法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2017-07-21
授权
授权
2015-01-14
实质审查的生效 IPC(主分类):A61K39/116 申请日:20040507
实质审查的生效
2014-12-24
公开
公开
本申请是申请日为2004年5月7日的、发明名称为“多价脑膜炎球菌 衍生的多糖-蛋白质缀合物及疫苗”的中国专利申请200480019306.6 (PCT/US2004/014466)的分案申请。
本申请要求2003年5月7日提交的美国临时专利申请号60/468,581 的优先权，其在文中全部公开引用作为参考。
发明背景
1.发明领域
本发明总的来说涉及医学领域，并且更具体的涉及到微生物学、免疫 学、疫苗以及通过免疫对细菌病原体感染的预防。
2.相关领域概述
脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)是全球细菌性脑膜炎和脓毒 症的主要原因。在最近的30年中，地方性脑膜炎球菌疾病的发生率在发达 国家为每100,000人中有1到5人，而在发展中国家为每100,000人中有 10到25人(Reido,F.X.等，(1995)Ped.Infect.Dis.J.14,643-657页)。流行 期间脑膜炎球菌疾病的发病率可达每1000,000人中有1,000人。在美国， 每年大约有2,600例细菌性脑膜炎病例，而在发展中国家平均有330,000 例。病例致死率在10到20％之间。
病原脑膜炎球菌被附着在生物体外膜表面的多糖荚膜所包被。基于荚 膜多糖的免疫学特异性，已经鉴定出13种不同的脑膜炎球菌血清群(Frasch, C.E.等，(1985)Rev.Infect.Dis.7,504-510页)。在这13个血清群当中有5 个引起了大多数的脑膜炎球菌疾病；它们包括血清群A、B、C、W135和 Y。血清群A引起大部分流行性疾病。血清群B、C和Y引起大多数的地 方病和疾病的区域性爆发。
人类鼻-口咽粘膜是唯一已知的脑膜炎奈瑟氏球菌的天然贮库。细菌在 粘膜细胞的外表面以及鼻咽的皮下组织定居。脑膜炎球菌可被持续携带几 个月。脑膜炎球菌通过直接接触或通过空气飞沫传播。脑膜炎球菌是以吞 噬泡的形式通过胞吞作用经由粘膜上皮侵入的。对入侵的脑膜炎球菌的宿 主防御依赖于补体介导的溶菌作用。在补体介导的溶菌作用中发挥作用的 血清抗体相当大部分直接针对外部荚膜多糖。
已经描述了基于脑膜炎球菌多糖的疫苗，其引起针对荚膜多糖的免疫 应答。这些抗体可以对血清群特异性脑膜炎球菌引起补体介导的溶菌作用。 脑膜炎球菌多糖疫苗显示对儿童和成人有效(Peltola,H.等，(1997)New Engl.J.Med 297,686-691页和Artenstein,M.S.等，(1970)New Engl.J. Med.282,417-420页)，但对婴儿和幼儿期效能有限(Reingold,A.L.等， (1985)Lancet 2,14-118页)。对年幼群体，此多糖的后继给药产生弱加强应 答或无加强应答(Goldschneider,I.等，(1973)J.Infect.Diseases 128, 769-776页和Gold,R.等，(1977)J.Infect.Diseases.136,S31-S35页)。脑膜 炎球菌多糖疫苗的保护期不能持续很长，并且据估计对成人和大于4岁的 儿童而言为3到5年(Brandt,B.L.和Artenstein,M.S.(1975)J.Infect. Diseases.131,S69-S72页；Kyhty,H.等，(1980)J.Infect.Diseases.142, 861-868页,和Cessey,S.J.等，(1993)J.Infect.Diseases.167,1212-1216 页)。对1到4岁的儿童而言保护期少于3年(Reingold,A.L.等，(1985) Lancet 2,114-118页)。
多糖不能与主要组织相容性复合体分子结合，而这是抗原呈递和刺激 T-辅助淋巴细胞的前提条件，即它们是非T-细胞依赖性抗原。多糖能够不 需要T-辅助淋巴细胞的辅助而刺激B淋巴细胞产生抗体。由于对B淋巴细 胞的非T-细胞依赖性刺激，这些抗原免疫后缺乏记忆诱导。在成人体内， 多糖抗原可以产生非常有效的非T-细胞依赖性应答，但在婴儿和幼儿的不 成熟免疫系统中这些非T-细胞依赖性应答却很弱。
非T-细胞依赖性多糖抗原可以通过将多糖共价缀合至蛋白质分子(“载 体”或“载体蛋白质”)上而转变为T-细胞依赖性抗原。与缀合疫苗的多糖组 分结合的B细胞可以被肽特异的T辅助细胞激活，所述肽为缀合的载体蛋 白质的一部分。对载体蛋白质的T-辅助细胞应答可以增加针对多糖的抗体 的产生。
已经证明，血清群B多糖在人群中具有极弱的免疫原性至无免疫原性 (Wyle,F.A.等，(1972)J.Infect.Diseases.126,514-522页)。这一血清群多 糖与蛋白质的化学缀合在实验动物中没有显著改变免疫应答(Jennings,H. J.和Lugowski,C.(1981)J.Immunol.127,1011-1018页)。据认为对这一血 清群多糖缺乏免疫应答的原因是：血清群B多糖与多唾液酸化的宿主糖蛋 白如神经细胞粘附分子之间的结构相似性。
一种基于血清群C多糖的脑膜炎球菌缀合疫苗已有叙述。这种单价疫 苗可引起针对相应于血清群C的脑膜炎奈瑟氏球菌株系上存在的荚膜多糖 的强功能抗体应答。这种疫苗仅仅能够预防由血清群C细菌引起的疾病。
现有的基于脑膜炎球菌多糖的疫苗对幼儿的用途有限，而且不能为成 人提供长时间保护。已被证实能够对所有有危险感染脑膜炎球菌的群体(包 括儿童)产生长时间保护的唯一脑膜炎球菌疫苗是基于脑膜炎奈瑟氏球菌 单一血清群的多糖，其不能提供针对其它血清群感染的保护。因此，就需 要一种能够在脑膜炎球菌感染的易感儿童和成人中对脑膜炎球菌疾病产生 广谱、长效保护的脑膜炎球菌缀合疫苗。本发明的多价脑膜炎球菌多糖通 过提供疫苗制剂解决了这一需要，其中在所述制剂中来源于脑膜炎奈瑟氏 球菌主要致病血清群的免疫原性多糖通过与载体蛋白质缀合而转变成T- 细胞依赖性抗原。
美国食品药品管理局(FDA)颁发的脑膜炎球菌多糖疫苗许可证是基于 使用幼兔补体的杀菌力试验方法(SBA-BR)，该方法是通过用所许可疫苗免 疫后的血液样品进行的。许多政府和专家小组公布了在此类试验方法中评 价脑膜炎球菌多糖疫苗的目前规程和推荐意见，例如：
世界卫生组织生物制品标准化专家委员会(WHO Expert Committee on Biological Standardization)指出：用针对脑膜炎奈瑟氏球 菌血清群A和C的脑膜炎球菌疫苗免疫健康成年受试者可诱导产生杀 菌抗体(WHO 1976)；
国际比较研究中的CDC SB-BR建立了用于使用标准参考品血清即 CDC供体R21654-3430107测定法的标准化参数，所述血清是比较研究 中质量控制血清样品之一(Maslanka SE等,1997.Clin.Diagn.Lab. Immunol.4:156-167)；和
世界卫生组织疫苗和生物制品开发专家委员会(WHO Expert Committee of the Department of Vaccines and Biologicals)推荐的标准 化CDC方法作为最佳方法(WHO 1999)。
由于已经证明人类对脑膜炎球菌疾病的免疫性与血清杀菌力试验 (SBA)中补体介导杀菌的抗体水平密切相关，所以同意颁发许可证 (Goldschneider,I等，1969，J.Exp.Med.129:1307-1326和Goldschneider,I 等，1969，J.Exp.Med.129:1327-1348)。在使用人补体的杀菌力试验(SBA-H) 中，已经确定了抗血清群C的1:4SBA滴度的替代水平。但是，对脑膜炎 球菌多糖疫苗许可的必要条件是基于在使用幼兔补体作为补体来源的试验 中(SBA-BR)能够诱导血清杀菌反应(世界卫生组织(World Health Organization)，1976，Requirements for meningococcal polysaccharide vaccine.世界卫生组织技术报告系列，第594号.世界卫生组织，Geneva， 瑞士(WHO，1976))。根据此建议，受试者免疫接种脑膜炎球菌多糖疫苗 2-4周后，检测其抗下列靶菌株或同等菌株(Al对应血清群A，C11对应血 清群C，S-1975对应血清群Y，且S-4383对应血清群W-135)时发现至少 90％受试者的血清抗体滴度升高4倍或更多(WHO 1976,WHO 1981,生物 制品局(Bureau of Biologics),美国食品药品管理局，1985年7月17日)。 生物制品局采纳了WHO的建议，并且根据此规程脑膜炎球菌多糖疫苗(血 清群A和C组合以及血清群A、C、Y和W-135组合)在美国得到许可。 为了利于各实验室之间对脑膜炎球菌疫苗诱导的杀菌活性的比较，经过多 实验室研究建立了一种利用幼兔补体的标准化SBA(SBA-BR)(Maslanka SE等,1997.Clin.Diagn.Lab.Immunol.4:156-167.)。
由于脑膜炎球菌缀合C疫苗的资料开始可以得到，开始出现如下的担 心，即在分析中使用幼兔补体可能导致假的高SBA滴度。在1999年3月 召开的澄清和解决关于实验室测定法用于分析人脑膜炎球菌血清群A和C 特异性抗体的问题的会议之后，世界卫生组织生物制品标准化专家委员会 建议使用幼兔补体的SBA可以用于检测对血清群C的抗体反应(世界卫生 组织，1999.Standardization and validation of serological assays for the evaluation of immune responses to Neisseria meningitidis serogroup A/C vaccines.Geneva，WHO/V&B/99.19(WHO 1999))。为了尽力避免使用幼 兔补体对保护作用的过高评价，WHO建议开展研究以便将通过使用幼兔 补体的SBA试验所测定的SBA阈值滴度与使用人补体所测定的SBA滴度 关联起来。随后召开了会议，得出的结果支持这样一个总的结论：使用幼 兔补体时<1:8的SBA滴度缺乏抗血清群C的保护作用，而使用幼兔补体 时≥1:128的SBA滴度与使用人补体时的1:4保护性SBA滴度密切相关。 没有信息提供对于其它脑膜炎球菌血清群如A、Y或W-135或多糖缀合物 的相应关联SBA-BR滴度。
使用幼兔补体时的1:8和1:64之间的SBA滴度没有必要与使用人补 体时1:4的保护性SBA滴度密切相关(Jodar L等，Biologicals 2002；30: 323-329)。WHO专家委员会推荐，接种疫苗后SBA-BR滴度为1:8、1:16、 1:32和1:64时需要使用人补体进行再评价。解决1:8、1:16、1:32和1:64 的SBA-BR滴度不确定性的其它措施包括经评价接种疫苗前和接种疫苗后 之间的抗体SBA滴度的4倍升高。也提供了与保护作用相关联的记忆性的 示例，然而专家委员会承认有关这些替代品的可以得到的资料是不充分的 或者是有限的。
高于1:8的SBA-BR滴度是表明人对脑膜炎球菌疾病产生免疫性的较 好的指标，该滴度是从免疫前至免疫后大约15至大约45天的免疫后阶段 内SBA-BR滴度的4倍升高或更高。
在一种实施方案中，本发明提供了用多价脑膜炎球菌多糖缀合组合物 免疫病人的方法，其中病人血清SBA-BR滴度为1:16或更高，优选地为 1:32或更高，更优选地为1:64或更高，并且甚至更加优选地为1:128或更 高。在进一步的实施方案中，本发明提供了用脑膜炎球菌多糖缀合组合物 免疫病人的方法，其中接种疫苗前后病人抗体SBA滴度升高4倍或更高。
在另一个实施方案中，本发明通过用多价脑膜炎球菌多糖缀合组合物 免疫病人来为病人提供抗脑膜炎奈瑟氏球菌多种血清群免疫性的方法，其 中组合物包含选自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A和W-135；Y和W-135；C 和Y；C和W-135；A、C和Y；A、C和W-135；C、Y和W-135；A、 Y和W-135以及A、C、Y和W-135中的两种或两种以上多糖。
在进一步的实施方案中，本发明通过用多价脑膜炎球菌(纯化的)多糖 缀合组合物免疫病人来为病人提供抗脑膜炎奈瑟氏球菌多种血清群免疫性 的方法，其中多糖被衍生为小于100,000道尔顿。在本发明的一个实施方 案中，纯化的多糖被解聚成大约5,000至大约75,000道尔顿的平均多糖大 小；优选地为大约7,000至大约50,000道尔顿的平均多糖大小；更加优选 地为大约8,000至大约35,000道尔顿的平均多糖大小；甚至更加优选地为 大约12,000至大约25,000道尔顿的平均多糖大小。在本发明的一个实施方 案中，组合物中平均多糖大小在大约15,000至大约22,000道尔顿之间。
发明概述
本发明提供了向人体提供抗致病脑膜炎奈瑟氏球菌所致脑膜炎球菌疾 病免疫性的方法，其是通过施用脑膜炎球菌多糖-蛋白缀合物的免疫组合物 实现的。
在本发明的一个实施方案中，免疫组合物包含两种或两种以上蛋白质- 多糖缀合物，其中每种缀合物均包含与载体蛋白质缀合的来自脑膜炎奈瑟 氏球菌的荚膜多糖。在优选的实施方案中，免疫组合物包含两种或两种以 上不同的蛋白质-多糖缀合物，其中每种缀合物均包含与载体蛋白质缀合的 来自脑膜炎奈瑟氏球菌不同血清群的荚膜多糖。
本发明提供了向人体提供抗致病脑膜炎奈瑟氏球菌所致脑膜炎球菌疾 病免疫性的方法，其包括施用包含两种或两种以上不同蛋白质-多糖缀合物 的免疫组合物，其中每种缀合物均包含与载体蛋白质缀合的来自脑膜炎奈 瑟氏球菌不同血清群的荚膜多糖。
本发明提供了向人体提供抗致病脑膜炎奈瑟氏球菌所致脑膜炎球菌疾 病免疫性的方法，其包括施用脑膜炎球菌多糖-蛋白质缀合物。本发明提供 了多价脑膜炎球菌疫苗，其由包含免疫有效量的2-4种不同的蛋白质-多糖 缀合疫苗，其中每一缀合物各包含与载体蛋白质缀合的不同荚膜多糖，并 且其中每一荚膜多糖选自血清群A、C、W-135和Y的荚膜多糖。本发明 还提供了诱导抗脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖的免疫反应的方法，其包括向 人施用免疫有效量的本发明免疫组合物。在一个实施方案中，多价脑膜炎 球菌疫苗包含免疫有效量的两种不同的蛋白质-多糖缀合物，其中每一缀合 物包含与载体蛋白质缀合的不同荚膜多糖，并且其中每一荚膜多糖选自血 清群A、C、W-135和Y的荚膜多糖，更加优选地，多价脑膜炎球菌疫苗 包含荚膜多糖A和W-135、A和Y、C和W-135、C和Y以及W-135和 Y。在一个实施方案中，多价脑膜炎球菌疫苗包含免疫有效量的三种不同 的蛋白质-多糖缀合物，其中每一缀合物包含与载体蛋白质缀合的不同荚膜 多糖，并且其中每一荚膜多糖选自血清群A、C、W-135和Y的荚膜多糖， 更加优选地，多价脑膜炎球菌疫苗包含荚膜多糖A、C和W-135；A、C 和Y；C、Y和W-135；C、W-135和Y以及A、W-135和Y。在另一个 实施方案中，多价脑膜炎球菌疫苗包含免疫有效量的四种不同的蛋白质- 多糖缀合物，其中每一缀合物包含与载体蛋白质缀合的不同荚膜多糖，并 且其中每一荚膜多糖选自血清群A、C、W-135和Y的荚膜多糖。
本发明还提供了诱导抗脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖的免疫反应的方 法，其包括向人或动物施用免疫有效量的本发明免疫组合物。
本发明提供了多价脑膜炎球菌疫苗，其包含免疫有效量的2-4种不同 的蛋白质-多糖缀合疫苗，其中每一缀合物各包含与载体蛋白质缀合的不同 荚膜多糖，并且其中每一荚膜多糖选自血清群A、C、W-135和Y的荚膜 多糖。
本发明提供了保护易感染脑膜炎奈瑟氏球菌的人或动物的方法，其包 括向人或动物施用免疫有效量的本发明疫苗。
本文引用的所有专利、专利申请以及其它出版物全文并入作为参考。
发明详述
本发明包含具有两种或两种以上不同蛋白质-多糖缀合物的免疫组合 物，其中每一缀合物各包含与载体蛋白质缀合的荚膜多糖。因此，本发明 包括含有两种或两种以上不同衍生荚膜多糖的组合物，其中所述荚膜多糖 与一种或多种载体蛋白质缀合。
可以通过本领域技术人员已知的标准技术制备荚膜多糖。在本发明中 荚膜多糖优选从脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和Y制备。
在优选的实施方案中，分别制备这些脑膜炎球菌血清群缀合物然后配 制成单一剂量形式。例如，从脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和Y 中分别纯化荚膜多糖。
在本发明的优选实施方案中，纯化的多糖在缀合至载体蛋白质前被解 聚并活化。在本发明的优选实施方案中，利用温和氧化条件将来源于脑膜 炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和Y的荚膜多糖部分解聚。
天然的脑膜炎球菌多糖大约500,000-1,500,000道尔顿。本发明针对的 是大小较小的脑膜炎球菌多糖。当纯化天然脑膜炎球菌多糖时，有一定比 例的多糖是较小的。然而，为了获得更好的产量，通常优选将天然脑膜炎 球菌多糖解聚或衍生成优选的大小范围，优选小于100,000道尔顿。在本 发明的一个实施方案中，纯化多糖被解聚成大约5,000至大约75,000道尔 顿的平均多糖大小；优选地为大约7,000至大约50,000道尔顿的平均多糖 大小；更加优选地为大约8,000至大约35,000道尔顿的平均多糖大小；甚 至更加优选地为大约12,000至大约25,000道尔顿的平均多糖大小。在本发 明的一个实施方案中，组合物中平均多糖大小在大约15,000至大约22,000 道尔顿之间。
在多糖解聚或部分解聚后可以接着进行活化步骤。“活化”是指对多糖 进行化学处理以提供能够与载体蛋白质反应的化学基团。优选的活化方法 包括在15-30℃、pH5.0±0.1下于生理盐水中使用已二酸二酰肼处理约2小 时。美国专利号5,965,714描述了一种活化方法。
一旦活化，就可以将荚膜多糖缀合到一种或多种载体蛋白质上。在本 发明优选的实施方案中，每一荚膜多糖分别与单一载体蛋白质种类缀合。 在优选的实施方案中，将来源于脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和 Y的荚膜多糖分别缀合至同一种载体蛋白质上。
载体蛋白质可以包括细菌毒素如白喉毒素，失活的细菌毒素如白喉类 毒素、CRM197、破伤风类毒素、百日咳类毒素、大肠杆菌(E.coli)LT、大 肠杆菌ST以及来源于铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素 A。也可以使用细菌外膜蛋白，例如外膜复合体c(OMPC)、孔蛋白、转铁 蛋白结合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)或肺炎球菌 粘附素蛋白质(PsaA)。其它蛋白质如卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白(KLH)、牛血 清白蛋白(BSA)或结核菌素纯化蛋白衍生物(PPD)也可以作为载体蛋白质使 用。载体蛋白质优选无毒和无反应原性并且可得到足够量和足够纯度的蛋 白质。载体蛋白质应经受得住标准缀合过程。在本发明的优选实施方案中， 从喉棒杆菌(Corynebacteria diphtheriae)培养物纯化并利用甲醛化学脱毒的 白喉毒素被用作载体蛋白质。另外一种可供选择的载体蛋白质是蛋白质D， 它是流感嗜血杆菌(H.influenza)的外膜表面暴露蛋白。
在本发明的一个实施方案中，每一衍生多糖与载体蛋白质的平均比例 为大约1:1至大约1:20(w/w)。在本发明的优选实施方案中，总的衍生多糖 与载体蛋白质的平均比例为大约1:2至大约1:10(w/w)；并且每一衍生多糖 与载体蛋白质的更加优选地平均比例为大约1:2至大约1:6(w/w)。在本发 明的一个更加优选的实施方案中，总的衍生多糖与载体蛋白质的平均比例 为大约1:(4±1)，更加优选地为1:(4±0.5)，甚至更加优选地为1:(4±0.25) (w/w)。
在荚膜多糖与载体蛋白质缀合后，可以利用多种技术对多糖-蛋白质缀 合物进行纯化(就多糖-蛋白质缀合物的量而言为富集)。纯化步骤的一个目 的是从多糖-蛋白质缀合物中去除未结合的多糖。美国专利号6,146,902中 描述了一种涉及在硫酸铵存在下进行超滤的纯化方法。或者，可以通过许 多标准技术从未反应的蛋白质和多糖中将缀合物纯化出来，所述标准技术 尤其包括大小排阻层析、密度梯度离心、疏水相互作用层析或硫酸铵分级 分离等。参见，例如P.W.Anderson等(1986).J.Immunol.137:1181-1186。 还可见H.J.Jennings和C.Lugowski(1981)J.Immunol.127:1011-1018。
在将多糖和载体蛋白质缀合后，可以通过组合多种衍生多糖-蛋白质缀 合物来制备本发明的免疫组合物。本发明的免疫组合物包含与一种或一种 以上的载体蛋白质缀合的两种或两种以上不同的荚膜多糖。本发明的优选 实施方案是二价免疫组合物，其包含与白喉毒素或类毒素缀合的分别来源 于脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A和C的衍生荚膜多糖。更优选地，本发明为 四价免疫组合物，其包含与白喉毒素或类毒素缀合的分别来源于脑膜炎奈 瑟氏球菌血清群A、C、W-135和Y的荚膜多糖。
本发明部分地指向多成分、衍生多糖缀合物的组合物，其中在每一剂 量中每一衍生多糖为大约0.5至大约15μg。因此，组合物可以包含1-60μg 的总的衍生多糖。在优选的实施方案中，组合物中每一衍生多糖的相对含 量大约等同于±50％；更优选±30％；甚至更加优选±20％。
载体蛋白质的制备和用途以及多种可能的缀合方法为本领域技术人员 众所周知。本发明缀合物可以通过这些技术人员利用本发明所教导以及在 普通文献上可轻易得到的信息来制备。也可以从以下美国专利的任意一个 或全部中得到指导，其中这些专利的教导在此全部引用作为参考：美国专 利号4,356,170；4,619,828；5,153,312；5,422,427和5,445,817。
备选地，可以通过共同培养两种或两种以上脑膜炎奈瑟氏球菌血清群 并且共纯化、解聚、活化并缀合多糖，或者通过分别培养纯化脑膜炎奈瑟 氏球菌血清群并且在解聚、活化和缀合多糖的任何步骤之前或之后将两种 或两种以上纯化多糖混合来制备免疫组合物。
可以通过从不同的脑膜炎球菌血清群分别制备多糖-蛋白质缀合物然 后将缀合物混合而制备本发明免疫组合物。本发明免疫组合物可以作为疫 苗使用。本发明疫苗的配制可以利用本领域的已知方法完成。本发明的疫 苗组合物还可以包含一种或一种以上的佐剂。佐剂包括(作为例子但不限于 此)：铝佐剂(例如铝盐诸如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝或其组合)、弗氏佐 剂(完全佐剂或不完全佐剂)、BAY、DC-chol、pcpp、单磷酰脂A、CpG、 QS-21、霍乱毒素和甲酰甲硫氨酰肽。参见例如：Vaccine Design,the Subunit and Adjuvant Approach，1995(M.F.Powell和M.J.Newman编， Plenum出版社，N.Y.)。佐剂优选地为铝佐剂，如氢氧化铝或磷酸铝。
备选的佐剂包括水包油乳剂制剂，例如PCT公开号WO90/14837中所 描述的MF59、SAF(包含10％角鲨烷、0.4％Tween 80、5％pluronic封 闭的多聚体L121和thr-MDP)和RibiTM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem,Hamilton,MT，包含2％角鲨烷、0.2％Tween 80和选自 单磷酸脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸(TDM)和细胞壁骨架(CWS)的一种 或多种细菌细胞壁成分，优选MPL+CWS(DetoxTM))；皂角甙佐剂，例如 可以使用StimulonTM(Cambridge Bioscience,Worcester,Mass.)或者产生 的颗粒如ISCOM(免疫刺激复合物)；细胞因子，例如白细胞介素(如IL-1、 IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(例如γ干扰素)、巨噬 细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)。
在本发明的一个实施方案中，蛋白质-多糖缀合物的平均糖基化比率 (多糖与蛋白质的比率)为大约0.05至大约2；更优选的平均糖基化比率为 大约0.08至大约1.25；甚至更加优选的平均糖基化比率为大约0.1至大约 0.9。在一个优选的实施方案中，蛋白质-多糖缀合物的平均糖基化比率为大 约0.2至大约0.8；更优选的平均比率为大约0.2至大约0.6；并且甚至更加 优选的平均比率为大约0.3至大约0.5。
如下所述，本发明的疫苗和免疫组合物在多种动物模型中引起类似T- 细胞依赖性的免疫反应，而多糖疫苗引起类似非T-细胞依赖性的免疫反 应。因此，本发明组合物对于研究在类似T-细胞依赖性的脑膜炎奈瑟氏球 菌抗原免疫反应中所涉及的生物学途径和过程也是一个有用的研究工具。
施用于人或动物的本发明疫苗的量以及施用方案可以按照药学和兽医 领域一般技术人员众所周知的标准技术确定，并在确定时考虑到诸如所用 具体抗原、佐剂(如果存在)、年龄、性别、体重、物种和特定动物或患者 的状况以及施用路径等因素。在本发明中，为了在抗脑膜炎奈瑟氏球菌的 疫苗接种中提供有效剂量，多糖-蛋白质载体的量可以为每公斤体重大约 0.02μg至大约5μg。在本发明优选的组合物和方法中，剂量为每公斤体重 大约0.1μg至3μg。例如，如果感染后时间不长，由于细菌增殖时间较短， 有效剂量可以需要较少的抗体。同样，有效剂量依赖于诊断时的细菌负载 量。对于治疗使用，可考虑在一段时期内多次注射施用。
本发明的多价缀合物可以以单一剂量或以系列剂量(即进行“一次加 强”或“几次加强”)形式施用。例如，就像目前针对预防儿童疾病的其它疫 苗所推荐的那样，儿童可以在生命早期接受单一剂量，此后在长达10年后 接受加强剂量。
加强剂量可使致敏B细胞产生抗体，即回忆应答。也就是说，多价缀 合物疫苗与得到许可的多糖疫苗相比，可在年幼群体中引起高的初次(即在 疫苗的单次施用后)功能抗体应答，而且还能够引起回忆应答(即在加强施 用后)，这表明由本发明的多价缀合疫苗所引起保护性免疫应答具有长效 性。
本发明组合物包括经管口例如口、鼻、肛、阴道、经口、胃内、粘膜(例 如经舌、肺泡、牙龈、嗅觉或呼吸粘膜)等等施用的液体制剂，诸如混悬液、 糖浆或酏剂；以及经肠胃外、皮下、皮内、肌肉、腹膜内或静脉施用(例如 注射施用)的制剂，诸如无菌混悬剂或乳剂。优选静脉内和肠胃外施用。此 类组合物可以与适当载体、稀释剂或赋形剂诸如无菌水、生理盐水、葡萄 糖等混合。组合物也可以被冻干。根据所期望的施用路径和制剂形式，组 合物可以包含诸如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂、胶凝剂或粘度增强添加剂、 防腐剂、调味剂、着色剂等等辅料。可以在不需要过多实验的前提下参考 标准教科书例如REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCE，第17 版，1985(文中并入作为参考)来制备适宜的制剂。
在本发明的一个实施方案中，优选的施用路径是肌肉或皮下，优选肌 肉施用路径。可以通过注射或备选的递送装置进行施用。
本发明组合物可以以液体制剂的形式方便的提供，所述液体制剂例如 可以被缓冲至选定pH的等渗水溶液、混悬液、乳液或粘性组合物。如果 优选消化道吸收，本发明组合物可以为药丸、片剂、胶囊、膜片等等“固体” 形式，包括缓释或液体填充型“固体”制剂(例如以明胶包裹液体，由此明胶 在胃中溶解用于在消化道中实现递送)。如果希望鼻腔或呼吸道(粘膜)施用， 组合物可以是通过压力喷雾给药器、泵给药器或气雾给药器施用的形式。 气溶胶通常借助碳氢化合物在压力下形成。泵给药器优选按计量的量施用 或者按具有特定微粒大小的剂量施用。
液体制剂通常比凝胶、其它粘性组合物和固体组合物更易制备。另外， 液体组合物多少可以更方便的在动物、儿童(尤其是幼儿)和其它可能在吞 咽药丸、片剂、胶囊等等方面有困难的个体上施用，尤其是通过注射或口 服方式，在多剂量给药情况下液体组合物也更方便。另一方面，可以将粘 性组合物配制成具有适当范围内的粘性以便与粘膜(诸如胃或鼻粘膜的内 衬)接触时间更长。
在本发明的优选实施方案中，疫苗组合物可以配制成无菌液体的、无 致热原的、磷酸盐缓冲的生理盐水，可以有或没有防腐剂。在一个优选的 实施方案中，一次剂量的配方包含大约0.3至大约1.0mg磷酸钠、大约3.5 至大约6.0mg氯化钠以及高达1.5mL的水。在一个优选的实施方案中， 一次剂量的配方包含大约0.6±0.2mg磷酸钠、4.4±0.2mg氯化钠以及高达 大约0.5±0.2mL的水。
明显的，对适当载体和其它添加剂的选择会取决于确切施用途径和特 定剂型的性质，例如液体剂型(例如不管将组合物配制成溶液、混悬液、凝 胶或其它液体形式)或固体剂型(例如不管将组合物配制成药丸、片剂、胶 囊、膜片、缓释型或液体填充型)。
溶液、混悬液和凝胶除含有活性成分之外通常含有大量的水(优选纯化 的水)。也可以存在少量的其它成分，例如pH调节剂(例如诸如氢氧化钠的 碱)、乳化剂或分散剂、缓冲剂、防腐剂、湿润剂、胶凝剂(例如甲基纤维 素)、着色剂和/或调味剂。组合物可以为等渗的，即它可以具有与血液和 泪液相同的渗透压。
所期望的本发明组合物的等渗性可以利用酒石酸钠、丙二醇或其它无 机或有机溶质实现。在一个实施方案中，用磷酸钠或氯化钠或其混合物实 现组合物的优选等渗性。对于包含钠离子的缓冲剂而言，特别优选氯化钠。
组合物的粘度可以使用可药用增稠剂来维持所选定水平。由于甲基纤 维素可以容易地且经济地获得，而且容易操作，所以优选甲基纤维素。其 它适宜的增稠剂包括例如黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆 等等。增稠剂的优选浓度取决于所选试剂。要点是使用可达到所选粘度的 量。粘性组合物通常通过向溶液中添加此类增稠剂制备。
可以采用可药用防腐剂来延长组合物的保存期。苯甲醇是适宜的，但 是还可以使用各种防腐剂包括例如对羟基苯甲酸酯、硫柳汞、氯代丁醇或 苯扎氯铵。防腐剂的适宜浓度为总重量的0.02％-2％，但根据所选试剂可 以明显变化。
本领域技术人员将认识到：所选则的组合物组分必须为与脑膜炎奈瑟 氏球菌多糖-蛋白质载体缀合物不起化学反应的。
本发明将通过参考下列举例说明性但非限制性实施例进一步描述，所 述实施例详细阐明本发明概念的几个优选实施方案。本发明的其它实施例 在不背离本发明精神的前提下对本领域技术人员而言是显而易见的。
以下缩写和商标为：ACIP，免疫接种顾问委员会(Advisory Committee on Immunization Practices)；AE，不良事件；CetavalonTM，十六烷基三甲 基溴化铵，CTAB；CFR，联邦法规；CRF，个案报告表；DTP，白喉-破 伤风-百日咳；ELISA，酶联免疫吸附测定；FDA，美国食品药品管理局； GCP，药品临床试验管理规范；GMC，几何平均浓度；GMT，几何平均 滴度；IgG，免疫球蛋白G；IgG1，免疫球蛋白G亚类1；IgG2，免疫球 蛋白G亚类2；IgM，免疫球蛋白M；ICH，国际协调会议；IND，研究 用新药；IRB，机构审查委员会；MenA/C-Dt，二价(A和C)脑膜炎球菌多 糖-白喉缀合疫苗；MenPS，脑膜炎球菌血清群特异性多糖；mL，毫升； MenomuneTM，许可的脑膜炎球菌A、C、Y和W-135多糖疫苗；OD，光 密度；PBS，磷酸缓冲盐溶液；SAE，严重不良事件；SBA，血清杀菌活 性；SBA-BR，使用幼兔补体进行的血清杀菌力试验；SBA-HC，使用人补 体进行的血清杀菌力试验；SIDS，婴儿猝死综合征；TetraMenD，四价(A、 C、Y和W-135)脑膜炎球菌多糖-白喉缀合疫苗；Td，破伤风和白喉疫苗； UAE，意外不良事件；URI，上呼吸道感染；μg，微克。
实施例
实施例1.脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和Y的纯化荚膜多糖粉 末的制备
粗糊状物的制备
分别将脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和Y的冻存种培养物 融化，并在液体Watson Scherp培养基中恢复，而后接种至含有Mueller Hinton琼脂培养基的Blake瓶中。将Blake瓶在CO2存在条件下于35-37℃ 培养15-19小时。培养后，将生长物从Blake瓶中移出并加至含有Watson Scherp培养基的4L摇瓶中。将摇瓶在水平摇床上于35-37℃培养3-7小时。 将4L瓶中的内容物转移至含有Watson Scherp培养基的发酵容器中。发 酵容器在35-37℃培养7-12小时，其间加入补料和消泡剂并控制溶解氧含 量和pH。培养后，将发酵容器内容物转移至500L大罐中，加入CetavlonTM， 并且混合1小时。将CetavlonTM处理的生长物以每小时约30-70升的流速 以约15,000-17,000×g离心。利用第二次CetavlonTM沉淀将多糖粗品从上清 液中沉淀出来。向上清液中加入CetavlonTM并将材料在室温下混合至少1 小时。将材料于1-5℃贮藏8-12小时。以每分钟300-400ml的流速，约 45,000-50,000×g离心收集沉淀的多糖。将收集的糊状物贮藏于-60℃或更低 温度下直至进一步处理。
纯化多糖粉末的制备
将未活化的糊状物融化并转移至搅拌器中。将糊状物于0.9M氯化钙 中搅拌以得到均一悬浮液。悬浮液于大约10,000×g离心15分钟。将上清 液通过容器中的无绵绒垫得到第一次提取物。向糊状物中加入第二次体积 的0.9M氯化钙，并且搅拌得到均一悬浮液。悬浮液如上所述离心，且将 上清液与来自第一次提取的上清液混合。总共进行4次提取，并将上清液 混合。混合的提取物通过利用10-30kDa MWCO螺旋形超滤装置进行超滤 浓缩。
向浓缩液中加入氯化镁，并用氢氧化钠调节pH值为7.2-7.5。向浓缩 物中加入DNA酶和RNA酶，并于25-28℃混合孵育4小时。加乙醇至浓 度为30-50％。通过10,000×g离心2小时除去沉淀的核酸和蛋白质。回收 上清液并通过加入乙醇至80％且于1-5℃静置过夜使多糖沉淀。虹吸除去 乙醇，并将沉淀的多糖在10,000×g离心5分钟。用乙醇洗涤沉淀的多糖。 用丙酮洗涤多糖，10,000×g离心15-20分钟。将多糖真空干燥。
将初始多糖粉末融入乙酸钠溶液。向其中加入氯化镁，并用氢氧化钠 溶液调节pH值至7.2-7.5。向溶液中加入DNA酶和RNA酶，并于25-28℃ 混合孵育4小时以去除残余的核酸。在与这些酶孵育后，向多糖-酶混合物 中加入等体积的乙酸钠-酚溶液，并置于1-5℃水平摇床中约30分钟。将混 合物于10,000×g离心15-20分钟。将上层水相层回收并保存。向水相层中 加入等体积乙酸钠-酚溶液，并按照上述提取。总共进行4次提取以便从多 糖溶液中去除蛋白质和内毒素。合并的水相提取物用注射用水稀释高达10 倍，并对10倍体积注射用水透析。向透析后的多糖中加入氯化钙。通过加 入乙醇至80％并于1-5℃过夜沉淀多糖。取出乙醇上清液，并通过10,000×g 离心15分钟收集多糖。纯化的多糖用乙醇洗涤两次，并用丙酮洗涤一次。 将洗涤后的粉末在干燥器中进行真空干燥。干粉贮藏于-30℃或更低温度下 直至进行缀合反应。
实施例2.纯化的脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和Y荚膜多糖粉 末的解聚
本制备所用材料包括来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和Y 的纯化的荚膜多糖粉末(按照实施例1制备)、无菌的50mM乙酸钠缓冲液 (pH6.0)、无菌的1N盐酸、无菌的1N氢氧化钠、30％过氧化氢以及无菌 生理盐水(0.85％氯化钠)。
在分别的反应中对每一血清群多糖进行解聚。向一不锈钢罐中装入多 达60克的纯化荚膜多糖粉末。向多糖中加入无菌的50mM乙酸钠缓冲液 (pH6.0)至浓度为每升2.5g多糖。在1-5℃下混合多糖溶液12-24小时以实 现溶解。将反应罐与热交换器相连。再额外加入50mM乙酸钠缓冲液 (pH6.0)以稀释多糖至每升1.25g的反应浓度。将多糖溶液加热至55±0.1℃。 向反应混合物中加入30％过氧化氢至其反应浓度为1％。
通过随反应时间跟踪多糖分子大小的变化来监控反应进程。每隔15-20 分钟，取出一份反应混合物试样并注射至高效凝胶排阻色谱(HPSEC)柱以 测量多糖的分子大小。当多糖的分子大小达到目标分子大小时，关闭加热 器并通过冰水浴循环将多糖溶液迅速冷却至5℃。通过将反应罐连接至装 备有3000MWCO再生纤维素柱的超滤器上，将解聚多糖溶液浓缩至每升 15g。将浓缩后的解聚多糖溶液用10倍体积无菌生理盐水(0.85％氯化钠) 透析。将解聚多糖贮存于1-5℃直至下一步骤。
通过流经商品名为“Ultahydrogel.TM.250”的凝胶过滤层析柱以及利 用多角度激光光散射确定解聚多糖的分子大小，所述凝胶过滤层析柱用葡 聚糖分子标准来校准。对于血清群A，使用Bartlet G.R.J的方法((1959), Journal of Biophygical Chemistry，234，466-468页)通过磷的含量测定多 糖的量，并且对于血清群C、W135和Y，使用Svennerholm L.的方法 ((1955)，Biochimica Biophysica Acta，24，604-611页)通过唾液酸的含量 测定多糖的量。通过Hesterin S.((1949),Journalof Biological Chemistry， 180，249页)的方法测定O-乙酰基含量。通过Park J.T.和Johnson M.J.((1949)，Journal of Biological Chemistry，181，149-151页)的方法测 定还原活性。解聚多糖的结构完整性通过质子1H和13C NMR确定。解聚 多糖的纯度通过测量LAL(内毒素)含量和残余过氧化氢含量来确定。
实施例3.脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和Y解聚多糖的衍生化
本制备所用材料包括过氧化氢解聚的脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、 W135和Y荚膜多糖(按照实施例2制备)、己二酸二酰肼、仅用于血清群A 的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDAC)、氰基硼氢钠、无菌的1N 盐酸、无菌的1N氢氧化钠、无菌的1M氯化钠以及无菌生理盐水(0.85％ 氯化钠)。
在分开的反应中将每一血清群多糖进行衍生反应。向一不锈钢罐中装 入纯化的解聚多糖，并用无菌0.85％生理盐水的稀释至终反应浓度为每升 1g多糖。向该溶液中加入溶于无菌0.85％生理盐水的己二酸二酰肼浓的等 分试样至其反应浓度为每升1g。对于血清群A，将EDAC作为溶于无菌 0.85％生理盐水的浓的等分试样加入，以达到每升1g的反应浓度。调节 pH值至5.0±0.1，并利用无菌的1N盐酸和无菌的1N氢氧化钠在室温下 (15-30℃)维持此pH值达2小时。2小时后，向此反应混合物中加入溶于无 菌0.85％生理盐水的氰基硼氢钠浓的等分试样至每升2g的反应浓度。在 室温下(15-30℃)搅动反应物44±4小时，同时维持pH值5.5±0.5。此反应 期后，将pH值调至6.0±0.1，并且通过将反应罐连接至装备有3000MWCO 再生纤维素柱的超滤器上将衍生的多糖浓缩至每升12g多糖。用30倍体 积的1M氯化钠透析浓缩后衍生多糖，接着用10倍体积的0.15M氯化钠 透析。将反应罐与超滤器分离，并在1-5℃贮藏7天。将反应罐与装备有 3000MWCO再生纤维素柱的超滤器重新连接，并用30倍体积的1M氯 化钠透析，接着用10倍体积的0.15M氯化钠透析。
通过与在解聚多糖中所用的相同方法对衍生多糖的分子大小、多糖的 量以及O-乙酰基含量进行测定。通过Snyder S.L.和Sobocinski P.Z.((1975), Analytical Biochemistry,64，282-288页)的2,4,6-三硝基苯磺酸方法测定酰 肼含量。衍生多糖的结构完整性通过质子1H和13C NMR确定。衍生多糖 的纯度通过测量未结合的酰肼水平、LAL(内毒素)含量和残余氰基硼氢化 物含量来确定。
实施例4.载体蛋白质的制备
粗白喉类毒素蛋白质的制备
将冻干的种子培养物进行重构并培养16-18小时。取一等分试样培养 物转移至含有生长培养基的0.5升摇瓶中，并将培养瓶在旋转摇床上于 34.5-36.5℃培养7-9小时。从培养瓶取一等分试样培养物转移至含有生长 培养基的4升摇瓶中，并将培养瓶在旋转摇床上于34.5-36.5℃培养14-22 小时。将来自4升摇瓶中的培养物接种于含有生长培养基的发酵罐。将发 酵罐在34.5-36.5℃孵育70-144小时。发酵罐内容物通过深层滤器过滤至收 集器中。向收获物中加入37％的甲醛溶液至其浓度为0.2％。将pH调整至 7.4-7.6。将收获物通过0.2微米滤器过滤至无菌的20升的瓶中。将瓶子于 34.5-36.5℃培养7天。向每一20升瓶中加入37％的甲醛溶液至其浓度为 0.4％。调节混合物pH值至7.4-7.6。将瓶在摇床上于34.5-36.5℃培养7天。 向每一20升瓶中加入37％的甲醛溶液至其浓度为0.5％。调节混合物pH 值至7.4-7.6。将瓶于34.5-36.5℃培养8周。对类毒素粗品进行脱毒测试。 在测试期间将瓶贮藏于1-5℃。
粗白喉类毒素蛋白质的纯化
将类毒素粗品升温至室温，并将20升瓶中的内容物合并装入纯化罐。 调节类毒素pH值至7.2-7.4，并向类毒素粗品中加入活性炭并混合2分钟。 将活性炭类毒素混合物静置1小时，然后用深层滤器过滤至第二个纯化罐 中。向滤液中加入固体硫酸铵至70％饱和度。调节pH值至6.8-7.2，并将 溶液静置16小时。过滤收集沉淀的蛋白质，并用70％饱和度硫酸铵溶液 (pH7.0)洗涤。将沉淀溶于无菌蒸馏水，并将蛋白质溶液过滤至不锈钢收集 器中。调节pH值至6.8-7.2，并加入硫酸铵至40％饱和度。调节溶液pH 值至7.0-7.2，并将溶液静置16小时。通过过滤去除并丢弃沉淀。向滤液中 加入硫酸铵至60％饱和度，并调节pH值至7.0-7.2。将混合物静置16小 时，并通过过滤收集沉淀的蛋白质。将沉淀溶于无菌蒸馏水，过滤去除不 溶的蛋白质，并用0.85％生理盐水透析。
纯化白喉类毒素蛋白质的浓缩和无菌过滤
利用10,000MWCO再生纤维素滤柱，将蛋白质溶液浓缩至每升15g 并用10倍体积的0.85％生理盐水透析。浓缩的蛋白质溶液通过0.2微米滤 膜过滤。将蛋白质溶液贮藏于1-5℃贮存直至进行缀合。
蛋白质浓度通过Lowry,O.H.等的方法((1951)，Journal of Biological Chemistry，193，265-275页)测定。蛋白质纯度通过测定无菌度、LAL(内 毒素)含量和残余甲醛含量确定。
实施例5.脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W-135和Y多糖与白喉类毒素 蛋白质的单价缀合物的制备
本制备所用材料包括脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W-135和Y的 己二酸衍生多糖(按照实施例3制备)、无菌白喉类毒素蛋白质(按照实施例 4制备)、EDAC、硫酸铵、无菌的1N盐酸、无菌的1N氢氧化钠以及无 菌生理盐水(0.85％)。
在分别的反应中制备每一血清群多糖缀合物。所有的四种缀合物均通 过下列方法制备。向一不锈钢罐中装入纯化的己二酸衍生多糖(反应浓度为 700-1000μM活性酰肼)以及纯化的白喉类毒素蛋白质(反应浓度为3.8-4.0 g/L蛋白质)。利用0.85％生理盐水稀释这些原料至目标反应浓度并调节pH 值至5.0±0.1。将等分试样的EDAC加入到多糖蛋白质混合物中至2.28-2.4 g/L的浓度。在15-30℃下将反应pH维持在5.0±0.1达2小时。2小时后， 用无菌的1N氢氧化钠调节pH值至7.0±0.1，并将反应物在1-5℃贮藏16-20 小时。
将反应混合物升温至15-30℃，并将反应罐连接至装备有30,000 MWCO再生纤维素柱的超滤器上。加入固体硫酸铵至60％饱和度(对于血 清群A、W-135和Y)和50％饱和度(对于血清群C)。将缀合反应混合物用 20倍体积的60％饱和硫酸铵溶液(对于血清群A、W-135和Y)和50％饱和 硫酸铵溶液(对于血清群C)透析，接着用20倍体积的0.85％生理盐水透析。 透析后的缀合物先通过含有1.2微米和0.45微米滤心的过滤胶囊，然后再 通过含有0.22微米滤心的过滤胶囊。
通过与解聚和衍生多糖中所用相同的方法测定多糖的量和O-乙酰基 含量。蛋白质的量通过Lowry方法确定。缀合物的分子大小通过商品名为 “TSK6000PW”的凝胶过滤层析柱来确定，其使用DNA作为空体积标记物、 使用ATP作为总体积标记物以及使用牛甲状腺球蛋白作为参考标记物。此 外，通过多角度激光光散射确定从TSK6000PW柱上洗脱的缀合物的分子 大小。通过使用双夹心ELISA方法测定与抗多糖血清群特异性抗体的结合 来测定缀合物的抗原特性。缀合物纯度通过测定未结合(未缀合)多糖的量 (通过在疏水相互作用层析柱上洗脱)、未缀合蛋白质的量(利用毛细管电 泳)、无菌度、LAL(内毒素)含量、残余EDAC含量以及残余铵离子含量来 确定。
实施例6.多价脑膜炎球菌A、C、W-135和Y多糖白喉类毒素缀合疫苗的 配制
本制备所用材料包括按照实施例5制备的血清群A、C、W-135和Y 多糖-白喉类毒素缀合物、无菌的100mM磷酸钠缓冲的生理盐水(0.85％氯 化钠)。
向不锈钢积聚罐内的生理盐水(0.85％)中加入等分试样的无菌的 100-500mM磷酸钠缓冲生理盐水使得到的最终疫苗浓度为10mM磷酸 钠。向含有10mM无菌磷酸钠生理盐水的积聚罐中加入2-4种无菌单价 脑膜炎球菌多糖-白喉类毒素缀合物中的每一种，达到每毫升缓冲液中每一 血清群多糖各8μg的终浓度。将配制的四价缀合物混合并通过0.2μm滤 器过滤至第二个积聚罐中。
多价疫苗制剂中每一种血清群多糖的量可以通过糖成分分析测定，其 中糖成分分析可以使用具有脉冲安培检测的高pH阴离子交换层析来测定。 蛋白质的量通过Lowry方法测定。使用与pH计连接的复合电极测定疫苗 的pH值。通过使用双夹心ELISA方法测定与抗多糖血清群特异性抗体的 结合来测定多价缀合物的抗原特性。通过疫苗中每一缀合物在动物模型中 引起初次和加强抗多糖IgG免疫应答的能力来确定多价缀合疫苗的免疫原 性。多价缀合疫苗的纯度通过测定未结合(未缀合)多糖的量(使用具有脉冲 安培检测的高pH阴离子交换层析)，无菌度、LAL(内毒素)含量、致热原 含量和一般安全性来测定。
实施例7.氢氧化铝佐剂辅助的多价脑膜炎球菌多糖白喉类毒素蛋白质缀 合物的制备
制备吸附至氢氧化铝的缀合物。本制备所用材料包括按照实施例5制 备的血清群A、C、W-135和Y多糖白喉类毒素缀合物、无菌生理盐水(0.85 ％氯化钠)以及溶于生理盐水(0.85％氯化钠)的无菌氢氧化铝。
向含有生理盐水的积聚罐中加入每一种的无菌单价脑膜炎球菌多糖白 喉类毒素缀合物的等分试样，达到每毫升缓冲液中每一血清群多糖为8μg 的终浓度。向多价缀合疫苗中加入溶于生理盐水(0.85％氯化钠)的无菌氢氧 化铝，以达到终浓度为每毫升疫苗0.44mg铝离子。
实施例8.磷酸铝佐剂辅助的缀合物的制备
本制备所用材料包括按照实施例5制备的血清群A、C、W-135和Y 多糖白喉类毒素缀合物、无菌生理盐水(0.85％氯化钠)以及溶于生理盐水 (0.85％氯化钠)的无菌磷酸铝。
向含有生理盐水的积聚罐中加入每一种的无菌单价脑膜炎球菌多糖- 白喉类毒素缀合物的等分试样，达到每毫升缓冲液中每一血清群多糖为8 μg的终浓度。向多价缀合物疫苗中加入溶于生理盐水(0.85％氯化钠)的无 菌磷酸铝，以达到终浓度为每毫升疫苗0.44mg铝离子。
实施例9.在人类临床研究中使用的材料和方法的一般描述
四价衍生缀合疫苗的免疫原性
在多种不同的临床方案下研究了缀合疫苗诱发人类免疫应答的能力。 以下研究总结了这些结果。除非另外指出，以下每种研究中所使用的材料 和方法如下：
TetraMenD
TetraMenD疫苗包含四种血清群脑膜炎球菌荚膜多糖：A、C、Y和 W-135，每种多糖4μg，共价缀合于总量为48μg的白喉类毒素蛋白质上。 疫苗用无菌的、无热原的磷酸盐缓冲生理盐水配制，但不含防腐剂。配方 包含0.6mg磷酸钠、4.4mg氯化钠以及高达0.5mL的水。
在美国和其它国家被许可用于2岁及2岁以上的人群。 Menomune为冻干制剂，疫苗的一次剂量包含作为抗原的A、C、Y和W-135 多糖各50μg，用硫柳汞保存的等渗氯化钠溶液的稀释液重新溶解，每次皮 下给药剂量为0.5mL。每0.5mL剂量的疫苗包括2.5-5mg作为稳定剂的 乳糖。对于皮下施用，作为血清群A、C、Y和W-135组合的 -A/C/Y/W-135脑膜炎球菌多糖疫苗是一种血清群特异多糖抗 原的冻干制剂，这些抗原分别来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、Y和 W-135。稀释剂是无菌的、无热原的蒸馏水。按照标记的指示用稀释剂重 新溶解冻干制剂，每0.5mL剂量的配方包含溶于等渗氯化钠溶液中的血清 群A、C、Y和W-135的“分离产品”各50μg。
成人用吸著破伤风白喉混合类毒素(Tetanus and Diphtheria Toxoids Adsorbed for Adult)(以下称作Td)是一种溶于等渗氯化钠溶液中的 明矾沉淀类毒素的无菌混悬剂，其中含有磷酸钠缓冲液以控制pH值。此 疫苗用于肌肉注射。通过分析，每一0.5mL的剂量配制成包含5Lf的破伤 风类毒素、2Lf的白喉类毒素和不超过0.28mg的铝。在豚鼠效价测试中， 破伤风和白喉类毒素可以分别诱导产生至少2和0.5单位/毫升的抗毒素。 在第一次随访时，所有受试者均接受0.5mL Td的单一剂量，施用时使用 25英寸的计量注射针在左臂三角肌注射。每0.5mL剂量包含5Lf的破伤 风类毒素和2Lf的白喉类毒素。
血清样品
于基线期之后指定的天数抽取血液样品。例如，如果方案指定3个时 间点(0天、28天和6个月)，那么应该在疫苗接种之前的0天(基线期)、 疫苗接种后28天(为了评价初次免疫应答)和疫苗接种后6个月(为了评价免 疫应答的延续时间)抽取血液样品。在每个时间点从每位受试者收集大约5 mL全血。在采集后4小时之内离心全血。吸出血清并贮存于-20℃。“28 天”血液样品取自0天注射后至少28天但尚未到57天时。“6个月”血液样 品取自0天注射后6个月加或减28天时。所以，28天血清代表取自0天 后28-56天的血清，6个月血清代表取自0天后149-217天的血清。
测定技术
本研究使用了多种标准化免疫学测定法。以下描述总结了文中所用的 方法。但是，其它相似的测定法(包括文中提到的测定法的修改方法)是 本领域技术人员众所周知的且可以被使用。
通过使用幼兔补体的杀菌力试验方法(SBA-BR)检测抗脑膜炎球菌抗体
使用血清杀菌力试验方法测定抗血清群A、C、Y和W-135脑膜炎球 菌抗体的功能性抗体活性。在无菌96孔微量滴定板中准备测试血清的倍比 稀释液。将血清群特异性脑膜炎球菌和幼兔补体加入到血清稀释液中并孵 育。在该孵育阶段之后，向血清/补体/细菌混合物中加入琼脂覆层培养基， 使之凝固，然后在37℃、5％CO2环境中孵育过夜。计数孔中存在的细菌 菌落。通过与补体对照孔的平均值相比达到>50％杀死的倒数型血清稀释度 确定终点滴度。对于使用兔补体的该测定法，检出限为滴度8。
IgG抗脑膜炎球菌抗体的测定
使用间接ELISA测定抗血清群A、C、Y和W-135脑膜炎球菌抗体的 IgG抗体活性。操作方法中涉及到与通过甲基化人血清白蛋白吸附到塑料 微量滴定孔中的过量脑膜炎球菌血清群特异多糖(MenPs)抗原发生反应的 血清抗体。通过与过氧化物酶标记的小鼠抗人IgG特异单克隆抗体的反应 来测定所结合抗体的量。然后使用过氧化物酶底物产生显色产物，并用分 光光度计法测定该产物。所得到的光密度(OD)与结合到微量滴定板中脑膜 炎球菌多糖的血清中IgG抗体的量相关联。然后通过使用4参数逻辑曲线 法与指定值的参考标准品(Lot CDC 1992或等效物)相比较来计算IgG抗体 的量。
IgM抗脑膜炎球菌抗体的测定
使用间接ELISA测定抗血清群A、C、Y和W-135脑膜炎球菌抗体的 IgM抗体活性。操作方法中涉及到与通过甲基化人血清白蛋白吸附到塑料 微量滴定孔中的过量MenPs抗原发生反应的血清抗体。通过与过氧化物酶 标记的小鼠抗人IgM特异单克隆抗体的反应来测定所结合抗体的量。然后 使用过氧化物酶底物产生显色产物，并用分光光度计法测定该产物。所得 到的光密度(OD)与结合到微量滴定板中脑膜炎球菌多糖的血清中IgM抗 体的量相关联。然后通过使用4参数逻辑曲线法与指定值的参考标准品(Lot CDC 1992或等效物)相比较来计算IgM抗体的量。
高亲和力抗脑膜炎球菌IgG抗体的测定
在Aventis Pasteur Inc.公司使用改良的ELISA法测定抗血清群A、C、 Y和W-135脑膜炎球菌抗体的高亲和力IgG抗体活性。目前，该测定法处 于Aventis Pasteur Inc.公司的研发中，并且将在临床样品测试之前取得资 格。简言之，就是用MenPs抗原包被96孔微量滴定板。吸出并洗涤所包 被的微量滴定板后，在板中直接制备临床血清的系列稀释液并孵育过夜， 稀释时使用包含75mM硫氰酸铵的磷酸缓冲盐(PBS)血清稀释缓冲液。通 过与过氧化物酶标记的小鼠抗人IgG特异单克隆抗体的反应来测定结合抗 体的量。然后使用过氧化物酶底物产生显色产物，并用分光光度计法测定 该产物。所得到的光密度(OD)与结合到微量滴定板内脑膜炎球菌多糖的血 清中高亲和力IgG抗体的量相关联。然后通过使用4参数逻辑曲线与参考 标准品(Lot CDC 1992或等效物)相比较来计算高亲和力IgG抗体的量。
脑膜炎球菌抗体IgG1和IgG2亚类的测定
使用ELISA测定抗血清群A、C、Y和W-135脑膜炎球菌抗体的IgG1 和IgG2亚类的抗体分布。血清系列稀释液中的抗体与吸附在微量滴定板 孔中的MenPs抗原反应。使用抗人IgG1Fc特异或IgG2Fc特异的试剂测 定所结合抗体的量。然后使用过氧化物酶底物产生显色产物，并用分光光 度计法测定该产物。所得到的光密度(OD)与结合到微量滴定板内脑膜炎球 菌多糖的血清中IgG1和IgG2抗体的量相关联。抗体的量表示为血清样品 中IgG1:IgG2的比率，如果可以得到适宜的参考标准品则也可以表示为 IgG1或IgG2的浓度。
通过对VERO细胞代谢的抑制测定抗白喉抗体
通过测试血清保护VERO细胞免受白喉毒素攻击的能力，检测抗白喉 抗体的反应。使用无菌的96孔微量滴定板，将测试血清的倍比稀释液(以 1:4稀释度开始)用白喉毒素激发并孵育。然后加入VERO细胞，用无菌 的矿物油将微量滴定板孔封口并孵育6-8天。然后通过观察培养基中pH 指示剂的颜色改变来确定抗体水平，这种颜色的变化源自细胞代谢的副产 物。通过与校准的WHO参考血清对比，将结果表示为国际单位/毫升，并 且通过在白喉毒素激发剂量(challenge dose)存在下允许细胞代谢的最高血 清稀释度来确定。检测低限可以通过参考血清的最低的可检测抗毒素水平 以及测试血清的起始稀释度来确定，一般为0.005IU/mL。
通过ELISA法测定抗破伤风抗体
使用间接酶联免疫吸附测定(ELISA)测定抗破伤风抗体水平。操作方 法中涉及到与吸附到塑料微量滴定孔中破伤风类毒素发生反应的测试血清 抗体。通过与碱性磷酸酶偶联的山羊抗人IgG特异抗体的反应来测定所结 合抗体的量。然后使用碱性磷酸酶底物产生显色产物，并用分光光度计法 测定该产物。所得到的OD值(光密度)与结合到微量滴定板内所包被抗原 的血清稀释液中的抗体的量相关联。然后通过使用平行线分析法与指定单 位量的国际参考品(WHO Lot TE-3)相比较，计算出抗体浓度。结果表示为 国际单位/毫升(IU/mL)。ELISA法检测抗破伤风IgG的最低水平为0.01 IU/mL，将低于此水平的样品的值表示为<0.01IU/mL。
如文中所使用，“不良事件”、“严重不良事件”和“意外不良事件”均为 疫苗行业所熟知的术语。依据标准的临床实践总结并分析了安全性资料， 包括评价接种疫苗的所有受试者的临床研究持续时间。一般来说，每个术 语均理解为具有以下含义。
不良事件(AE)定义为：“在施用药物的病人或临床研究受试者中出现的 任何不幸医疗事件，并且其不一定与此处理存在因果关系。因此，不良事 件可以是与医药(研究)产品的使用暂时相关的任何不利的和非故意的病 征(包括异常实验室发现)、症状或疾病，而不管其是否与医药(研究)产品相 关。”(ICH指导，GCP(E6)§1.2)。
严重不良事件(SAE)是：“在任何剂量出现的导致任何下列后果的任何 不良药物事件：死亡、威胁生命的不良药物事件、病人住院或住院期延长、 持久或明显残疾/无自理能力或先天性异常/出生缺陷。当根据适当医疗鉴 定，即它们危害到病人或受试者并且需要通过药物或外科介入避免发生本 定义所列后果之一，则那些没有导致死亡、威胁生命或需要住院的重大医 疗事故可以考虑为严重不良药物事件。此医疗事件的实例包括需要在急诊 室或家中进行精心治疗的过敏性支气管痉挛、未导致病人住院的血液病或 惊厥或者药物依赖或药物滥用的发展。”(21CFR第I章,§312.32(a))。
意外不良事件(UAE)是：“任何不良的药物事件，其特异性或严重性与 目前研究者指南中的不一致；或者如所修正，如果不需要或者得不到研究 者指南，则其特异性或严重性与总体研究计划中或当前应用的其它地方描 述的危险性资料不一致。”(21CFR第I章,§312.32(a))。
本研究依据标准临床实践开展，并且研究中病人入选或排除的标准如 下：
病人的入选标准：
1.如通过既往医疗史和体格检查所确定，受试者为健康的。
2.在接种疫苗时受试者至少11岁而未到19岁。
3.受试者的父母/监护人或受试者已经签署了机构审查委员会(IRB) 认可的适用于本试验的知情同意书。
4.受试者已经签署了机构审查委员会(IRB)认可的适用于本试验的 同意书。
病人的排除标准：
1.患有严重慢性病(如心脏病、肾病、神经病、代谢疾病、风湿病等)。
2.已知或怀疑免疫功能损伤。
3.在检查之前的72小时内患有伴随或不伴随发热的急性内科疾病或 者在检查时口腔温度≥38℃(100.4°F)。
4.具有确实的侵入性脑膜炎球菌疾病史或先前进行脑膜炎球菌疫苗 接种。
5.在近3个月内施用过免疫球蛋白和其它血液制品，或者在疫苗研究 的6周内口服或注射过皮质类固醇或进行过其它免疫调节治疗。按 照口服类固醇持续时间<7天的递减剂量方案进行的个体可以登记 参加试验，只要他们在登记前2周内没有接受1个疗程以上的治疗 即可。
6.在疫苗接种前72小时内接受过抗生素治疗。
7.在登记前28天内接种过任何疫苗，或者在登记后28天内计划接种 除本研究指出的附加疫苗之外的任何疫苗。
8.怀疑或已知对任何疫苗成分过敏。
9.无法参与整个研究阶段或者不能参加预定随访或不遵守研究规程。
10.登记参加另一个临床试验。
11.在研究者看来，对受试者具有健康危险或者干扰疫苗评价的任何 情况。
12.在接种疫苗时尿妊娠试验阳性或可疑阳性的女性。
实施例10.研究A-剂量研究
研究A是向3个年龄组的受试者施用三个剂量水平TetraMenD疫苗 的非盲、开放标记、剂量递增试验。90个健康成人(18-55岁)参加I期试验， 并接受TetraMenD疫苗单次注射。30个健康儿童(12-22个月)参加II期试 验并接受TetraMenD疫苗的单一剂量水平注射两次。90个健康婴儿(6-12 周)参加III期试验并接受TetraMenD疫苗的单一剂量水平注射三次。
I期 在18-55岁成人中的剂量研究
此临床试验是向3个年龄组的受试者施用三个剂量水平TetraMenD疫 苗的非盲、开放标记、剂量递增试验。在I期中，90个健康成人(18-55岁) 接受了TetraMenD疫苗的单次注射。
对于成人受试者，在TetraMenD施用前的基线期(0天)和TetraMenD 施用后的28天抽取血清样品用于血清学分析。分析所有可得到样品的抗脑 膜炎球菌血清群A、C、Y和W-135荚膜多糖的SBA，并且通过ELISA 法分析抗这些相同血清群的IgG抗体。对于所有血清群的SBA和IgG ELISA结果总结如下。
一个关键的免疫原性判定终点是比基线值升高≥4倍的受试者的比 例。为了确定基线值SBA滴度对SBA升高≥4的比例产生什么影响，在 成人中开展了亚组分析，其中将成人分成受试者基线值滴度小于1:64的组 和受试者基线值滴度至少1:64的组。
TetraMenD的安全性与是可比的，研究结果总结于下表。 表A-1：I期(成人)-按照TetraMenD剂量水平的基线期(0天)SBA滴度分布
(续表A-1)
表A-2：I期(成人)-按照TetraMenD剂量水平的注射后28天 的SBA滴度分布(符合方案数据分析)
(续表A-2)
表A-3：I期(成人)-按照TetraMenD剂量水平的基线期和注射后 28天达到SBA阈值的比例(符合方案数据分析)
N：在每一时间点(0天；28天)可评价受试者的数量
表A-4：I期(成人)-按照TetraMenD剂量水平的基线期和注射后 28天的SBA和IgG ELISA结果(符合方案数据分析)
(续表A-4)
0天：在接种疫苗前抽取的基线期血液样品。
28天：在接种疫苗后28天抽取的血液样品。
上升≥4倍的％：与0天相比接种疫苗后28天GMT值上升≥4倍的成人的百分比。
N：可评价受试者的数量。
*对于SBA数据计算GMT；对于IgG ELISA数据计算GMC。
表A-5显示了按照剂量、病人年龄和血清群的GMT值。
表A-5：按照剂量、病人年龄和血清群的GMT
(续表A-5)
(续表A-5)
II期 在12个月至22个月的幼儿中的剂量研究
此临床试验是向3个年龄组的受试者施用三个剂量水平TetraMenD疫 苗的非盲、开放标记、剂量递增试验。在II期中，30个健康儿童(12-22个 月)接受了两次TetraMenD疫苗的单一剂量。
对于幼儿受试者，在三个时间点抽取血清样品用于血清学分析：第一 次注射TetraMenD疫苗之前的基线期(0天)、登记后60天(第一次注射之 后的60天并且在马上进行第二次注射TetraMenD疫苗的之前)和登记后 90天(第二次注射之后30天)。分析所有可得样品的抗脑膜炎球菌血清群A、 C、Y和W-135荚膜多糖的SBA，并且通过ELISA法分析抗这些相同血 清群的IgG抗体。对于所有血清群的SBA和IgG ELISA结果总结如下。 结果总结于下表。
表A-6：II期(幼儿)-按照TetraMenD剂量水平的基线期(0天) SBA滴度分布(符合方案数据分析)
(续表A-6)
表A-7：II期(幼儿)-按照TetraMenD剂量水平的第一次注射后60天 (60天)的SBA滴度分布(符合方案数据分析)
(续表A-7)
表A-8：II期(幼儿)-按照TetraMenD剂量水平的第二次注射后30天 (90天)SBA滴度分布(符合方案数据分析)
(续表A-8)
表A-9：II期(幼儿)-按照TetraMenD剂量水平的基线期、第一次注射后 60天和第二次注射后30天达到SBA阈值的比例(符合方案数据分析)
(续表A-9)
表A-10：II期(幼儿)-按照TetraMenD剂量水平的幼儿的基线期、第一次注射后 60天和第二次注射后30天的SBA和IgG ELISA结果(符合方案数据分析)
(续表A-10)
(续表A-10)
0天：在第1次注射前抽取的基线期血液样品。
60天：在第1次注射后60天和第2次注射前抽取的血液样品。
90天：在第2次注射后30天抽取的血液样品。
上升≥4倍的％：第1次注射后：与0天相比在60天GMT值上升≥4倍的幼儿的百分 比；第2次注射后：与0天相比在90天GMT值上升≥4倍的幼儿的百分比。
N：可评价受试者的数量。
*对于SBA数据计算GMT；对于IgG ELISA数据计算GMC。
表A-11总结了按照剂量、病人年龄和血清群的GMT。
表A-11：按照剂量、病人年龄和血清群的GMT的总结
III期 在婴儿中的剂量研究
此临床试验是向3个年龄组的受试者施用三个剂量水平TetraMenD疫 苗的非盲、开放标记、剂量递增试验。在III期中，90个健康婴儿(6-12周) 接受了三次TetraMenD疫苗的单剂量。
婴儿受试者分别在2个月(第1次注射)、4个月(第2次注射)和6个月 大(第3次注射)时接种TetraMenD疫苗。在两个时间点抽取血清样品用于 血清学分析：6个月(第2次注射TetraMenD疫苗后2个月)和7个月(第3 次注射后1个月)。分析所有可得样品的抗脑膜炎球菌血清群A、C、Y和 W-135荚膜多糖的SBA，并且通过ELISA法分析抗这些相同血清群的IgG 抗体。对于所有血清群的SBA和IgG ELISA结果总结如下。结果总结于 下表。
表A-13：III期(婴儿)-按照TetraMenD剂量水平的7个月(第3次注射 后1个月)时SBA滴度分布(符合方案数据分析)
(续表A-13)
表A-14：III期(婴儿)-按照TetraMenD剂量水平的6个月(第3次注射前) 和7个月(第3次注射后)时达到SBA阈值的比例(符合方案数据分析)
N：在每一时间点(6个月；7个月)可评价受试者的数量。
表A-15：III期(婴儿)-按照TetraMenD剂量水平的6个月 (第3次注射前)和7个月(第3次注射后)的婴儿的SBA 和IgG ELISA结果(符合方案数据分析)
(续表A-15)
N：可评价受试者的数量。
*对于SBA数据计算GMT；对于IgG ELISA数据计算GMC。
表A-16显示了按照病人年龄和血清群的GMT总结。
表A-16：按照病人年龄和血清群的GMT总结
在婴儿内接种TetraMenD的同时施用儿科疫苗
目前，按照当前ACIP建议和当地实践对婴儿接种常规儿科疫苗。在 本研究中，婴儿同时接种TetraMenD和儿科疫苗。在婴儿2、4和6个月 时施用DTacP()和Hib（)。可以接种脊髓灰质炎病毒灭 活疫苗(IPV)或口服脊髓灰质炎病毒活疫苗(OPV)；在第一次和第二次注射 TetraMenD时(在2个月和4个月时)施用IPV。按照当地实践接种乙型肝 炎疫苗；乙型肝炎疫苗的施用在一些2个月的受试者中进行，但在4个月 或6个月的受试者中不施用。在开展婴儿阶段的该试验过程中，得到许可并且收到了常规使用的ACIP建议。在本试验中唯一一个受试者 在4个月和6个月时接种了
在6个月和7个月时评价了对常规施用的婴儿疫苗抗原的抗体反应。 结果总结于各表中。
试验中的婴儿受试者在2、4和6个月时接种DTacP和PRP疫苗；在 第3次注射这些疫苗后一个月抽取7-月血液。对于这些疫苗抗原(白喉、破 伤风、百日咳FHA、百日咳PT和PRP)的每一种，所观察到的抗体水平 表明在接种TetraMenD的3个剂量组中没有统计学显著差异(所有的P值> 0.05)。(见表A-17)
在本试验中，在婴儿2个月和4个月时接种IPV。在第2次注射IPV 后3个月抽取7-月血液。对于1型和2型脊髓灰质炎，所观察到的GMT、 NA≥1:4的比例和NA≥1:8的比例表明在接种TetraMenD的3个剂量组 中没有统计学显著差异(所有的P值>0.05)。根据NA≥1:8的比例可见， 在所有接种TetraMenD的3个剂量组中至少95.0％以上表现为抗1型和2 型脊髓灰质炎的保护作用。对于3型脊髓灰质炎，1μg、4μg和10μg组 的GMT分别为562.7、164.0和113.3。3型脊髓灰质炎各组间的GMT值 存在明显的统计学差异(P＝0.001，ANOVA)。但是，通过NA≥1:8的比例(分 别为100.0％[22/22]、100.0％[21/21]和94.1％[16/17])可见所有接种 TetraMenD的3个剂量组中全部表现为抗3型脊髓灰质炎的保护作用。这 些比例没有统计学差异(p＝0.283，Fisher精确性检验)。而且，这三种血清 型脊髓灰质炎的GMT值均正好位于所公布的在2个月和4个月时两次接 种IPV之后的GMT值范围之内，并且本试验也采用了该IPV疫苗接种方 案。
在最近一次接种乙型肝炎疫苗后的最少5个月时抽取7-月血液。通过 GMT和≥10mIU/mL的比例所观察到的乙型肝炎病毒表面抗体水平在接 种TetraMenD的3个剂量组中不存在统计学显著差异(两个p值均≥ 0.649)。值得注意的是，本试验中没有婴儿在6个月随访时接种乙型肝炎疫 苗，此时是第3次接种本疫苗的最早推荐时期。这可以解释为什么在7个 月婴儿中乙型肝炎表面抗体滴度≥10mIU/mL的比例与所公布的疫苗初始 剂量之后产生可检测抗体的婴儿比例范围一致，而低于所预计的在全部三 次接种后产生保护性抗体水平的婴儿比例。本研究结果总结于下表。
表A-17：III期(婴儿)-按照TetraMenD剂量水平的7个月的婴儿中 伴随疫苗的免疫原性(符合方案数据分析)
(续表A-17)
*GMT的比较使用F-检验。百分比的比较使用Fisher精确性检验。
p值<0.05
实施例11.研究B-在2-10岁的儿童中的1个月和6个月研究
本研究是对2-10岁的健康儿童进行的随机、阳性对照(active-control) 的研究，其中比较了单一剂量的TetraMenD和单一剂量的Menomune。 分别在接种前的0天、接种后28天和6个月抽取血液样品。TetraMenD 的总体安全性与Menomune是可比的。本研究结果总结于下表。
SBA-BR抗体滴度分布
表B-1显示了对于每一血清群的基线期、28天和6个月时SBA-BR抗 体滴度分布的频率。
表B-1:疫苗接种后0天、28天和6个月时SBA-BR 抗体滴度的分布(符合方案数据分析)
(续表B-1)
(续表B-1)
(续表B-1)
(续表B-1)
表B-2总结了按照受试者年龄和TetraMenD血清群的滴度几何均数 GMT)。
表B-2：按照受试者年龄和TetraMenD血清群的GMT总结
表B-3显示了对于血清群A、C、Y和W-135从基线期到28天SBA-BR 滴度升高≥4倍的受试者数量和比例。对于每一血清群，TetraMenD组中 的百分比高于组中的百分比。对于血清群A、C、Y和W-135， 比例的差异分别为：-0.0397、-0.0452、-0.1092和-0.0562。
表B-3:符合方案数据分析的初步假设(Primary Hypothesis)检测总结
n：从基线期滴度升高≥4倍的受试者数量。
N：所使用群体中受试者总数。
Pt和Pm：分别为TetraMenD组和组中接种疫苗后SBA升高≥4倍的受试者比 例。
表B-3总结了接种后28天SBA抗体滴度≥32的受试者的比例。
表B-3：接种后28天SBA-BR抗体滴度≥32的受试者 的百分比和数量(符合方案数据分析)
*％：n/N。
n：接种后28天滴度≥32的受试者数量。
N：本组中具有有效的28天血液样品的受试者总数。
表B-4总结了接种后28天SBA-BR抗体滴度≥128的受试者比例。
表B-4：接种后28天SBA-BR抗体滴度≥128的受试者 的百分比和数量(符合方案数据分析)
*％：n/N。
n：接种后28天滴度≥128的受试者数量。
N：本组中具有有效的28天血液样品的受试者总数。
SBA-BR抗体滴度至少升高4倍的受试者比例
表B-5显示了接种后28天和6个月时SBA抗体滴度较基线期升高≥4 倍的受试者比例。在接种TetraMenD 28-56天内，大多数受试者经历了针 对疫苗所含的每一血清群的SBA-BR抗体滴度升高≥4倍。
表B-5：接种后28天和6个月时SBA-BR抗体滴度较基线期 升高≥4倍的受试者的百分比和数量(符合方案数据分析)
*％：n/N。
n：较基线期升高≥4倍的受试者数量。
N：所使用群体中受试者总数。
在0天检测不到滴度(<8)而在接种后28天SBA-BR抗体滴度升高≥4倍的受试者的比例
在两个处理组中并且对于所有疫苗血清群，在基线期检测不到 SBA-BR滴度(<8)的受试者中的大部分在28天时SBA滴度升高≥4倍(表 B-6)。在TetraMenD组中，在0天检测不到滴度(<8)而在28天时SBA-BR 抗体滴度升高≥4倍的受试者比例为86.21％-98.57％；在组， 比例为75.00-94.64％。
表B-6：在0天检测不到滴度(<8)而在接种后28天SBA-BR 抗体滴度升高≥4倍的受试者的数量和比例
*n：每一血清群中在0天时滴度<8而在28天时滴度≥32的受试者数量。
N：每一血清群中在0天时滴度<8的受试者数量。
百分比的精确95％置信区间。
SBA-BR抗体的GMT和升高的平均倍数
表B-7显示了基线期、接种后28天和6个月时SBA GMT以及SBA GMT升高的倍数。
表B-7：基线期、接种后28天和6个月时SBA-BR 血清学结果(符合方案数据分析)
(续表B-7)
*滴度或升高倍数，其中升高倍数＝28天时的滴度/0天时的滴度。
N：计算所用的受试者总数。
血清群A、C、W-135和Y的IgG的ELISA结果
表B-8显示了基线期、接种后28天和6个月时IgG GMC值以及IgG GMC的升高倍数。
表B-8：基线期、接种后28天和6个月的 IgG血清学结果(符合方案数据分析)
(续表B-8)
*滴度或升高倍数，其中升高倍数＝28天时的滴度/0天时的滴度
N：计算所用的受试者总数。
接种本研究疫苗TetraMenD后28-56天，大多数受试者对于疫苗所包 含的每一血清群的SBA-BR抗体滴度均升高≥4倍。总体来说，有77％的 TetraMenD接种者表现为抗所有血清群抗体滴度均升高4倍。血清群Y的 接种前抗体水平高于血清群C或W-135。这可能与这样一种事实相关，即 受试者在此阶段天然暴露于血清群Y比先前预想的更普遍。较高的循环抗 体水平反映了近期天然暴露的情况，并可能降低了呈现为抗体反应升高4 倍或更高的疫苗接种者的比例。与其它血清群相比，这种现象明显出现于 血清群Y反应中。血清群Y受试者抗体滴度呈现4倍升高的比例是56.6％， 而血清群C是73.4％，血清群A是87.7％，血清群W-135是91.0％。高 接种前抗体水平的现象也可以见于血清群A。这可能是受试者长时间间断 性暴露于各种天然存在的交叉反应抗原的结果。
为了进一步评价预先存在的抗体滴度的影响并研究血清阳转率(定义 为：对于任何血清群接种前抗体滴度<1:8，而接种后抗体呈现4倍升高的 受试者比例)，对接种疫苗所包含的4种血清群中任何一种血清群的接种前 抗体滴度<1:8的受试者进行单独分析。在以幼兔作为补体来源的SBA测定 法中<1:8的抗体滴度被认为是循环抗体为不可检测水平。当用这种标准来 评价受试者时，可见接种TetraMenD后，对于血清群A血清阳转率为 98.6％，对于血清群C为87.9％，对于血清群W-135为96.0％，并且对于 血清群Y为86.2％。
根据对军队新兵的检查结果，Goldschneider提出，使用人补体来源的 SBA测定法中≥1:4的最小抗体滴度与抗血清群C侵袭性疾病的保护作用 相关联。但是，由于测定标准化的需要以及缺乏可靠的人补体来源，所以 建议将幼兔补体作为备选来源。看起来脑膜炎球菌对幼兔补体比对人补体 更敏感，这导致检测出更高的抗体滴度。一些作者建议，在使用幼兔补体 的SBA测定中，≥1:128的滴度预示着具有保护作用，而<1:8的滴度预示 着至少对血清群C易感。尽管这种水平对于评价多糖疫苗是合适的，但是 可能并不适用于缀合疫苗。Borrow建议，在接种单价C缀合疫苗并且接 种后SBA滴度在8-64之间的受试者中，如果用降低剂量(10μg)的脑膜炎球 菌多糖疫苗接种几个月后证实产生了记忆应答，则表明这些个体同样也受 到了保护，抗体水平达到≥1:128。对于接种TetraMenD疫苗并且针对每 一血清群的SBA-BR滴度≥1:128的受试者的结果列于表中。当对疫苗所 包含每一血清群使用这些标准时，总体来说，接种TetraMenD且接种后 SBA-BR滴度≥1:32的受试者占96.2％，滴度≥1:128的占90.5％。此临床 研究中的一部分血清也用于评价使用幼兔补体和人补体的SBA测定法间 的关联，并且结果在随后的研究中提供。
在组中抗血清群C、Y和W-135的总的IgG反应明显高 于接种TetraMenD组。但是，在TetraMenD组中抗血清群A、C、Y和 W-135的接种后SBA GMT水平明显较高。
表B-9提供了各血清群的GMC和GMT滴度的比较。
表B-9各血清群IgG GMC和SBA GMT滴度的对比
缀合疫苗诱导的较低水平的IgG产生了比多糖疫苗更高的杀菌活性， 此现象强有力地表明缀合疫苗抗体反应的质量和亲和性优于非缀合多糖疫 苗产生的抗体。高亲和性抗体与功能活性和记忆应答相关。这种效应在一 些已公开的研究中也可以见到。这些资料证实TetraMenD在2-10岁的儿 童中具有高度的免疫原性，对于四个血清群中的每一个，在TetraMenD组 中所观察到的GMT均优于Menomune组，并且所达到的滴度预示着存在 保护作用。最后，看来TetraMenD产生了针对疫苗所包含每一血清群的较 高亲和性的抗体反应。
本试验过程中，在4个特异时间点监测了安全性：报告即刻反应(接种 后30分钟内)、接种后第一个7天内的诱发局部和全身反应、接种后28天 的时间内所有不良事件以及接种后0天至6个月间的持续AE(0-28天)和严 重不良事件。
对于所有的受试者，两个处理组中所报告的大多数局部诱发反应 (Local Solicited Reaction)是轻微的并且可以在接种3天内恢复。对于每一 处理组局部反应的发生频率是相似的。在接受TetraMenD的组中58.8％的 受试者报告有至少1种局部反应，而在接受的组中58.3％的受 试者有同样的反应。此外，对青少年肌肉注射单价C CRM197缀合疫苗出 现局部反应的比例与本研究中接种TetraMenD出现局部反应的比例非常 相似。
大多数所报告AE是不严重的、可逆的并且与疫苗无关。本研究中没 有报告新发支气管哮喘、糖尿病或自身免疫病。
实施例12.研究C-对11-18岁的儿童进行1个月的研究
研究C是对11-18岁的健康儿童进行的随机的、具有阳性对照的研究， 对在0天接受单一剂量的TetraMenD和单一剂量的的儿童进 行比较。分别在0天即接种前和28天抽取血清并分析，如结果中所描述对 来自病人血清的一部分进行进一步评价。
对于所有的受试者，两个处理组中所报告的大多数局部诱发反应是轻 微的并且可以在接种2天内恢复。在接受TetraMenD的组的局部反应频率 (72.4％)比接受的组(34.7％)更普遍。此结果可能是因为缀 合疫苗的性质(包含白喉载体蛋白质)而不是因为施用途径(采用肌肉注射) 造成的。该研究结果总结于下表。
表C-1显示了基线期和接种后28天对于每一血清群的SBA-BR抗体 滴度的频率分布。
表C-1：0天和接种后28天时SBA-BR抗体 滴度的分布(符合方案数据分析)
(续表C-1)
(续表C-1)
(续表C-1)
表C-2总结了按照受试者年龄及TetraMenD血清群的GMT水平。
表C-2：按照受试者年龄及TetraMenD血清群的GMT的总结
表C-3显示了从基线期到接种后28天时对于血清群A、C、Y和W-135 SBA-BR滴度升高≥4倍的受试者数量和百分比。对于每一血清群，在 TetraMenD组中的这些百分比高于组。
表C-3：从基线期至接种后28天SBA-BR滴度升高≥4倍 的受试者数量和百分比
SBA-BR抗体滴度≥32的频率
接种后28天SBA抗体滴度≥32的受试者的比例总结于表C-4。
表C-4：接种后28天SBA抗体滴度≥32的受试者 百分比和数量(符合方案数据分析)
*％：n/N。
n：接种后28天滴度≥32的受试者数量。
N：本组中具有有效的28天血液样品的受试者总数。
SBA-BR抗体滴度≥128的频率
接种后28天SBA抗体滴度≥128的受试者比例总结于表C-5。
表C-5：接种后28天SBA抗体滴度≥128的受试者 百分比和数量(符合方案数据分析)
*％：表示为百分比的n/N。
n：接种后28天滴度≥128的受试者数量。
N：本组中具有有效的28天血液样品的受试者总数。
SBA-BR抗体滴度升高≥4倍的受试者百分比
表C-6显示了接种后28天SBA抗体滴度比基线期升高≥4倍的受试 者百分比。
表C-6：接种后28天SBA抗体滴度比基线期 升高≥4倍的受试者百分比和数量
*％：表示为百分比的n/N。
n：自基线期滴度升高≥4倍的受试者数量。
N：所使用群体的受试者总数。
在0天无法检测到滴度(<8)的受试者中在28天SBA-BR抗体滴度升高≥4倍的受试者百分比
在两个处理组以及对于所有疫苗血清群，在基线期未检测到SBA滴度 （<8)的受试者中，大部分在28天时SBA滴度升高≥4倍。在0天SBA 滴度<8的受试者中，从基线期到28天SBA滴度升高≥4倍的受试者的比 例范围为98.17％-100.0％(表C-7)。
表C-7：在0天未检测到滴度(<8)的受试者中，在28天SBA-BR
抗体滴度升高≥4倍的受试者的数量和百分比
*n＝在每一血清群中0天时滴度<8的受试者中，28天时滴度≥32的受试者数量。
N＝在每一血清群中0天时滴度<8的受试者数量。
百分比的精确95％置信区间
SBA-BR抗体GMT和升高的平均倍数
表C-8显示了基线期和接种后28天的SBA GMT以及SBA GMT升 高的倍数。
表C-8：基线期和接种后28天SBA血清学结果(符合方案数据分析)
*滴度或升高倍数，其中升高倍数＝28天时滴度/0天时滴度。
N：计算所使用受试者总数。
血清群A、C、W-135和Y的IgG ELISA结果
表C-9显示了基线期和接种后28天IgG GMC(μg/mL)以及IgG GMC 升高的倍数。
表C-9：基线期和接种后28天的IgG血清学结果(符合方案数据分析)
*滴度或升高倍数，其中升高倍数＝28天时滴度/0天时滴度。
N：计算所使用受试者总数。
血清群A、C、Y和W-135的IgM ELISA结果
表C-10显示了基线期和接种后28天IgM GMC以及IgM GMC的升 高倍数。
表C-10：基线期和接种后28天的IgM血清学结果(符合方案数据分析)
*滴度或升高倍数，其中升高倍数＝28天时滴度/0天时滴度。
N：计算所使用受试者总数。
接种本研究疫苗TetraMenD后28-56天内，大多数受试者对于疫苗所 包含的每一血清群的SBA-BR抗体滴度均升高≥4倍。总体来说，对于所 有血清学，90.7％的TetraMenD接种者的抗体滴度升高4倍。血清群Y的 接种前抗体水平比血清群C或W-135的高。这可能与以下事实相关，即血 清群Y是目前与美国该年龄阶段侵袭性脑膜炎球菌疾病相关的最普遍的血 清群，并且天然暴露于该血清群可能为更普遍。较高的循环抗体水平反映 了近期天然暴露情况，并可能降低了呈现为4倍或更高抗体反应的疫苗接 种者的比例。与其它血清群相比时发现这似乎是对血清群Y反应的情况。 对于血清群Y升高4倍的受试者比例是81.8％，而对于血清群C是91.7％， 对于血清群W-135是96.7％。高接种前抗体水平的现象也可见于血清群A。 这可能是受试者长时间间断性暴露于多种天然存在的交叉反应抗原中的结 果。
为了进一步评价预先存在的抗体滴度的影响并研究血清阳转率(定义 为：对于任何血清群接种前抗体滴度<1:8，而接种后抗体呈现4倍升高的 受试者比例)，对接种疫苗所包含的4种血清群中任何一种血清群的接种前 抗体滴度<1:8的受试者进行单独分析。在以幼兔作为补体来源的SBA测定 法中<1:8的抗体滴度被认为是循环抗体为不可检测水平。当用这种标准来 评价受试者时，可见接种TetraMenD后，对于血清群A血清阳转率为 100％，对于血清群C为98.1％，对于血清群W-135为98.1％，并且对于 血清群Y为98.3％。
如在另一个研究中中进行的先前的讨论一样，根据对军队新兵的检查 结果，Goldschneider提出，使用人补体来源的SBA测定法中≥1:4的最小 抗体滴度与抗血清群C侵袭性疾病的保护作用相关联。但是，由于测定标 准化的需要以及缺乏可靠的人补体来源，所以建议将幼兔补体作为备选来 源。看起来脑膜炎球菌对幼兔补体比对人补体更敏感，这导致检测出更高 的抗体滴度。一些作者建议，在使用幼兔补体的SBA测定中，≥1:128的 滴度预示着具有保护作用，而<1:8的滴度预示着至少对血清群C易感。尽 管这种水平对于评价多糖疫苗是合适的，但是可能并不适用于缀合疫苗。 Borrow建议，在接种单价C缀合疫苗并且接种后SBA滴度在8-64之间的 受试者中，如果用降低剂量(10μg)的脑膜炎球菌多糖疫苗接种几个月后证 实产生了记忆应答，则表明这些个体同样也受到了保护，抗体水平达到≥ 1:128。对于接种TetraMenD疫苗并且针对每一血清群的SBA-BR滴度≥ 1:128的受试者的结果列于表中。当对疫苗所包含每一血清群使用这些标准 时，总体来说，接种TetraMenD且接种后SBA-BR滴度≥1:128的受试者 占99.2％。使用标准ELISA测定法评价了部分受试者的IgG和IgM反应。 接种后，TetraMenD接种者对每一血清群的IgG抗体平均水平>2μg。在 两个处理组中对每一血清群的IgM反应非常相似。对于血清群C、Y和 W-135的IgG反应，组高于TetraMenD组。然而，接种后对 于血清群C、Y和W-135的SBA GMT水平在每一处理组中非常相似，见 表C-11。
表C-11：IgG和IgM对总的杀菌活性的相对作用
*GMC单位是μg/mL
缀合疫苗诱导的较低水平的IgG产生了与多糖疫苗相似的杀菌活性， 此现象强有力地表明缀合疫苗抗体反应的质量和亲和性优于非缀合多糖疫 苗产生的抗体。正是高亲和性抗体与功能活性和记忆应答相关。这种效应 在一些已公开的研究中也可以见到。
这些资料表明TetraMenD在青少年群体中具有高度的免疫原性。对于 两种疫苗中四个血清群中的每一个，GMT基本上相同，并且所达到的滴 度预示着存在保护作用，并且看起来TetraMenD产生了对疫苗所包含的每 一血清群的较高亲和性的抗体反应。
研究D
研究D是对18-55岁成人进行的随机的、具有阳性对照的研究，对在 0天接受单一剂量的TetraMenD和单一剂量的的成人进行比 较。分别在0天即接种前和28天抽取血清并分析。
一般来说，在安全性方面TetraMenD和Menomune是可比的，尤其 是已报告的诱发局部反应(0-7天)、诱发全身反应(Solicited Systemic Reaction)(0-天)、非诱发不良事件(Unsolicited Adverse Event)(0-28天)、 非诱发明显不良事件和SAE(29天-6个月)以及严重不良事件(0-6个月)出现 的比例都是Menomune的2-3％。本研究结果提供于下表。
SBA-BR抗体滴度的分布
表D-1显示了基线期和接种后28天对于每一血清群的SBA-BR抗体 滴度的频率分布。
表D-1：在0天和接种后28天SBA-BR抗体滴度的分布(符合方案数据分析)
(续表D-1)
表D-2总结了按照受试者年龄和TetraMenD血清群的滴度几何均数 (GMT)。
表D-2：按照受试者年龄和TetraMenD血清群的GMT总结
(续表D-2)
表D-3显示了从基线期到接种后28天对于血清群A、C、Y和W-135 SBA-BR滴度升高≥4倍的受试者的数量和百分比。在TetraMenD组中对 于血清群A(1028/1278，80.4％)；C(1131/1278，88.5％)；Y(941/1278， 73.6％)和W-135(1142/1278，89.4％)的受试者的数量和百分比与 组中对于血清群A(929/1099，84.5％)；C(985/1099，89.6％)； Y(872/1099，79.3％)和W-135(1036/1099，94.3％)的受试者的数量和百 分比是可比的。
表D-3：按照血清群的从基线期SBA-BR滴度升高≥4倍 的受试者的数量和百分比
*检验零假设H0：-PTetraMenD≥0.10对Ha：-PTetraMenD<0.10。
n/N：n＝从基线期滴度升高≥4倍的受试者数量/N＝符合方案数据分析的受试者的总数。
PTetraMenD：TetraMenD组中接种后SBA-BR滴度从基线期升高≥4倍的受试者的百分比。
§：组中接种后SBA-BR滴度从基线期升高≥4倍的受试者的百分比。
SBA-BR抗体滴度≥32的频率
接种后28天SBA-BR抗体滴度≥32的受试者比例总结于表D-4。
表D-4：接种后28天SBA抗体滴度≥32的受试者 的百分比和数量(符合方案数据分析)
*％：n/N。
n：接种后28天滴度≥32的受试者数量/N：该组中具有有效28天 血液样品的受试者总数。
SBA-BR抗体滴度≥128的频率
接种后28天SBA-BR抗体滴度≥128的受试者的比例总结于表D-5。
表D-5：接种后28天SBA抗体滴度≥128的受试者 的百分比和数量(符合方案数据分析)
*％：n/N。
n：接种后28天滴度≥128的受试者数量。
N：该组中具有有效28天血液样品的受试者总数。
表D-6：通过基线期共变量调整的GMT对处理效果的分析： 从0天到28天滴度差异的反应(符合方案数据分析)*
*处理效果的反对数计算为2的处理效果(-TetraMenD)的乘幂。
SBA-BR抗体滴度至少升高≥4倍的受试者的比例
表D-7显示了从基线期至接种后28天SBA抗体滴度较升高≥4倍的 受试者的比例。
表D-7：从基线期至接种后28天SBA抗体滴度较升高≥4倍 的受试者的数量和百分比
*％：n/N。
n：从基线期滴度升高≥4倍的受试者数量。
N：每一血清群中抽取血液的受试者数量。
在0天未检测到滴度(<8)的受试者中，在28天SBA-BR抗体滴度升高≥4倍的受试者的比例
表D-8显示了在0天未检测到滴度(<8)的受试者中，在28天SBA-BR 抗体滴度升高≥4倍的受试者的比例。在两个处理组中并且对于所有的疫 苗血清群，在基线期未检测到滴度(<8)的受试者中的大多数在28天时 SBA滴度升高了≥4倍。在0天滴度<8的受试者中，从基线期至28天SBA 滴度升高≥4倍的受试者比例范围在TetraMenD组中为90.7％-100.0％， 并且在组中为96.9％-99.3％。
表D-8：在0天未检测到滴度(<8)的受试者中，在28天 SBA-BR抗体滴度升高≥4倍的受试者的比例
*％：n/N。
n：在每一血清群中在0天滴度<1:8而在28天滴度≥1:32的受试者数量。
N：在每一血清群中在0天滴度<1:8的受试者数量。
表D-9显示了基线期和接种后28天SBA GMT以及SBA GMT的升 高倍数。
表D-9：按照血清群的抗体滴度几何均数(GMT) 和GMT升高倍数的总结(符合方案数据分析)
*滴度或升高倍数，其中升高倍数＝28天时滴度/0天时滴度。
N：每一血清群中抽取血液的受试者数量。注意：有一个受试者没有取成 第二次血液样品。
根据正常分布的近似值计算GMT的95％CI。
接种本研究疫苗TetraMenD后28-56天内，大多数受试者对于疫苗所 包含的每一血清群的SBA-BR抗体滴度均升高≥4倍。针对血清群A、C、 Y和W-135的抗体滴度升高≥4倍的受试者的比例分别是80.4％、88.5％、 73.6％和89.4％。血清群Y的接种前抗体水平比血清群C或W-135的高。 这可能与以下事实有关，即血清群Y是目前与美国该年龄阶段侵袭性脑膜 炎球菌疾病相关的最普遍的血清群，并且暴露于该血清群可能为更普遍。 较高的循环抗体水平反映了近期天然暴露情况，并可能降低了呈现为4倍 或更高抗体反应的疫苗接种者的比例。与其它血清群相比时发现这似乎是 对血清群Y反应的情况。对于血清群Y升高4倍的受试者比例是73.6％， 而对于血清群C是88.5％，对于血清群W-135是89.4％。高接种前抗体水 平的现象也可见于血清群A。这可能是受试者长时间间断性暴露于多种天 然存在的交叉反应抗原中的结果。
为了进一步评价预先存在的抗体滴度的影响并研究血清阳转率(定义 为：对于任何血清群接种前抗体滴度<1:8，而接种后抗体呈现4倍升高的 受试者比例)，对接种疫苗所包含的4种血清群中任何一种血清群的接种前 抗体滴度<1:8的受试者进行单独分析。在以幼兔作为补体来源的SBA测定 法中<1:8的抗体滴度被认为是循环抗体为不可检测水平。当用这种标准来 评价受试者时，可见接种TetraMenD后，对于血清群A血清阳转率为 100％，对于血清群C为99.4％，对于血清群W-135为96.5％，并且对于 血清群Y为90.7％。
如在另一个研究中中进行的先前讨论一样，根据对军队新兵的检查结 果，Goldschneider提出，使用人补体来源的SBA测定法中≥1:4的最小抗 体滴度与抗血清群C侵袭性疾病的保护作用相关联。建议将幼兔补体作为 备选来源，但是看起来脑膜炎球菌对幼兔补体比对人补体更敏感，这导致 检测出更高的抗体滴度。一些作者建议，在使用幼兔补体的SBA测定中， ≥1:128的滴度预示着具有保护作用，而<1:8的滴度预示着至少对血清群C 易感。尽管这种水平对于评价多糖疫苗是合适的，但是可能并不适用于缀 合疫苗。Borrow建议，在接种单价C缀合疫苗并且接种后SBA滴度在8-64 之间的受试者中，如果用降低剂量(10μg)的脑膜炎球菌多糖疫苗接种几个 月后证实产生了记忆应答，则表明这些个体同样也受到了保护，抗体水平 达到≥1:128。当对疫苗所包含每一血清群应用这些标准时，在接受 TetraMenD的受试者中，接种后针对血清群A、C、Y和W-135的SBA-BR 滴度≥1:128的受试者百分比分别是99.8％、98.7％、96.9％和97.1％。
实施例13.研究E-对10-18岁儿童中进行的Td加强免疫研究
如通过测定具有针对破伤风和白喉滴度的可接受反应的受试者的比 例，本研究比较了破伤风和白喉类毒素(Td)在接受试验性四价脑膜炎球菌 白喉缀合疫苗(即TetraMenD)并伴随Td的组中的加强反应与在接受Td 和安慰剂组中的反应。可接受反应定义为：在接种后28天，从具有预先定 义的低接种前滴度的受试者的基线期值升高至少4倍，和从预先定义的高 接种前滴度的受试者的基线期值升高至少2倍。
为了比较TetraMenD和Td一起施用时对血清群A、C、Y和W-135 的抗体反应与Td疫苗施用后28天再施用TetraMenD中的反应，测定了 针对每一血清群滴度至少升高4倍的受试者的比例。
本实验是随机、改良双盲、阳性对照的多中心试验，将1024位受试者 随机分成两个处理组：A和B。
在11-17岁的儿童中选择出作为常规儿童免疫接种方案一部分将会进 行正常Td疫苗免疫的个体。此外，此年龄范围儿童已经被确认为发展成 侵袭性脑膜炎球菌疾病的高危人群，并且将是脑膜炎球菌缀合疫苗一经许 可后最可能接种的候选人群。为了正确评价疫苗的安全性，采用了一种使 用安慰剂作为对照的改进双盲设计。第一次随访时，注射疫苗的护士是非 盲的，根据方案施用于每一手臂；TetraMenD(IM)或安慰剂接种于右臂， Td接种于左臂。第二次随访时，每一处理组均左臂接种。检测局部和全身 反应和不良事件的评价护士是不知情的。
在11-17岁的儿童中选择出作为常规儿童免疫接种方案一部分将会进 行正常Td疫苗免疫的个体。此外，此年龄范围儿童已经被确认为发展成 侵袭性脑膜炎球菌疾病的高危人群，并且将是脑膜炎球菌缀合疫苗一经许 可后最可能接种的候选人群。
在接种前0天(基线期)和第1次接种后28天，抽取用于血清学测试的 血液样品(至少5mL全血)。在第二次随访后28天从受试者第3次抽血。 测试每一时间点血清中的脑膜炎球菌血清群A、C、Y和W-135、抗白喉 抗体以及抗破伤风抗体。
为了评价TetraMenD接种者的抗体功能，对所有可得样品进行针对每 一疫苗血清群的利用幼兔补体的SBA(SBA-BR)测定分析。一个免疫学 的判定终点是每一处理组中SBA-BR滴度升高≥4倍的受试者比例。通过 测试血清保护Vero细胞免受白喉毒素攻击的能力来测定抗白喉抗体的水 平。通过间接酶联免疫吸附测定(ELISA)测定抗破伤风抗体的水平。
本研究通过检测GMT值，比较了两组受试者对TetraMenD血清群A、 C、Y和W-135的抗体反应，一组来自前面的研究即研究C，其中受试者 接受一次剂量的TetraMenD，另一组为接种Td的同时以及28天后施用 TetraMenD的受试者。
用于血清学分析的血清样品取自接种前基线期(0天)、接种后28天(窗 口期(window)：+28天)和6个月。在接种前以及接种后28天检测针对 破伤风类毒素和白喉类毒素(Td)疫苗的抗体滴度。
测定所有可得接种前和接种后28天血液样品中抗脑膜炎奈瑟氏球菌 血清群A、C、Y和W-135的SBA-BR抗体滴度。总体上，组A和组B的 安全性是可比的。研究结果总结于下表。
表E-1：按照受试者年龄和血清群的GMT水平总结
表E-2显示了在28天破伤风和白喉抗体升高至少4倍或2倍的受试者 的数量和比例。
表E-2：在28天破伤风和白喉抗体升高至少4倍或2倍 的受试者的数量和比例
抗破伤风和白喉抗体滴度和抗血清群A、C、Y和W-135的SBA抗体滴度
表E-2显示了在28天时抗破伤风和白喉抗体升高至少4倍或2倍的受 试者的数量和比例。对于破伤风和白喉比例的差异分别为2.78和-2.73。
表E-2：接种破伤风和白喉疫苗后28天破伤风和白喉抗体反应升高至少4倍 或2倍的受试者总数和比例，初步假设1(符合方案数据分析)
表E-3显示了28天时抗血清群A、C、Y和W-135的抗体滴度升高至 少4倍的受试者的数量和比例。
表E-3：在接种TetraMenD后28天SBA-BR滴度升高≥4倍的 受试者的数量和比例，初步假设2(符合方案数据分析)
表E-4显示了在基线期具有高的白喉和破伤风滴度的受试者的数量以 及在28天时滴度升高2倍的受试者的数量和比例。
表E-4：在基线期具有高的白喉和破伤风接种前滴度受试者的数量(％)以及 在28天时滴度升高2倍的受试者的数量和比例，符合方案数据分析
表E-5显示了在基线期具有低的白喉和破伤风滴度的受试者的数量以 及在28天时滴度升高4倍的受试者的数量和比例。
表E-5：在基线期具有低的白喉和破伤风接种前滴度受试者的数量(％)以及 在28天时滴度升高2倍的受试者的数量和比例，符合方案数据分析
表E-6显示了伴随TetraMenD或安慰剂进行破伤风和白喉疫苗接种后 28天，破伤风和白喉抗体滴度≥1.0IU/ml的受试者的数量和比例。
表E-6：接种破伤风和白喉疫苗后28天，破伤风和白喉抗体滴度 ≥1.0IU/ml的受试者的数量和比例，(符合方案数据分析)
表E-7显示了在破伤风和白喉疫苗接种(伴随TetraMenD或安慰剂施 用)后28天，抗破伤风和白喉抗体滴度的几何均数(GMT)。
表E-7：在破伤风和白喉疫苗接种后28天，抗破伤风和白喉抗体 滴度的几何均数(GMT)比较，(符合方案数据分析)[1]
表E-8显示了接种TetraMenD后28天，抗血清群A、C、Y和W-135 SBA-BR抗体滴度的几何均数(GMT)。对于血清群A、C、Y和W-135GMT 比率分别是0.92、0.42、0.39和0.32。
表E-8：在接种TetraMenD后28天，SBA-BR抗体滴度 的几何均数(GMT)的比较，(符合方案数据分析)[1]
表E-9显示了在Td+TetraMenD，安慰剂组接种TetraMenD后28天 抗血清群A、C、Y和W-135SBA-BR抗体滴度的几何均数(GMT)和研究 MTA02中的相应结果。对于血清群A、C、Y和W-135的GMT比率分别 是0.48、0.38、0.34和0.39。
表E-9：在Td+TetraMenD，安慰剂组中接种TetraMenD后28天SBA-BR的 抗体滴度几何均数(GMT)与研究C中相应结果的比较，(符合方案数据分析)
表E-10显示了在Td+安慰剂，TetraMenD组接种TetraMenD后28 天抗血清群A、C、Y和W-135SBA-BR的抗体滴度几何均数(GMT)和研 究MTA02中的相应结果。对于血清群A、C、Y和W-135，GMT比率分 别是0.53、0.90、0.99和1.05。
表E-10：在组B中接种TetraMenD后28天SBA-BR抗体滴度的几何均数 (GMT)与研究C中相应结果的比较，观察假设(Observational Hypothesis) (符合方案数据分析)[1]
表E-11显示了符合方案数据分析中按照血清群的接种TetraMenD后 0天和28天SBA-BR抗体滴度分布(SBA-BR滴度从<8至1024)。
表E-11：按照血清群的接种TetraMenD后0天和28天SBA-BR 抗体滴度的分布(符合方案数据分析)(SBA-BR滴度从<8至1024)
表E-12显示了符合方案数据分析中按照血清群的接种TetraMenD后 0天和28天SBA-BR抗体滴度分布(SBA-BR滴度从2048至524288)。
表E-12：根据血清群的接种TetraMenD后0天和28天SBA-BR抗体滴度 的分布(符合方案数据分析)(SBA-BR滴度从2048至524288)
表E-13：抗体滴度的总结：破伤风和白喉滴度的分布 (符合方案数据分析)[1]
为了取得与许可的Td疫苗伴随施用的MCV-4疫苗的安全性和免疫原 性，在健康的10-17岁青少年中开展了相关性研究。简而言之，在多中心 随机试验中，对健康的10-17岁(平均年龄12.9岁)青少年同时(n＝509)或者 在分开一个月的不同随访时(n＝512)接种TetraMenD(MCV-4)+Td。在接种 后8天和28天对分别接种和伴随接种的两种疫苗进行安全性评价。通过抗 白喉和破伤风的抗体滴度以及抗脑膜炎球菌血清群的血清杀菌活性(SBA) 来评价接种前和接种4周后的免疫反应。单独接种Td的受试者的安全性 方面与接种Td+TetraMenD的受试者的安全性方面相似。Td+TetraMenD 伴随施用不干扰对破伤风或者白喉类毒素的免疫应答。对四种血清群的 SBA反应总结于下表E-14。
表E-14：对四种血清群的SBA反应
本研究显示同时施用Td和TetraMenD是安全的，所测试受试者耐受 性良好。伴随施用TetraMenD+Td不会对针对破伤风和白喉类毒素的免疫 应答产生不利影响。MCV-4与Td同时施用可以增强对血清群C、Y和 W135多糖的免疫应答。本研究中所观察到的增强免疫应答是令人惊讶和 意料之外的。
实施例14.对使用幼兔补体和使用人补体的脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C、 W-135和Y血清杀菌力测定的比较
来自研究A中III期临床试验的一部分血清样品用于本研究，以便将 抗血清群C、W-135和Y的SBA-BR滴度结果与SBA-HC滴度结果进行 比较。本试验中登记的受试者年龄至少为2岁但还不到11岁，而且将每位 受试者随机指定为两个疫苗接种组之一。在基线期(接种疫苗前)和接种后 28天从每位受试者抽取大约5mL全血。在收集后4小时内，将来自受试 者的血液样品离心。从血凝块中取出血清，转移至标记好的冷冻管并贮存 于-20℃或更冷的温控冰箱中。本报告分析中使用的所有血液样品均来自在 临床研究中登记的第一批受试者的双份血清，并且具有足够的体积以完成 全部计划测试。除了一个样品来自4岁的受试者以外，其余所有样品均来 自2岁至3岁的受试者。有两个受试者为意向性分析类(intent-to-treat category)。其中一个来自TetraMenD疫苗接种组(接种后28天的血液样 品在24天时就收集了)，另一个来自疫苗接种组(接种后28天 的血液样品在9天时就收集了)。
提前筛选出适于每一血清群特异性分析的幼兔补体(Clinical Systems LLC，Brown Deer，WI，产品编号31038)。适宜性标准 包括：与使用先前合格批次的家兔补体对所定义部分的血清样品(两倍稀 释内)进行的SBA-BR检测结果相一致。也可以使用满足对参考血清和对 照样品的预先确定滴度的标准。将2.5ml兔补体的等分试样贮存于-70℃或 温度更低直至准备分析。将等分试样融化一次使用然后丢弃。
为了鉴定能够用于SBA-H的补体源，通过ELISA筛选所登记受试者 血清的抗脑膜炎球菌多糖的IgG和IgM水平，并用SBA-BR测试功能性 抗体。选择人类来源补体所确定标准如下：(1)当使用SBA-BR测定法测定 时缺乏可检测的抗体；(2)当在测定法中用作补体源时缺乏内在的杀菌活 性；(3)当在一组阴性对照中用作补体源时得出的结果是可以接受的，其中 使用Ray Borrow博士在独立的外部实验室确定的先前具有阴性测试结果 的血清，和(4)在一组24个样品中的再现性可以接受。用于每一血清群特 异性测定法中的外源性补体源来自不同的受试者。没有一种补体来源用于 一种以上血清群的测定法。同样，在SBA测定法中使用的三个补体源中， 对于每一血清群使用来自单一供体的补体源。
血清群C
来自具有可接受的低ELISA值(对于IgG和IgM都小于0.5μg/ml)的 几个受试者的血清用来证明杀菌活性。
血清群Y
用于血清群Y SBA-H的补体源选自收集方案中登记的受试者。来自补 体的血清通过ELISA显示为低水平的血清群Y IgG和IgM抗体，并且在 SBA-BR测定中是阴性的。当该来源的血清用于SBA中时没有内在杀菌活 性。
血清群W-135
用于血清群W-135SBA-H的补体源选自收集方案中登记的受试者。 来自补体源的血清通过ELISA显示为低水平的血清群W-135IgG和IgM 抗体，并且在SBA-BR测定中是阴性的。当该来源的血清用于SBA中时 没有内在杀菌活性。
血清杀菌了测定
简而言之，脑膜炎球菌血清群C、Y和W-135菌株来自美国疾病控制 中心,Atlanta,GA(CDC)。由刚刚融化的血清群C、Y和W-135的工作种 子批制备用于测定的细菌靶菌株。每管划线接种于一个Thayer Martin平 板，于37℃±0.5℃、5％CO2条件下培养过夜。第二天，用无菌拭子挑取单 个菌落，并接种于已预热至室温的新鲜Thayer Martin平板的整个表面。 将平板于37℃±0.5℃、5％CO2培养4小时，以获取细菌生长汇合后形成的 亮的菌幕，用无菌拭子收集后悬浮培养于Dulbeccos PBS+0.1％葡萄糖缓冲 液中达到规定的光密度(600nm处的吸光度)。用Dulbeccos PBS+0.1％葡萄 糖缓冲液制备规定浓度细菌的工作液，工作液须维持于室温且在制备后30 分钟内使用。
将测试血清样品于56℃热处理30分钟以失活内源性补体。向96孔微 量滴定板的所有孔中加入Dulbeccos PBS+0.1％葡萄糖缓冲液，然后将测试 血清以连续倍比稀释分配于板内，留下最后两列孔作为补体和血清对照孔。 每块板中包括一个补体列([第11列]-血清/+补体)和一个血清对照列([第12 列]+血清/-补体)。
将刚刚融化的补体与工作浓度的细菌混合，并将混合物分别加入微量 滴定板除血清对照孔之外的所有孔中。将未添加补体的细菌加入到血清对 照孔中。盖上滴定板并置于板振荡器上振荡1分钟，然后转移至37℃±0.5℃ 的CO2培养箱。对于血清群A测定，培养时间是90分钟，而对于血清群 C、Y和W-135测定，培养时间是60分钟。培养后，向所有孔中小心加入 100μl50℃±1℃的琼脂糖覆层培养基，避免产生气泡。在室温中将微量滴 定板盖板微微敞开(避免形成水蒸汽)放置10分钟后，盖上盖板并转移到 干的(没有额外的湿气)5％CO2培养箱中，37℃±0.5℃条件下培养20±4 小时。此次培养后，计数每孔中细菌菌落的数量。计算出补体对照孔中的 每孔菌落的平均数，并除以2得到T0时的50％生存率。
每一未知血清的杀菌滴度表示为与T0时50％生存率相比较达到≥ 50％致死的最终倒数型血清稀释度。在SBA-BR中，样品的起始稀释倍数 为1:8。对于SBA-H，如原始测定法中所述，样品的起始稀释倍数低至1:4。
将文中描述的用于血清群A测定的SBA-BR方法与标准的SBA方法 (CDC)和Manchester Public Health Laboratory Services，Meningococcal Reference Unit，Manchester，UK所执行的SBA方法(PHLS)进行比较， 并列于表14-1。
表14-1：血清杀菌力试验方法的比较
参考血清(CDC供体-R21654-3430107)从CDC的George Carlone博士 得到，为瓶装的冻干粉末，贮存于2℃至8℃直至使用。需要时，将每瓶粉 末用0.5ml无菌水再水化，并以100μl的等分试样工作液贮存于-80℃至 -40℃。在这些条件下重新配制的参考血清的滴度是1:256±1，这是血清群 A、C、Y和W-135的标准化SBA-BR中的两倍稀释液。在每天测定中的 一组板中的不同板中对参考血清测定两次。
对于血清群A、C、Y和W-135的群特异兔抗血清从Difco购得，为 瓶装冻干粉末，使用前贮存于2℃至8℃。需要时，将每瓶粉末用1ml无 菌水再水化，并以50μl的等分试样贮存于-80℃至-40℃，以用作SBA中 的质量控制样品的。
为了确定临床血液样品中补体介导的对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C、 Y和W-135的抗多糖杀菌活性，文中提供了使用幼兔补体的血清杀菌力试 验(SBA-BR)结果，该结果在精度、稀释度(线性)、特异性和检测限是完 全有效的。为了建立测定法的精度，使用同一批血清样品在连续的5天内 重复进行SBA-H测定(对于血清群C)。
SBA-BR敏感性和特异性的计算
使用1:4和1:8的SBA-H基准滴度将从SBA-BR中得到的滴度分成真 阳性(TP)(和假阳性[FP])和真阴性(TN)(和假阴性[FN])。敏感性按照 TP/(TP+FN)来计算，特异性按照TN/(TN+FP)来计算。这些计算结果均用 百分数来表示。
SBA-BR对SBA-H的SBA滴度分布的比较
表1和表4显示了对于血清群C的免疫接种前和免疫接种后28天的 SBA滴度，表2和表5显示了对于血清群Y的免疫接种前和免疫接种后 28天的SBA滴度，表3和表6显示了对于血清群W-135的免疫接种前和 免疫接种后28天的SBA滴度。在下面的分部分中总结了通过比较来自两 种补体源(BR和H)的测定结果对免疫接种前和免疫接种后SBA滴度的分 析。
血清群C的SBA滴度分布
在101个免疫接种前血清样品中，有63个为如下所定义的阴性，该定 义即具有<1:4的SBA-H滴度和<1:8的SBA-BR滴度。有27个免疫接种前 样品用SBA-H测定时是阴性的(<1:4)，但用SBA-BR测定时是阳性的(≥ 1:8)。使用<1:8的SBA-BR截断滴度(cut off titer)的假阳性率为30％。 在较高的SBA-BR截断滴度时假阳性率降低了，在1:128的截断滴度时假 阳性率小于20％并且在1:512的截断滴度时假阳性率小于10％。有7样品 为SBA-H测定阳性(≥1:4)而SBA-BR测定阴性(<1:8)。
在免疫接种后血清中，48个样品为SBA-H测定阴性，但通过SBA-BR 测定时仅有11个为阴性。SBA-BR测定为阴性的11个样品中，有3个为 SBA-H测定阳性。在缀合疫苗接种组中的51个免疫接种后样品中有17个 (32％)为SBA-H测定阴性，但SBA-BR测定阳性(≥1:8)。对于多糖 疫苗接种组，50个免疫接种后样品中有23个(46％)为SBA-H测定阴性， 但SBA-BR滴度测定阳性(≥1:8)。根据免疫接种后血清的阳性反应，101 个样品中有90个(89％)为SBA-BR测定阳性(≥1:8)，但是只有53 个(52％)为SBA-H测定阳性(≥1:4)。当比较来自两个疫苗接种组的 SBA滴度(BR对H)时，发现它们的阳性反应率具有明显差异。对于缀 合疫苗接种组中的51个免疫接种后样品，有33个(65％)为SBA-H测定 阳性(≥1:4)且SBA-BR测定阳性(≥1:8)。当SBA-BR滴度阈值(threshold titer)为≥1:64或更高时，则改善了SBA滴度间(BR对H)一致性。在 多糖疫苗接种组中的50个样品中，有17个(34％)为SBA-H测定阳性(≥ 1:4)且SBA-BR测定阳性(≥1:8)。当SBA-BR滴度阈值为≥1:512或更 高时，则改善了SBA滴度间(BR对H)的一致性。
血清群Y的SBA滴度分布
与血清群C免疫接种前血清不同，仅有9个血清群Y免疫接种前样品 为如下所定义的阴性，该定义即具有<1:4的SBA-H滴度和<1:8的SBA-BR 滴度。在61个免疫接种前样品中，有52个为SBA-H测定阴性(<1:4)但 SBA-BR测定阳性(≥1:8)。使用<1:8的SBA-BR截断滴度的假阳性率为 85％。在较高的SBA-BR截断滴度时假阳性率降低了，在1:256的截断滴 度时假阳性率小于15％并且在1:512的截断滴度时假阳性率小于2％。2 个样品为SBA-H测定阳性(≥1:4)但SBA-BR测定阴性(<1:8)。
在免疫接种后血清样品中，没有一个是SBA-H滴度<1:4且SBA-BR 滴度<1:8。19个样品通过SBA-H测定为阴性(<1:4)但为SBA-BR测定阳性 (≥1:8)。如对于血清群C所指出，假阴性结果的比例是有差异的。在缀合 疫苗接种组中，48个样品中有5个(9％)为SBA-H测定阴性(<1:4)但为 SBA-BR测定阳性。在多糖疫苗接种组中，52个样品中有14个(27％)为 SBA-H测定阴性(<1:4)但为SBA-BR测定阳性。
对于血清群Y免疫接种后血清的阳性反应，两个SBA滴度(BR对H) 具有良好的一致性。对于100个总样品中，所有100个免疫接种后样品为 SBA-BR滴度≥1:8，并且有81个样品的SBA-H滴度≥1:4。如对于血清 组C的SBA反应中所指出，与多糖疫苗接种组的SBA滴度(RB对H) 相比，缀合疫苗接种组的SBA滴度(RB对H)间具有较好的相关性。在 缀合疫苗接种组的48个免疫接种后样品中，有43个(90％)为SBA-H测 定阳性(≥1:4)且SBA-BR测定阳性(≥1:8)。在48个样品中只有一个样 品的SBA-BR滴度小于1:32，且该样品为SBA-H测定阳性(≥1:4)。在 多糖疫苗接种组中，SBA滴度间(BR对H)的一致性不好。在52个免疫 接种后样品中，只有38个样品(73％)的SBA-H滴度≥1:4且SBA-BR 滴度≥1:8。在SBA-BR滴度≥1:128时，多糖疫苗接种组中免疫接种后血 清的SBA滴度间(BR对H)一致性得到改善。
血清群W-135的SBA滴度分布
对于血清群W-135，在100个样品中有54个(54％)为阴性，其中 SBA-H滴度<1:4且SBA-BR滴度<1:8。在81个免疫接种前样品中，有27 个为SBA-H测定阴性(<1:4)但SBA-BR测定阳性(≥1:8)。使用<1:8的 SBA-BR截断滴度的假阳性率为33％。在较高的SBA-BR截断滴度时，假 阳性率降低了，在1:128的截断滴度时假阳性率小于15％，并且在1:256 的截断滴度时假阳性率小于5％。11个样品为SBA-H测定阳性(≥1:4) 但为SBA-BR测定阴性(<1:8)。
在免疫接种后样品中，有3个为SBA-H测定阴性(<1:4)且SBA-BR 测定阴性(<1:8)。39个免疫接种后样品为SBA-H测定阴性(<1:4)，但 SBA-BR滴度阳性(≥1:8)。在缀合疫苗接种组，47个样品中有11个(23％) 为SBA-H测定阴性但SBA-BR测定阳性。在多糖疫苗接种组，53个样品 中有28个(53％)为SBA-H测定阴性但SBA-BR测定阳性。
免疫接种后样品SBA-BR和SBA-H滴度间一致性与血清群C的相当， 但不如血清群Y。如在血清群C和血清群Y中所提到，与比较两个疫苗接 种组时，对于W-135血清群的两种SBA滴度间(BR对H)一致性有显著差 异。与多糖疫苗接种组相比，缀合疫苗接种组中两种SBA滴度间(BR对 H)一致性较好。在缀合疫苗接种组47个免疫接种后样品中，有36个(77％) 样品为SBA-H滴度≥1:4，并且全部样品为SBA-BR测定阳性(≥1:8)。来 自缀合疫苗接种组的所有样品的免疫接种后SBA-BR滴度≥1:32。对于多 糖疫苗接种组的免疫接种后样品滴度，两种SBA滴度间的相关性不好，53 个样品中仅有22个样品(42％)的SBA-H滴度≥1:4并且50个样品(94％) 的SBA-BR滴度≥1:8。
表1：对于血清群C，通过SBA-H测定为 阳性和阴性血清中的SBA-BR滴度的比较
表2：对于血清群Y，通过SBA-H测定为 阳性和阴性血清中的SBA-BR滴度比较
表3：对于血清群W-135，通过SBA-H测定为 阳性和阴性血清中的SBA-BR滴度比较
表4：通过SBA-BR和SBA-H测定的血清群C滴度分布的总结
1样品总数为101。
表5：通过SBA-BR和SBA-H测定的血清群Y滴度分布的总结
1样品总数为100。
表6：通过SBA-BR和SBA-H测定的血清群W-135滴度分布的总结
1样品总数为100。
SBA-BR和SBA-H滴度的敏感性和特异性比较
在进行两种滴度的敏感性和特异性评价时，将SBA-BR滴度与SBA-H 的保护滴度1:4和1:8进行比较。在该分析中使用了免疫接种前和免疫接 种后的两种血清。使用1:4和1:8的SBA-H基准滴度，计算了对于3个血 清组的特异性和敏感性，并总结于表7、9和10。依次讨论对于每一血清 组的敏感性和特异性分析。
对于血清群C，相对于1:4和1:8的SBA-H滴度，SBA-BR的阈值滴 度为1:8、1:16和1:32的敏感性大于80％。但是，这些SBA-BR滴度的特 异性低于60％。在1:64的SBA-BR滴度时特异性增加超过60％，在1:128 的SBA-BR滴度时特异性超过70％。对于该后两种SBA-BR滴度，其敏感 性开始降低。在1:64的SBA-BR阈值滴度时，敏感性在75和78％之间， 但在1:128的SBA-BR滴度时敏感性降至62和65％之间。在SBA-BR滴 度>1:64时特异性继续增加，范围分别从1:128时的73％升至1:256时的 83％。但是，其敏感性由43％降至低于20％。对于血清群C，在敏感性和 特异性间达到最佳平衡的SBA-BR滴度范围是1:32和1:128之间。本试验 中对于血清群C的敏感性和特异性结果与Santos GF等人(Santos GF等 人，2001.Clin.Diagn.Lab.Immunol.8:616-623)通过不同组的血清样品和 试剂得到的结果(表8)是可比的，就Santos的结果来说，敏感性和特异性 达到最好平衡是在SBA-BR滴度1:64和1:128之间，与之相对，两个SBA-H 滴度为1:4和1:8。
表7：对于血清群C，在SBA-H保护滴度时 SBA-BR滴度的敏感性和特异性
表8：如Santos等人，2001.Clin.Diagn.Lab.Immunol.8:616-623中所报道， 对于血清群C，在SBA-H保护滴度时SBA-BR滴度的敏感性和特异性
对于血清群Y，当SBA-BR阈值滴度在1:8到1:64的范围内时敏感性 最高，但是如所期望的那样，在更高的SBA-BR阈值滴度时敏感性降低。 与血清群C的结果相比，血清群Y的特异性结果起始非常低，直到SBA-BR 阈值滴度为1:128时，特异性才达到高于50％的水平。对于血清群Y，敏 感性和特异性达到最佳平衡的SBA-BR滴度位于1:64和1:256之间的范围 内。在1:256时，敏感性降至大约55％，但是特异性从35％左右(mid-30％) 升至大约82-83％。
表9：对于血清群Y，在SBA-H保护滴度时 SBA-BR滴度的敏感性和特异性
对于血清群W135，敏感性数值与血清群C的敏感性数值更接近，但 对于所有三种血清群而言总体模式相同。在SBA-BR阈值滴度为1:8时敏 感性以较高的数值开始，在滴度≥1:128时敏感性降低。同样，在SBA-BR 阈值滴度为1:8时特异性以较低数值开始，直到滴度为1:256时才突破较 低的水平。如对于血清群Y所观察到的一样，对于血清群W135，敏感性 和特异性达到最佳平衡时的SBA-BR滴度范围为1:64和1:256之间。
表10：对于血清群W-135，在SBA-H保护滴度时 SBA-BR滴度的敏感性和特异性
表11总结了相对于免疫接种前SBA-BR滴度，血清群C、Y和W135 的使用幼兔补体或人补体的SBA滴度升高4倍的比例。该分析分别在缀合 疫苗接种组(TetraMenD)和多糖疫苗接种组()中开展，并 且两组分析示于表11。当比较三个血清群和两个疫苗接种组中所诱导的杀 菌反应时，在四倍升高模式中存在一些可观察到的差异。对于每一血清群 和两个疫苗接种组，依次讨论反应模式。
表11：通过SBA-BR和SBA-H测定的脑膜炎球菌多糖 滴度升高4倍的分层比较比率1
1此表显示为通过SBA-BR滴度、疫苗和血清群各层次进行的、如每一测定法中所测定(免疫 接种前和免疫接种后28天的成对样品)的SBA滴度升高4倍的比率(和百分比)。
对于血清群C，在缀合疫苗接种组中SBA-BR对SBA-H之间升高4 倍的受试者比率密切一致。在此疫苗接种组内出现这样一种趋势，即在低 的免疫接种后滴度如1:32-1:128时，SBA-H升高4倍的受试者比率滞后于 的SBA-BR升高4倍的受试者比率。但是，当免疫接种后SBA-BR滴度≥ 1:256时，通过SBA-H测定的达到升高4倍的受试者数量多于通过SBA-BR 测定的达到升高4倍的受试者数量。通过比较，两种补体源测定法间升高 倍数的这种差异较小，并且可能是由于较高的免疫接种前SBA-BR滴度改 变了达到SBA-BR升高4倍的比率。对于多糖疫苗接种组，SBA-BR对 SBA-H之间的升高4倍的比率的一致性不如缀合疫苗接种组那样相近。同 样，没有明显的趋势显示在较高的免疫接种后SBA-BR滴度时多糖疫苗接 种组的SBA-H的4倍升高的比率比缀合疫苗接种组的更加敏感。
对于血清群Y，两个疫苗接种组中SBA-H和SBA-BR的4倍升高比 率之间一致性非常接近。与血清群C的免疫接种后SBA-BR滴度相比，两 个疫苗接种组中的免疫接种后SBA-BR滴度很少有低于1:32的。因为该原 因，与血清群C相比，对于血清群Y达到SBA-BR和SBA-H升高4倍的 受试者比例出现在较高的免疫接种后SBA-BR滴度。对于血清群Y，在缀 合疫苗接种组中当免疫接种后SBA-BR滴度为1:128时，升高4倍的受试 者比例增加至≥50％，然而对于血清群C，此时的缀合疫苗接种组的 SBA-BR阈值滴度则是1:32。
与其它两种血清群相比，血清群W135的SBA-H和SBA-BR升高4 倍的比率之间的一致性不是很接近。如对于血清群Y中所观察的一样，在 两个疫苗接种组中只有有限数量的受试者其免疫接种后SBA-BR滴度小于 1:32。在SBA-BR滴度≥1:256时，SBA滴度中升高4倍的比率之间(BR 对H)是一致的。如与在血清群C中所提到的一样，两个疫苗接种组之间的 升高4倍(BR对H)的比例存在差异，这种差异对于血清群Y是不明显的。 与其它两种血清群多糖疫苗接种组中SBA滴度升高4倍的比率相比，多糖 疫苗接种组中血清群W135的SBA滴度(BR对H)中升高4倍的比率间的 一致性是最差的。
为了测定用许可的四价脑膜炎球菌多糖疫苗()或者用试验 的四价脑膜炎球菌多糖缀合疫苗(TetraMenD)接种的2-3岁受试者中血清 样品的滴度，将使用幼兔补体的血清杀菌力试验(SBA-BR)与相应的使 用人补体的血清杀菌力试验(SBA-H)相比较。用于血清群C、Y和W135 的补体源是经鉴定的并且用于支持该种SBA比较。使用2种方法分析了来 自该比较研究中的SBA结果。在一种方法中，通过测定两个疫苗接种组的 免疫接种前和免疫接种后滴度得到SBA-BR和SBA-H数据，并将数据混 合用于分析。在第二种方法中，对来自两个疫苗接种组的免疫接种前和免 疫接种后滴度分别进行分析。该分析的目标之一是描述与阴性SBA-H血清 滴度具有最佳相关性的SBA-BR血清滴度。第二个目标是确定与使用人补 体试验中测定的与对血清群C有保护作用相关联的阳性滴度具有最佳相关 性的使用幼兔补体所测定的滴度，并推断出对于血清群Y和W135的保护 性杀菌滴度。我们实验室已经公布了尝试建立针对血清群C的SBA-BR相 关联的保护性阈值的结果。本研究的结果将与那些公布的结果相比较。最 近，对使用两种补体源所测定的免疫接种前和免疫接种后血清SBA滴度升 高4倍的比率进行了比较。
仅仅针对血清群C建立了SBA滴度与抵抗疾病的保护作用之间的关 联。对于血清群C，与保护作用关联的SBA是在使用人补体的SBA测定 中确定的。对于其它血清群，假设与血清群C中保护作用关联的SBA-H (SBA滴度为1:4)同样适用。对与血清群C的1:4的SBA滴度相关联的 SBA-BR滴度的定义在血清群间是不同的。在定义与阴性SBA-H血清滴度 最佳关联的SBA-BR方面，将免疫接种前和免疫接种后血清中<1:8的 SBA-BR滴度比作<1:4的SBA-H滴度。所使用的<1:8的SBA-BR滴度是 部分地基于WHO/CDC关于血清群C SBA滴度(BR对H)的比较研究结果 以及最新发现，即<1:4的SBA-BR滴度与爆发于英国大学的血清群C疾病 的易感性相关(Jones，G.R.等人，2000.J.Infect.Dis.181:1172-1175)。
根据本研究得到的SBA滴度(BR对H)，对于血清群C使用<1:8的 SBA-BR截断滴度的假阳性率为30％。使用较高的SBA-BR截断滴度可以 改善假阳性率，如下：在≥1:16时假阳性率降至26％；在≥1:32时假阳性 率降至24％，在≥1:64时假阳性率降至22％，在≥1:128时假阳性率降至 18％，在≥1:256时假阳性率降至14％，并且在≥1:512时假阳性率降至 2％。升高SBA-BR截断滴度的确改善了对对应于<1:4的SBA-H滴度的阴 性滴度定义的准确性，但是当使用较高的SBA-BR截断滴度时，区分阳性 反应和阴性反应的敏感性则非常低。本报告资料显示，当截断滴度为1:8、 1:16或1:32时，SBA-BR的敏感性最高(81-84％)。SBA-BR滴度大于1:32 时，其敏感性降至80％以下。但是，当截断滴度为1:8、1:16和1:32时该 测定法的特异性为最低，范围在51-58％之间。在选择与人补体测定的阴性 滴度相关联的截断滴度时，要在敏感性、特异性和假阳性率之间取得平衡。 指定1:32作为SBA-BR截断滴度将导致无谓地舍弃真阳性应答反应者。该 研究结果指出，≥1:16的SBA-BR滴度可能是更合适的截断滴度。根据 WHO/CDC的研究分析(<1:8)和英国大学的爆发分析(<1:4)，认为在该滴度 之上至少2倍稀释的滴度是具有保护性的。
对于血清群W135和Y的测定法中保护性截断滴度的确定来自这样一 种假设：即它们的杀菌抗体保护作用与血清群C疾病的类似并且与对应于 人补体测定中阴性滴度的杀菌滴度相似。对于血清群Y，使用<1:8的 SBA-BR截断滴度的假阳性率相当高，达到85％，而对于血清群C为30％。 但是，和血清群C一样，增加SBA-BR截断滴度可以降低假阳性率。SBA-BR 截断滴度为1:16时假阳性率降至84％，在1:32时假阳性率是75％，在1:64 时假阳性率是61％，在1:128时假阳性率是38％，在1:256时假阳性率是 13％，并且在1:512时假阳性率是2％。即使血清群Y的假阳性率在开始 时比血清群C高很多，但是当截断滴度≥1:128时，两种血清群测定中的 假阳性率就变得相当接近了。然而，如此高的截断滴度，可能夸大了阳性 反应的阈值滴度。根据敏感性和特异性分析，当SBA-BR截断滴度为 1:8-1:32时敏感性达到最大值，范围为95-98％。但是，和血清群C一样， 在这些SBA-BR滴度时特异性相应地较低，范围为11-18％。当SBA-BR 滴度为次高(1:64)时，敏感性从95％降至88％，但特异性急剧升至35％。 在血清群Y测定中<1:64的截断滴度与人补体测定中的阴性滴度最相当。
对于血清群W135，在<1:8的SBA-BR截断滴度时假阳性率为33％， 这与血清群C相似。就像在血清群C和Y中提到的一样，在较高的SBA-BR 截断滴度时，假阳性率降至较低的水平。当SBA-BR截断滴度为1:16时假 阳性率降至32％，在1:32时假阳性率降至28％，在1:64时假阳性率降至 26％，在1:128时假阳性率降至12％，在1:256时假阳性率降至4％，且 在1:512时假阳性率降至0％。SBA-BR滴度范围在1:8-1:64之间时敏感性 最高(86％-81％)。如所预期，在此SBA-BR滴度范围内，特异性最低 (46％-52％)。即使血清群W135的假阳性率开始时比血清群Y低很多，但 是与人补体测定的阴性滴度最相当的截断滴度是<1:64。
对于三个血清群，已经确定了对应于人补体测定中阴性滴度的滴度， 对超过这些水平的SBA-BR滴度进行了作为阳性反应的阈值滴度分析。对 于血清群C，阳性反应的阈值滴度是≥1:16，对于血清群Y，阳性反应的 阈值滴度是≥1:64，对于血清群W135，阳性反应的阈值滴度是≥1:64。对 于血清群C来说，≥1:128的SBA-BR阈值滴度提供了良好的保证，即相 对于1:4或者1:8的SBA-H滴度达到了保护性滴度并且保护性滴度与血清 群C的1:4的有效SBA-H滴度相关联。此阈值滴度与WHO/CDC的有关 血清群C的数据集合和Santos的数据集合非常相近。就象这两种研究中提 到的那样，滴度≥1:128高度预示着具有保护作用，但是SBA-BR滴度小 于1:128可能也具有保护性。对于WHO/CDC和Santos的数据集合，1:8、 1:16、1:32、1:64的SBA-BR滴度被作为不确定滴度。因为文中作为对于 血清群C的数据集合提到小于1:16的SBA-BR滴度被视为阴性，则该分 析中不确定滴度为1:16-1:64，而1:16-1:64的滴度恰恰是另外两个研究所 得到结果的一个子集。在所有的这些分析中，正是对SBA-BR滴度与二十 世纪60年代所收集的天然保护性数据相关联的SBA-H滴度(1:4或1:8)进 行比较。
最近，人们已经努力将单价血清群C缀合物在英国的功效数据同 SBA-BR滴度直接联系起来(Miller E，等人，2002，Vaccine 20:S58-S67)。 在此分析中，发现≥1:8和≥1:128的SBA-BR滴度与迄今收集的功效数据 有很好的相关性，这些数据是从接种单一剂量单价血清群C缀合物的15-17 岁受试者中得到的结果。但是，当Miller及其同事对幼儿组(12-30个月) 进行同样的分析时，他们发现≥1:8的SBA-BR滴度与功效有很好的一致 性，但是当SBA-BR滴度≥1:128时没有如此接近的一致性。Miller于2002 年9月1-6日在挪威奥斯陆(Oslo)举行的第13届国际致病性奈瑟菌属 (Neisseria)大会上展示了另外的数据，其中在接种后一个月达到SBA-BR 滴度≥1:64的受试者的预测效能处于对于该年龄组的所观察功效的95％置 信区间之外。这些数据支持这样一种观点，即1:8-1:64不确定区域内的 SBA-BR滴度有助于确保保护作用。根据该研究分析，1:16-1:64的SBA-BR 滴度同样也有助于确保对于血清群C的保护作用。
在血清群Y测定中，在1:64的SBA-BR滴度时特异性仅为35％，但 是当截断滴度升高到1:128和1:256时，特异性分别升高至59％和84％。 ≥1:256的阈值滴度很好地保证了人补体测定中1:4和1:8的保护性滴度。 但是，对于血清群Y，在1:128的阈值滴度时，敏感性和特异性达到了较 好的平衡。与同SBA-H保护性滴度相关联的血清群C的SBA-BR滴度 1:16-1:64的相应范围相比，血清群Y的SBA-BR滴度范围1:64-1:128代 表了滴度的不确定范围。
在血清群W-135测定中，在1:64的SBA-BR滴度时特异性为52％， 但是当滴度升高到1:128和1:256时，特异性分别升高至64％和77％。和 血清群Y一样，≥1:256的阈值滴度很好地保证了人补体测定中1:4和1:8 的保护性滴度。与血清群Y一样，当对于血清群W135，阈值滴度为1:128 时，敏感性和特异性达到了较好的平衡。与同本研究中SBA-H保护性滴度 相关联的血清群C的SBA-BR滴度1:16-1:64的范围相比，血清群W-135 的SBA-BR滴度范围1:64-1:128代表了滴度的不确定范围。
对于每一血清群计算了杀菌滴度中的4倍升高，并且使用两种测定法 按照疫苗接种组分别进行分析。应当指出，对于全部三种血清群在SBA滴 度(BR和H)中的4倍升高通常在较高的免疫接种后SBA-BR滴度中检 测到。按照血清群和按照疫苗接种组分析，SBA滴度(BR对H)的4倍升高 均不同。对于血清群C，在较低的免疫接种后SBA-BR滴度的情况下，使 用人补体测定的升高4倍的受试者比率比使用幼兔补体测定的滴度升高4 倍的受试者比率要低。然而，在较高的免疫接种后SBA-BR滴度的情况下， 使用人补体测定的4倍升高的受试者比率比较高。该模式似乎表明，在低 的免疫接种后SBA-BR滴度时，使用人补体的测定法的敏感性比使用幼兔 补体的测定法的敏感性低，但在高的免疫接种后SBA-BR滴度时，情况相 反，也就是说，使用人补体的测定法变得更加灵敏。当测定样品来自多糖 疫苗接种组时，这种模式不明显。当使用人补体的测定法时，这些样品中 滴度升高4倍的受试者比率较低。尽管还无法解释样品类型间出现的这种 结果，但这的确表明对于具有较低滴度杀菌活性的血清样品，使用人补体 的测定法缺乏敏感性
对于血清群Y，使用两种补体源进行比较后发现SBA滴度4倍升高的 比率非常一致。与多糖疫苗接种组相比，缀合疫苗接种组中SBA滴度(BR 和H)4倍升高的比率稍高，但是这种差异不如血清群C组中的大。
对于血清群W135，在两个疫苗接种组的使用人补体或幼兔补体的 SBA滴度升高4倍的比率的一致性不如其它两种血清群好。在两个疫苗接 种组中SBA-BR滴度4倍升高的情况非常好，但是SBA-H滴度4倍升高 的比率比其它两种血清群低。在多糖疫苗接种组中SBA-H滴度4倍升高的 受试者比率相当低，并且比其它两种血清群SBA-H滴度4倍升高的比率都 要低。
使用BR补体的SBA滴度4倍升高已经成为注册脑膜炎球菌多糖疫苗 的基准。最近，人们努力将SBA-BR滴度的4倍升高与临床疗效结合起来， 此临床疗效是来自英国对单价血清群C缀合疫苗注册后的监视资料 (Borrow R，等人，2001，Infect.Immun.69:1568-1573)。根据本分析，单 价血清群C缀合疫苗对于12-30个月的幼儿的功效在第一次剂量后的16 个月内估计为88％(69-95％)。对于该年龄组，在单价血清群C缀合疫苗一 次剂量之后，达到SBA-BR滴度4倍升高的受试者比例为89-100％。
文中提供的SBA-BR资料提供了杀菌滴度值，与使用人补体作为补体 源测定法中对于血清群C所获得的杀菌滴度值具有可比性。因此，这些 SBA-BR滴度与最初的研究有关，最初的研究确定了对血清群C脑膜炎球 菌疾病保护性免疫的替代物，并且这些SBA-BR滴度支持对文中提供的保 护作用的临床结果的外推，并且对于血清群C的SBA-BR滴度与其它实验 室报道的那些结果是可比的。通过与血清群C模型的类比，使用人补体的 SBA在确定针对血清群Y和W-135荚膜多糖的血清群特异性反应中的表 现支持：用于确定杀菌滴度的SBA-BR与血清群Y和W-135具有关联性。
机译： 多价脑膜炎球菌衍生的多糖蛋白缀合物和相应的疫苗
机译： 多价脑膜炎球菌衍生的多糖蛋白缀合物和疫苗
机译： 多价脑膜炎球菌衍生的多糖蛋白缀合物和相应的疫苗
