤为重要。

前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen，PSMA)是一种II型跨膜糖蛋白，其大小约为100-120kD。它由3部分构成：短的胞内段(氨基酸1-18)，跨膜段(氨基酸19-43)和较长的胞外段(氨基酸44-750)，在高度恶性原发性PCa、HRPC及其转移灶的肿瘤细胞表面呈高丰度表达，且随PCa恶性进展而升高，而在前列腺、肾脏、肺脏、肝脏等正常组织、炎性增生性组织及其它良性病变细胞表面表达水平极低、甚至不表达，成为HRPC及其转移灶靶向治疗的主要靶蛋白。

作为配体，多肽较抗体分子量小，稳定性好，无免疫源性，不被网状内皮系统非特异性摄取，可通过化学修饰连接NOTA、CB-TE2A、PCTA、DOTA等偶联物，进行放射性核素标记，体外类合成(如固相法)过程简单、经济，为广泛临床应用提供了基础。更重要的是，多肽作为放射性核素载体，通过结构优化可获得体内药代动力学良好如血清除快、靶向特异性好、结合稳定的多肽。

若能够研制出一种能与PSMA胞外区特异性结合特性和具有靶向功能的多肽，对于PCa的诊断和治疗具有较好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是针对上述技术问题提供一种与PSMA膜外区靶向性结合的多肽。

本发明的另一个目的是提供由上述多肽制备的放射性核素标记多肽。

本发明还有一个目的是提供上述多肽制备治疗或诊断前列腺癌的靶向性药物中的应用。

本发明的目的是通过下列技术方案实现的：

一种与PSMA膜外区靶向性结合的多肽，该多肽的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。

一种放射性核素标记多肽，该放射性核素标记多肽是上述氨基酸序列如SEQ IDNo:1所示的多肽通过偶联剂来介导放射性核素进行标记。

所述的放射性核素标记多肽，其中偶联剂为DOTA、NOTA、CB-TE2A、PCTA或Hynic。

所述的放射性核素标记多肽，其中放射性核素为显像性放射性核素或治疗性放射性核素。

所述的放射性核素标记多肽，其中显像性放射性核素如⁶⁴Cu、⁶⁸Ga、¹¹¹In、^99mTc，治疗性放射性核素⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu、⁸⁹Sr。

氨基酸序列如SEQ ID No:1所示多肽在制备治疗或诊断前列腺癌的靶向性药物中的应用。

上述的放射性核素标记多肽在制备治疗或诊断前列腺癌的靶向性药物中的应用。

本课题组首次通过体外固相法合成PSMA膜外区靶向性结合的小分子直线多肽，其结构为多肽序列为Gly-Asp-His-Ser-Pro-Phe-Thr-Gly-Ser(SEQ ID No:1)，即甘氨酸-天冬氨酸-组氨酸-丝氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苏氨酸-甘氨酸-丝氨酸(以下简称PSMATP)，可与PSMA胞外段(氨基酸44-750)靶向结合，并与偶联剂(如DOTA、NOTA、CB-TE2A、PCTA、Hynic等)通过聚乙二醇(PEG_n，n＝0,1,2,3)连接，偶联剂介导多肽的放射性核素(如⁶⁸Ga、⁶⁴Cu、⁸⁹Sr、¹¹¹In、⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu和^99mTc)的标记。其中放射性核素可以是显像性放射性核素如⁶⁴Cu、⁶⁸Ga、¹¹¹In、^99mTc，也可以是治疗性放射性核素如⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu、⁸⁹Sr等。体外实验考查其体外稳定性，体内实验考察其体内药代动力学和生物学分布，并通过MicroPET/CT(或microSPECT/CT)显像评价其在前列腺癌肿瘤部位的放射性摄取。

本发明的有益效果：

本发明制备的小分子多肽PSMATP，能与PSMA膜外区靶向性结合，利用该多肽制备的放射性核素标记多肽，可作为诊断或治疗前列腺癌的靶向性药物，具有较好的效果。

同抗体不同，该多肽无免疫源性，分子量小，血液清除快，肝脾等富网状内皮系统摄取少且清除快，在前列腺等组织中分布少，而在前列腺癌(及其转移)病灶部位浓聚多，且滞留时间长，可有效作为诊断和治疗用放射性核素的载体。另外，由于PSMA膜外区长，高特异性结合的多肽序列的筛选和获得困难，本小分子多肽核苷酸序列通过噬菌体展示技术获得(噬菌体展示技术是公知技术，筛选过程不再赘述)，可通过体外固相合成法制备，利于量化和产业化生产。

附图说明

图1是DOTA-PSMATP的结构图。

图2是DOTA-PSMATP的HPLC检查。

图3是DOTA-PSMATP质谱图。

图4是⁶⁸Ga-DOTA-PSMATP的HPLC分析的放射性峰。

图5是⁶⁸Ga-DOTA-PSMATP的HPLC分析的紫外峰。

图6是前列腺癌(C4-2)荷瘤鼠尾静脉注射⁶⁸Ga-DOTA-PSMATP60min后行microPET/CT显像(左侧为3D图像，右侧为横断层融合图像)。

图7.荷瘤鼠(前列腺癌C4-2和胰腺癌PC-3)尾静脉注射¹⁷⁷Lu-DOTA-PSMATP前后不同时间的肿瘤体积变化。

图8.荷瘤鼠(前列腺癌C4-2和胰腺癌PC-3)尾静脉注射¹⁷⁷Lu-DOTA-PSMATP前后不同时间的体重变化。

图9.前列腺癌(C4-2)荷瘤鼠尾静脉注射¹⁷⁷Lu-DOTA-PSMATP后1d，5d，15d肿瘤组织病理检查结果(HE：×10)。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例1

一、多肽DOTA-PSMATP的合成及其质控

1、固相法直线多肽PSMATP的合成及与1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)的偶联

①多肽从C端到N端方向合成，先在树脂上挂第一个氨基酸，称取2.0g树脂于洁净干燥的反应管中，加入适量二甲基甲酰胺(DMF)，活化30min左右，然后称取第一个氨基酸Fmoc-Ser-OH0.5mmol，4-二甲氨基吡啶(DMAP)75mg，N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)1ml加入到反应管中，DMF做溶剂反应3h。反应完毕用DMF洗4～6次，加入适量吡啶和甲醇，体积比为1:1，反应30min。反应完毕用DMF洗4～6次。然后用哌啶溶液脱掉氨基酸的Fmoc，脱两次共15min，10min+5min。再用DMF洗4次，甲醇洗2次，取出少量树脂用茚三酮检测试剂检测，检测为蓝色，即可进行下一步反应；

②称取第二个氨基酸Fmoc-Gly-OH1.5mmol，HBTU1.5mmol于反应管中，加入DIEA0.5ml，反应40min，用DMF洗4～6次，取少量树脂用茚三酮检测试剂检测，显无色，然后加入哌啶溶液脱Fmoc，10min+5min，然后用DMF洗4次，甲醇洗两次，取出少量树脂用茚三酮检测试剂检测，检测为蓝色，即可进行下一步反应；

③以下氨基酸反应方法同②，氨基酸种类按SEQ ID No:1所示反向逐步增加，最终得到SEQ ID No:1所示多肽，即Gly-Asp-His-Ser-Pro-Phe-Thr-Gly-Ser；

④称取0.75mmol DOTA，苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)1.5mmol于反应管中，加入N,N-二异丙基乙胺(DIEA)0.25ml，经过用茚三酮检测试剂检测，检测为无色；

⑤最后用三氟乙酸切割液切割2h，反应液抽滤，得多肽的三氟乙酸溶液，用乙醚沉淀，离心，然后再用乙醚洗3～5次，得白色固体，经HPLC纯化，冻干，取少量进行质量分析。

2、质量分析：

使用高效液相色谱仪(HPLC)和质谱仪(MS)对目标化合物进行肽序、分子量和化学纯度进行质量分析

HPLC分析：参数：C18柱，(4.6*250mm)，流动相：溶剂A为含0.1％三氟醋酸的乙腈，溶剂B为含0.1％三氟醋酸的超纯水，流动相梯度如下：

流速：1.0ml/min，紫外波长：220nm，加样体积为10μl。

质谱分析条件：

二.结果

1.DOTA-PSMATP多肽分子结构式或结构图：见图1。

2.质控图像

(1)DOTA-PSMATP的HPLC检查结果见图2。

DOTA-PSMATP化学纯度：95.4％，储存：-4℃或者-20℃均较稳定。

HPLC图像如下：DOTA-PSMATP的出峰时间为10.039min。

结果如下：

注：1和3为合成本多肽时的杂质峰，但本多肽占合成物比例为95.4％。

(2)DOTA-PSMATP的质谱图结果见图3。

分子量:1290.29，水溶性好。

实施例2：⁶⁸Ga-DOTA-PSMATP的制备及体内外实验研究

一、⁶⁸Ga-DOTA-PSMATP的制备

配置DOTA-PSMATP多肽溶液为2mg/ml，HEPES为1M(PH：7)，⁶⁸GaCl₃为1-10mCi/ml。

取25μl的HEPES液(浓度1M)，分布依次加入0.7-5μl DOTA-PSMATP多肽溶液(2mg/ml)和100μl的⁶⁸GaCl₃(放射性浓度1-10mCi/ml)，置于95℃的水浴锅中加热，反应15-20min即得到⁶⁸Ga-DOTA-PSMATP。

二、⁶⁸Ga-DOTA-PSMATP体外实验

⁶⁸Ga-DOTA-PSMATP合成后，通过放射性-HPLC对其进行检测，方法及参数同前，结果显示⁶⁸Ga-DOTA-PSMATP的HPLC紫外峰和放射性峰在相同时间出现，见图4和5，放化纯(99.1±0.4％)，且生理盐水中37℃温育，放置2h、4h、6h后分别取20ul进行HPLC检查，结果未见⁶⁸Ga游离峰，表明其体外稳定性好，6h时放化纯为(97.5±0.4％)。

三、⁶⁸Ga-DOTA-PSMATP荷瘤鼠体内生物学分布

(1)抽样法随机选取荷前列腺癌(C4-2，PSMA阳性)裸鼠30只(雄性，体重18±2g)，分为6组(1-5组为实验组，第6组为受体阻断封闭组)，每组5只，分别在尾静脉注射放射性核素标记PSMA靶向多肽(如⁶⁸Ga-DOTA-PSMATP)(74kBq/0.1mL即2.0μCi/0.1mL)后10、30min、60、120min，3h，过量(200mg/Kg体重)苯戊巴比妥钠腹腔注射安乐处死，心脏穿刺取血1.0ml，并解剖分离肿瘤、心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、脑、肌肉、骨骼等脏器，生理盐水清洗、滤纸吸干表面水分，称湿重，γ计数仪(PerkinElmer Wizard-1480，Shelton,CT)测定放射性计数并记录时间，并计算注射净放射性活度，经放射性衰减校正后计算各时间点主要脏器的放射性占注入总放射性每分钟计数的百分率(ID％)和/或单位质量脏器的放射性占注入总放射性每分钟闪烁数的百分率(％ID/g)。分别收集大小便考察放射性排泄及HPLC考察其体内稳定性。其中，受体阻断封闭组：每只鼠经静脉预注射PSMATP(10mg/Kg体重)，然后尾静脉注射⁶⁸Ga-DOTA-PSMATP后60min处死，行生物学分布实验考察结合特异性(实验过程同前)。

结果：⁶⁸Ga-DOTA-PSMATP在前列腺癌荷瘤鼠尾静脉注射后，血本底清除快，药物主要经肝脏和肾脏排泄，60min即可出现肝肾部位放射性明显减低，肠道放射性摄取增加，考虑可能与⁶⁸Ga-DOTA-PSMATP经肠道排泄及部分经肠道重吸收有关，脑部位放射性摄取持续较低，考虑可能与其不能通过血脑屏障有关。前列腺正常组织放射性摄取明显低于肿瘤，60min时肿瘤/前列腺组织放射性摄取比值为4.9±0.7。PSMA受体阻断后，60min时前列腺癌皮下移植瘤放射性摄取明显被阻断，放射性摄取(％ID/g)为(1.30±0.53)，显著低于未阻断组(5.91±2.96)。

表1 前列腺癌荷瘤鼠注射68Ga-DOTA-PSMATP后不同时间点各脏器放射性摄取(％ID/g)

注：每组鼠数均为5只，60minB为受体阻断封闭组数据。数据以_表示。

四、⁶⁸Ga-DOTA-PSMATP前列腺癌(C4-2)荷瘤鼠microPET/CT显像

前列腺癌(C4-2)荷瘤鼠尾静脉注射0.1mL(3.7MBq)⁶⁸Ga-DOTA-PSMATP后50min，置于麻醉盒内，在3L/min的氧气流速下利用3％的异氟烷(Isoflurane)进行预麻醉。预麻醉后放入MicroPET/CT设备扫描床位进行扫描显像(2L/min的1.5％异氟的持续麻醉)。Micro PET/CT设备采集工作站为Inveon Acquisition Workplace(IAW)1.5.0.28，静态扫描数据采集顺序为在80kV电压、500μA电流和1100ms曝光时间下扫描CT数据10min，然后测动态采集PET数据60min。采集的数据结果利用IAW软件经分散、随机计数、死时间校正，通过滤波反投影法(Filtered Back projection)重建冠状面、横断面、矢状面断层图像进行分析。应用Inveon ResearchWorkplace软件，基于PET/CT融合图像，勾画肿瘤感兴趣区(Regions of Interest，ROI)，计算肿瘤放射性摄取及肿瘤/肌肉(T/M)放射性摄取比值。

结果：见图6，肿瘤部位可见明显放射性摄取，肿瘤/肌肉比值为9.7±3.1，肿瘤部位SUV为6.8±2.5，肝脏、脾脏、肺等重要脏器均未见明显放射性摄取，肠道和膀胱可见明显放射性分布，提示多肽主要经过肝胆系统和泌尿系统排泄，且排泄较快。(箭头所示为肿瘤部位)。

实施例3：⁶⁴Cu-DOTA-PSMATP的制备及体内外实验研究

除放射性核素为⁶⁴CuCl₂外，其余同实施例2。

结果1：⁶⁴Cu-DOTA-PSMATP放化纯(98.6±1.1％)，且生理盐水中37℃温育，放置2h、4h、6h后分别取20μl进行HPLC检查，结果未见⁶⁴Cu游离峰，表明其体外稳定性好，6h时放化纯为(96.8±0.8％)。

结果2：前列腺癌荷瘤鼠⁶⁴Cu-DOTA-PSMATP尾静脉注射后，体内生物学分布与⁶⁸Ga-DOTA-PSMATP相似，考虑主要原因为其体内生物学分布特点主要取决于DOTA-PSMATP，表现为主要经肝脏和肾脏排泄，清除快，60min可出现肝肾部位放射性摄取明显减低，肠道放射性摄取增加，脑部位放射性摄取持续较低，前列腺正常组织放射性摄取明显低于肿瘤，60min时肿瘤/前列腺组织放射性摄取比值为(4.77±0.35)。PSMA受体阻断后，60min时前列腺癌皮下移植瘤放射性摄取明显被阻断，放射性摄取(％ID/g)为(1.52±0.49)，显著低于未阻断组(5.14±0.85)。

表2 前列腺癌荷瘤鼠注射⁶⁴Cu-DOTA-PSMATP后不同时间点各脏器放射性摄取(％ID/g)

注：每组鼠数均为5只，60minB为受体阻断封闭组数据。数据以表示。

实施例4：¹¹¹In-DOTA-PSMATP的制备及体内外实验研究

除放射性核素为¹¹¹InCl₃外，其余同实施例2。

结果1：¹¹¹In-DOTA-PSMATP放化纯(98.9±1.7％)，且生理盐水中37℃温育，放置2h、4h、6h后分别取20μl进行HPLC检查，结果未见111In游离峰，表明其体外稳定性好，6h时放化纯为(97.1±0.97％)。

结果2：前列腺癌荷瘤鼠尾静脉注射¹¹¹In-DOTA-PSMATP后，体内生物学分布与⁶⁸Ga-DOTA-PSMATP相似，其血本底放射性清除快，且主要经肝脏和肾脏排泄，60min时表现为肝肾部位放射性摄取明显减低，肠道和膀胱放射性摄取增加，脑、肺等脏器放射性摄取持续较低，前列腺正常组织放射性摄取明显低于肿瘤，60min时肿瘤/前列腺组织放射性摄取比值为(4.73±0.28)。PSMA受体阻断后，60min时前列腺癌皮下移植瘤放射性摄取明显被阻断，放射性摄取(％ID/g)为(1.47±0.55)，显著低于未阻断组(5.20±0.53)。

表3 前列腺癌荷瘤鼠注射¹¹¹In-DOTA-PSMATP后不同时间点各脏器放射性摄取(％ID/g)

注：每组鼠数均为5只，60minB为受体阻断封闭组数据。数据以_表示。

实施例5：¹⁷⁷Lu-DOTA-PSMATP的制备及体内外实验研究

除放射性核素为¹⁷⁷LuCl₃外其余同实施例2。

结果1：¹⁷⁷Lu-DOTA-PSMATP放化纯(99.3±1.9％)，且生理盐水中37℃温育，放置2h、4h、6h后分别取20μl进行HPLC检查，结果未见177Lu游离峰，表明其体外稳定性好，6h时放化纯为(98.2±1.36％)。

结果2：前列腺癌荷瘤鼠尾静脉注射¹⁷⁷Lu-DOTA-PSMATP后，体内生物学分布与⁶⁸Ga-DOTA-PSMATP相似，¹⁷⁷Lu-DOTA-PSMATP血本底放射性清除快，且主要经肝脏和肾脏排泄，60min时表现为肝肾部位放射性摄取明显减低，肠道和膀胱放射性摄取增加，脑、肺等脏器放射性摄取持续较低，前列腺正常组织放射性摄取明显低于肿瘤，60min时肿瘤/前列腺组织放射性摄取比值为(4.38±0.65)。PSMA受体阻断后，60min时前列腺癌皮下移植瘤放射性摄取明显被阻断，放射性摄取(％ID/g)为(1.39±0.47)，显著低于未阻断组(4.96±0.77)。

表4 前列腺癌荷瘤鼠注射¹⁷⁷Lu-DOTA-PSMATP后不同时间点各脏器放射性摄取(％ID/g)

注：每组鼠数均为5只，60minB为受体阻断封闭组数据。数据以_表示。

实施例6：¹⁷⁷Lu-DOTA-PSMATP的荷瘤鼠药效学试验

前列腺癌(C4-2：PSMA高表达)皮下移植瘤动物模型分6组(每组4只)，荷胰腺癌PC-3(PSMA低表达)的动物模型为对照组。尾静脉注射¹⁷⁷Lu-DOTA-PSMATP(17.5MBq/0.1ml×0.1ml)，治疗过程中每隔一天测定老鼠体重和用游标卡尺测定肿瘤最大长径及垂直短径，通过公式计算肿瘤体积V，计算公式为V＝ab²/2(a为最大长径，b为垂直短径)，同时密切关注荷瘤鼠一般情况如饮食、皮肤色泽、精神状态、活动情况等，动态监测治疗药物毒副作用。在药物治疗前一天(即-1d)、治疗第1d、3d、5d、10d、15d，每组分别随机选择3只处死，取肿瘤及重要脏器进行病理学检查。

结果：¹⁷⁷Lu-DOTA-PSMATP安全性好，静脉注射后(17.5MBq)荷瘤鼠体重未见明显变化，PSMA高表达C4-2组与PSMA阴性表达PC-3组差异无统计学意义，荷瘤鼠饮食、皮肤色泽、活动情况未见明显异常。而荷瘤鼠皮下移植瘤大小变化见图7，在¹⁷⁷Lu-DOTA-PSMATP静脉注射后，C4-2前列腺癌体积未见明显变化，18d时肿瘤体积略高于治疗前，但差异无统计学意义，而PSMA表达阴性的胰腺癌PC-3组，肿瘤体积逐渐增加，在¹⁷⁷Lu-DOTA-PSMATP静脉注射后第8天，肿瘤体积(920±127mm³)明显高于治疗前(218±33mm³)及同时间C4-2组(248±51mm³)。荷瘤鼠(前列腺癌C4-2和胰腺癌PC-3)尾静脉注射¹⁷⁷Lu-DOTA-PSMATP前后不同时间的体重变化见图8。病理检查结果见图9，前列腺癌组织在¹⁷⁷Lu-DOTA-PSMATP静脉注射后5天可见灶状组织坏死，15天时肿瘤体积未见明显缩小，但内部肿瘤细胞大量坏死，无明显肿瘤细胞存在，肝肾等主要脏器未见明显异常。