团头鲂生长性状相关的微卫星分子标记及应用

摘要

本发明公开了团头鲂生长性状相关的微卫星分子标记及应用，本发明采用分群分离法，实现分子标记与性状的关联分析，最终筛选出两个与生长性状显著相关的分子标记，Mam116的引物为F:5’-CTATTTACAGTTTCATGCTTTCCTC-3’，R:5’-ATCCCGTCCGCCGCTTACT-3’；Mam166的引物为F:5’-GGTACTGTTTGTGCTGGGC-3’，R:5’-CTGCTCACTCAACTTATTGTAGGTC-3’。本发明对这两个标记进行不同基因型性状的多重比较，以确定劣势和优势等位基因，在团头鲂性状相关育种中选择含有正效基因型的个体作为选育亲本，避开含有负效基因型的个体，可减小实验工作量，加快育种效率。

说明书

技术领域

本发明涉及鱼类分子标记辅助选育技术，具体涉及与团头鲂生长性状相关的微卫星分子标记及应用。

背景技术

团头鲂(Megalobrama amblycephala Yih,1955)，又名武昌鱼，隶属于硬骨鱼纲，鲤形目，鲤科，鲂属，其自然分布仅局限于长江中下游少数几个湖泊中。因其味道鲜美、食性广、生长快、易捕捞而广受消费者与养殖者喜爱。由于团头鲂鱼种生产中普遍存在近亲繁殖的现象导致种质退化加剧常规苗种的生长速较慢。虽然我国已经选育出了生长过那速度较快的团头鲂浦江1号，但苗种仍不能满足市场需求。还有待进一步加强团头鲂种质资源监测、评估与保护，选育出生长快、抗逆性好的团头鲂优良品种(王卫民，2009)。

鱼类的生长性状为数量性状，为多个基因控制，这些基因在染色体上占据一定的区域，称为数量性状位点(Quantitative Trait Locus)。一个数量性状的QTL并不是很多，存在着主效基因(李宁，1997)。这些QTL的一个或两个主效基因就能反映一个数量性状表型变异的10％-50％以上。因此我们可以通过找到控制这些性状的基因或者标记，对鱼类的经济性状进行遗传改良。微卫星DNA，又称简单串联重复序列(simple sequence repeat，SSR)，是由2～6个碱基为基本单元多次串联重复的核苷酸序列，广泛分布于真核生物的基因组中(Hamada et al.,1982)，由于其具有共显性遗传、检测方便、多态信息含量高等优点，被广泛应用于水产动物群体遗传结构分析、遗传连锁图谱的构建、QTL定位和标记辅助选择育种等方面(孙效文，2004；Liao et al.,2009)。张义凤等(2008)利用来自遗传连锁图谱和已发表的的47对微卫星引物对柏氏鲤和荷包红鲤抗寒品系自F2代进行体重、体长和体高进行了相关性分析，结果找到7个与生长性状相关的位点，并找到3种性状相关的基因型。刘贤德等(2013)筛选到2个与大黄鱼生长性状紧密相关的微卫星标记及其相应的优势基因型。

常规的选育是根据性状的表型而不是基因型进行选择，对目标性状缺乏预选手段，育种周期长、效率低。现代分子生物学技术的发展使根据与性状相关的基因或分子标记进行选择成为可能。目前尚未见团头鲂生长性状相关分子标记的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供了团头鲂生长性状相关的微卫星分子标记Mam116和Mam166，Mam116的引物为F:CTATTTACAGTTTCATGCTTTCCTC，R:ATCCCGTCCGCCGCTTACT；Mam166的引物为F:GGTACTGTTTGTGCTGGGC，R:CTGCTCACTCAACTTATTGTAGGTC；该分子标记为团头鲂生长性状的QTL定位和分子标记辅助育种工作奠定基础。

本发明的另一个目的在于提供了与团头鲂生长性状相关的微卫星分子标记在团头鲂分子辅助育种中的应用，即基于分子标记的优势等位基因筛选生长性状优良的个体。

本发明是通过以下技术方案实现的：

与团头鲂生长性状相关的微卫星分子标记，通过以下步骤筛选得到：

(1)2009年6月，对来自梁子湖、淤泥湖、鄱阳湖的42尾母本，50尾父本进行人工繁殖，繁殖子代在同一池塘中进行养殖。2011年3月随机打捞池塘中的团头鲂F1代进行编号，测量体长、体高和体重。按照体重数据，选择体重大于0.4kg的个体记为大个体组(Top)与体重小于0.28kg的个体记为小个体组(Below)，各96尾；

(2)剪取步骤(1)的团头鲂F1代实验个体的鳍条组织，采用醋酸铵法提取鳍条组织的基因组DNA做为模板，选用17对微卫星引物对微卫星位点进行PCR扩增；

(3)团头鲂F1代个体在17个微卫星位点的PCR产物经过8％(W/V)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和硝酸银染色方法检测位点的多态性，利用PopGene(Version 3.2)软件统计各微卫星位点的等位基因数(number of alleles,Na)和观测杂合度(Observed heterozygosity,Ho)。利用SAS软件中的GLM一般线性模型对团头鲂生长性状与微卫星位点的关联性进行最小二乘分析，对同一标记基因型之间生产性状指标差异显著性进行检验并进行多重比较；

(4)通过一般线性模型对团头鲂的生长性状与17对微卫星标记进行相关性分析，结果发现17个微卫星位点中，位点Mam116、Mam166均与体长、体重、体高均表现出显著相关(P<0.05)；

(5)对2个位点的基因型进行多重比较分析，确定优势和劣势等位基因，最终确定Mam116的优势基因型为172/176、154/176、176/176和176/182；Mam166的优势基因型为129/129、123/123、123/129和123/135。

团头鲂生长性状相关的微卫星分子标记在团头鲂分子辅助育种中的应用，应用过程为：分析个体的基因型，通过是否含有Mam116位点和Mam166位点的优势基因型来判断个体是否为生长性状优良的个体，从而选择来做亲本。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明采用分群分离法，从同批繁殖，同塘饲养的团头鲂中以体重为标准，选择了体重大于0.4kg的个体与体重小于0.28kg的个体各96尾进行分析，从而实现分子标记与性状的关联分析。

(2)本发明加大了大个体组和小个体组的样本容量，以期能够更加快速精确地获得与性状相关的标记。

(3)本发明对2个与体长、体重、体高存在极显著差异的标记进行不同基因型性状的多重比较，在一定程度上减小了实验工作量，同时节省了一定的人力、物力、财力。

(4)本发明对2个标记进行不同基因型性状的多重比较，以确定劣势和优势等位基因，最终运用标记辅助选择，在实践过程中可尽量选择含有正效基因型的个体作为选育亲本，避开含有负效基因型的个体。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术。

实施例1：

与团头鲂生长性状相关微卫星标记的筛选：

(1)材料来源

2009年6月，对来自梁子湖、淤泥湖、鄱阳湖的42尾母本，50尾父本进行人工繁殖，繁殖子代在同一池塘中进行养殖。2011年3月随机打捞池塘中的团头鲂F1代，编号，测量体长、体高和体重数据，剪取鳍条保存于100％酒精中备用。按照体重数据，选择体重大于0.4kg的个体，记为大个体组(Top)，体重小于0.28kg的个体各96尾，记为小个体组(Below)，作为实验对象进行微卫星基因型分析；同时将每个组的60尾个体作为与团头鲂生长性状相关微卫星位点初步筛选的大小群体，将每个组另外36个个体作为与团头鲂生长性状相关联微卫星位点验证的大小群体。

(2)微卫星引物

本发明中17对微卫星引物为表1所示，引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 本发明中17对微卫星引物信息

T：退火温度；Na：等位基因数；Ho：观测杂合度。

(3)团头鲂总DNA的提取

采用醋酸铵法提取团头鲂鳍条组织的DNA，提取的DNA由1％琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000超微量分光光度计检测其完整性和浓度，-20℃保存备用。

(4)微卫星DNA的扩增

每个PCR反应体系总体积为20μl，其中包括10×buffer(含Mg²⁺)2.0μl，dNTPs(10mmol)0.4μl，上下游引物(10μmol)各0.5μl，Taq酶1U，DNA模板约100ng。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，引物复性温度30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min。扩增产物通过8％(W/V)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和硝酸银染色检测其多态性。

(5)数据统计与分析

用PopGene(Version 3.2)软件统计各微卫星位点的等位基因数(number of alleles,Na)和观测杂合度(Observed heterozygosity,Ho)。利用SAS软件中的GLM一般线性模型对团头鲂生长性状与微卫星位点的关联性进行最小二乘分析，对同一标记基因型之间生产性状指标差异显著性进行检验并进行多重比较。观察值少于4次的基因型，因缺少分析价值，在此不作统计分析。

(6)与团头鲂生长性状相关微卫星位点的初步筛选

1)微卫星位点的多态性

本实验所用17对微卫星都能扩出稳定清晰的条带。17个位点中共检测到204个等位基因，其中位点Mam144、Mam12、Mam46的多态性最高，等位基因数均在14以上，杂合度均大于0.8。位点Mam147的多态性较低，在两个组中的等位基因数分别为5。大个体组的等位基因数在5～17之间，平均等位基因数为9.5，杂合度位于0.5658～0.8928之间，平均杂合度为0.7627。小个体组的等位基因数在4～18之间，平均等位基因数为10.2，杂合度位于0.4489～0.8851之间，平均杂合度为0.7150。两个组的遗传多样性没有显著差异。

2)团头鲂微卫星标记与生长性状的相关性分析

利用一般线性模型对团头鲂的生长性状与17对微卫星标记进行相关性分析，结果发现17个微卫星位点中，位点Mam166和Mam116均与体长、体重、体高均表现出极显著相关(P<0.01)。

实施例2：

位点Mam166和Mam116基因型的正负效应：

对2个位点的基因型进行多重比较，推断出各个微卫星标记位点上的劣势等位基因，从而初步判断以上基因型对性状起着或正或负的效应。

本发明所述的位点的基因型以Quantity One软件读取位点PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳和硝酸银染色后所显示的条带大小(bp)为准。例如位点Mam116，121/121基因型指通过引物仅扩增出121bp的一条条带；154/176基因型指通过引物扩增出154bp和176两条条带。

对2个位点的基因型进行多重比较分析发现，在位点Mam116中，共获得11种基因型，其中121/121，121/129，121/133基因型之间在体重上没有显著差异(P>0.05)，但显著低于其他基因型(P<0.05)；176/182除了与154/176，176/176，172/176无显著差异性之外(P>0.05)，显著高于其它基因型(P<0.05)；123/123，154/176，154/172，154/182，176/176，172/176，172/180两两之间无显著差异(P>0.05)。在体长与体高方面，154/172，154/182，172/180，176/176，172/176，154/176，123/123，176/182之间没有显著差异(P>0.05)，其表型值显著高于121/121，121/129，121/133基因型个体(P<0.05)；在体长方面121/133显著高于121/129(P<0.05)，而在体高方面121/121，121/129，121/133基因型之间没有显著差异(P>0.05)。

在位点Mam166中，共获得8种基因型，在体重、体长与体高方面，123/123，123/129，123/135，129/129基因型之间没有显著差异(P>0.05)，但显著高于261/269，261/279，269/269，269/279基因型(P<0.05)；在体重与体高中，261/269，261/279，269/269，269/279基因型之间无显著性差异(P>0.05)；在体长方面，269/279基因型显著低于其他基因型(P<0.05)。两个位点不同基因型个体表型的多重比较如下：

表2 位点Mam116不同基因型个体表型的多重比较

表3 位点Mam166不同基因型个体表型的多重比较

注：表2和表3中同一列中相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同字母表示差异显著(P<0.05)。

确定Mam116的优势基因型为172/176、154/176、176/176和176/182；Mam166的优势基因型为129/129、123/123、123/129和123/135。

实施例3：

与团头鲂生长性状相关的微卫星分子标记在团头鲂分子辅助育种中的应用，应用过程如下：

1)从两个位点的分析结果中分别选取均值最大的3个正效应基因型，均值最小的3个负效应基因型作为选择标准(不足不取)，结果见表4。

表4 两个位点的正效应和负效应基因型

2)在验证群体的72个F1代(实施例1)个体中进行基因型分析，选取其中含有正或负效应基因型的个体进行生长性状的多重比较与差异显著性分析，结果见表5。

表5 验证群体的正或负效应基因型的个体分析

注：同一生长性状中相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同字母表示差异显著(P<0.05)。N为检测到的F1代个体数。

3)从结果中可以直观的看到，在Mam116和Mam166两个标记中，只要包含优势基因型个体的生长性状值要显著高于带有劣势基因型个体的生长性状值。因此可以利用Mam116或Mam16标记选择含有正效基因型的个体作为选育亲本，且避开含有负效基因型的个体，从而减少育种的工作量，提高育种效率。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  华中农业大学   湖北百容水产良种有限公司

 

<120>  团头鲂生长性状相关的微卫星分子标记及应用

 

<130>  团头鲂生长性状相关的微卫星分子标记及应用

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

<210>  1

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

ctatttacag tttcatgctt tcctc                                           25

 

 

<210>  2

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

atcccgtccg ccgcttact                                                  19

 

 

<210>  3

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

ggtactgttt gtgctgggc                                                  19

 

 

<210>  4

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

ctgctcactc aacttattgt aggtc                                           25