一种早期筛选柑橘胞质杂种的方法

摘要

本发明公开了一种早期筛选柑橘胞质杂种的方法。根据柑橘细胞对称融合可以再生二倍体叶肉亲本型胞质杂种的现象及其分子水平上的组成特征，以及外源基因一般仅整合在细胞核基因组而不是整合在胞质基因组的特点，将GFP标记用于柑橘胞质杂种的安全高效早期筛选，以提高胞质杂种细胞的筛选和再生效率。通过将转GFP基因的国庆1号温州蜜柑与中国特色有核或多核柑橘类型对称融合的思路，根据胞质杂种细胞不带有GFP标记这一特点，在培养再生的早期挑选胞质杂种细胞进一步培养，从而实现胞质杂种的早期筛选，提高其再生效率，同时去除了GFP标记基因，为柑橘胞质杂种筛选提供了安全高效的新方法及新种质。

说明书

技术领域

本发明属于植物新品种选育技术领域，具体涉及一种早期筛选柑橘胞质杂种的方 法。

背景技术

柑橘细胞融合一般采用“悬浮系原生质体+叶肉原生质体”的模式，利用柑橘叶肉 原生质体在目前体系下单独培养或者共培养都不能分裂再生植株的特点，是一种半筛 选体系。但部分融合组合中，再生植株除预期的异源四倍体体细胞杂种和悬浮系亲本 再生类型外，还再生了叶片形态类似叶肉亲本的二倍体植株（邓秀新，郭文武，余桂红， 2000，柑橘细胞融合再生9个组合二倍体叶肉亲本类型植株。园艺学报，27(1)：1-5）。 这类植株已在近40例融合组合中出现，而且绝大多数是种间融合组合。部分融合组合的叶 肉亲本型植株经分子杂交、CAPS(cleaved amplification polymorphism sequence-tagged  sites，限制性片段长度多态性聚合酶链反应)或SSR（simple sequence repeat,简单重复 序列）分析鉴定，表明其核DNA来自叶肉亲本，mtDNA（mitochondrial DNA,线粒 体DNA）来自悬浮系亲本，cpDNA（chloroplast DNA，叶绿体DNA）随机遗传， 即叶肉亲本型植株实际上是杂种起源的，为胞质杂种（Bassene JB等，2011，Influence  of mitochondria on gene expression in a citrus cybrid.Plant Cell Rep30:1077-1085；Cai XD等， 2009，Cybrid/hybrid plants regenerated from somatic fusions between male sterile Satsuma  mandarin and seedy tangelos.Scientia Hort122:323-327；Fanciullino AL等，2005，Effects of  nucleo-cytoplasmic interactions on leaf volatile compounds from citrus somatic diploid hybrids.J. Agric.Food Chem53:4517-4523；Guo WW等，2006，Molecular analysis revealed autotetraploid, diploid and tetraploid cybrid plants regenerated from an interspecific somatic fusion in Citrus. Scientia Horticulturae108:162-166）。

柑橘细胞对称融合可以再生二倍体叶肉亲本型胞质杂种的现象以及其分子水平上的组 成特征为有针对性地选配融合组合、转移由线粒体基因组控制的胞质雄性不育性状、从而改 良多籽柑橘品种提供了很好的实验体系。即将雄性不育品种的悬浮系原生质体与有籽品 种的叶肉原生质体融合，再生出有籽品种的二倍体胞质杂种，其细胞核基因组来自叶 肉亲本但带有了无籽品种的雄性不育胞质基因，有望改良有籽品种，使其不育，从而 生产无籽果实，实现二倍体水平上的无籽。

大量有性杂交研究表明，温州蜜柑的雄性不育性由核质基因互作引起，为细胞质雄性不 育类型（Yamamoto等1997.Aborted anthers of Citrus result from gene-cytoplasmic ale sterility. Sci Hortic70:9-14）。因此，有针对性地开展温州蜜柑与其它多籽柑橘类型间的融合研究， 具有重要意义。基于该思路，本专利申请人已获得温州蜜柑与HB柚等融合再生的二倍体叶 肉亲本型胞质杂种，且表现出雄性不育和果实无核；但胞质杂种创制的效率偏低。本发明 旨在以GFP（绿色荧光蛋白）标记负选择，早期筛选不含GFP标记的柑橘胞质杂种细 胞，建立其安全、高效的早期筛选体系。

发明内容

本发明的目的在于克服已有技术的不足，提供一种早期筛选柑橘胞质杂种的方法。 通过将来自转GFP基因柑橘愈伤组织细胞系的原生质体与另一亲本的叶肉原生质体 融合，在离体培养的早期，在倒置荧光显微镜下筛选不带GFP标记的杂种细胞系进 一步培养再生胞质杂种，从而增强胞质杂种创制的针对性，减少工作量，提高胞质杂 种创制的效率。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：

本发明的发明思路是：转GFP基因柑橘愈伤组织细胞系的原生质体与另一亲本的 叶肉原生质体融合，在离体培养的再生产物中，愈伤亲本再生细胞系含有GFP标记， 体细胞杂种融合双亲细胞核也含有来自愈伤亲本的GFP标记，而胞质杂种的细胞核来 自叶肉亲本不含GFP标记；因此可在离体培养的早期，通过倒置荧光显微镜筛选不带 GFP标记的杂种细胞系进一步培养再生得到胞质杂种，从而增强胞质杂种创制的针对 性，减少工作量，提高胞质杂种创制的效率。

一种早期筛选柑橘胞质杂种的方法，其步骤是：

1）双亲材料的选择：以转GFP基因的国庆1号温州蜜柑愈伤组织为悬浮系亲本， 取保存于MT固体基本培养基上的转有GFP基因的国庆1号温州蜜柑愈伤组织于液 体悬浮培养基进行悬浮培养，以14天为1个继代培养周期，暗培养，温度为28℃， 摇床转速控制在110－120rpm；继代培养3个周期后进行原生质体分离；以有核柑橘 为叶肉亲本，将所述的转GFP基因国庆1号温州蜜柑愈伤组织或有核柑橘叶肉分别 用缓冲液A+酶液A或缓冲液B+酶液B进行原生质体分离和纯化，得到原生质体；

2）将步骤1）的原生质体用电融合法融合，得到融合产物；

3）将步骤2）的融合产物离心，去掉上清，将沉淀转入MA1液体培养基，之后与35-40℃ 的MA2固体培养基等体积混合进行固体包埋培养，待细胞团长到直径为0.5-1.0cm时， 在倒置荧光显微镜下观察，筛选无荧光的再生细胞系转入胚状体诱导培养基上诱导培 养，使其分化出球形胚或心形胚，及时将所述的球形胚或心形胚转移到胚状体增殖培 养基上使其转绿和进一步发育成子叶形胚状体；选取子叶形胚状体转入生芽培养基诱 导生芽，将获得的丛芽转入生根培养基诱导生根；将生根的杂种植株移栽入温室，得 到胞质杂种材料；

4）对步骤3）的胞质杂种材料，采用流式细胞仪进行倍性鉴定；以SSR和CAPS分子 标记方法进行细胞核基因组和线粒体基因组分析；以PCR和Southern blot方法鉴定是否含 有GFP基因。

在本发明中：

步骤（1）所述的叶肉亲本选自早金甜橙。

与现有技术相比，本发明优点如下：

1）本发明将转GFP基因的柑橘愈伤组织细胞系用于胞质杂种的安全高效早期筛选，与采 用不带有GFP基因的柑橘愈伤组织细胞系进行细胞融合相比，胞质杂种的离体筛选效 率大大提高：所挑选的无荧光细胞团再生出的植株中胞质杂种率将达到100%，且这 些植株100%不含GFP基因，实现对胞质杂种的安全高效筛选；

2）与非对称方法相比，方法简单、易再生；

3）与有性杂交相比，胞质杂种在1年内可创造再生，可显著缩短育种周期。

附图说明

图1为一种本发明的技术流程图。

图2为一种融合细胞培养早期荧光观察示意图。

图2说明观察的融合细胞在培养第6天时GFP荧光消失，此类细胞后期可能再生为无 荧光的细胞团即胞质杂种：a-b为细胞培养0天的情况，c-d为细胞培养6天的情况;GFP模 式激发波长为460-480nm，发射波长为495-540nm；Bars=10μm。

图3为一种再生的愈伤组织示意图。

图4为一种再生细胞团的荧光观察示意图。

图中：a,b为无GFP荧光的细胞团（a明场；b GFP）；c,d为有GFP荧光的细胞团（c明 场；d GFP）；Bars=40μm

具体实施方式

本发明所涉及培养基或溶液，其配方如下：

缓冲液A：MT基本培养基+0.7mol/L蔗糖+500mg/L麦芽提取物，调pH至5.8；

缓冲液B：MT基本培养基+0.6mol/L蔗糖+500mg/L麦芽提取物，调pH至5.8；

酶液A：0.6%纤维素酶R-10+0.6%离析酶R-10+12.8%甘露醇+0.011%NaH₂PO₄+0.12%吗啉乙磺酸+0.36%CaCl₂.2H₂O，调pH至5.8，酶液通过0.22μm醋酸纤维微孔滤 膜过滤灭菌；

酶液B：0.75%纤维素酶R-10+0.75%离析酶R-10+12.8%甘露醇+0.011% NaH₂PO₄+0.12%吗啉乙磺酸+0.36%CaCl₂.2H₂O，调pH至5.8，酶液通过0.22μm醋酸 纤维微孔滤膜过滤灭菌；

MT固体培养基：MT基本培养基+40g/L蔗糖，调pH至5.8；

MT播种培养基：MT基本培养基+30g/L蔗糖，调pH至5.8；

液体悬浮培养基：MT基本培养基+500mg/L麦芽提取物+1.5g谷氨酰胺+40g/L 蔗糖，补充蒸馏水至1L，调pH至5.8；

MA1液体培养基：MT基本培养基+51.34g/L蔗糖+81.98g/L甘露醇+80mg/L腺 嘌呤，补充蒸馏水至1L，调pH至5.8；

MA2固体培养基：MT基本培养基+51.34g/L蔗糖+81.98g/L甘露醇+12g/L低 熔点琼脂糖，补充蒸馏水至1L，调pH至5.8；

胚状体诱导培养基：MT基本培养基+50g/L蔗糖+500mg/L麦芽提取物，补充蒸馏 水至1L，调pH至5.8；

乳糖固体培养基：MT基本培养基+50g/L乳糖，补充蒸馏水至1L，调pH至5.8；

甘油固体培养基：MT基本培养基+20mL/L甘油，补充蒸馏水至1L，调pH至5.8；

胚状体增殖培养基：MT基本培养基+50g/L蔗糖+1500mg/L麦芽提取物，补充蒸 馏水至1L，调pH至5.8；

生芽培养基：MT基本培养基+0.5mg/L激动素+0.5mg/L6-苄基腺嘌呤+0.1mg/L 吲哚乙酸+30g/L蔗糖，补充蒸馏水至1L，调pH至5.8；

生根培养基：1/2MT基本培养基+0.5mg/L萘乙酸+0.1mg/L吲哚丁酸+0.5g/L活 性炭+20g/L蔗糖，补充蒸馏水至1L，调pH至5.8；

实施例1：

一种早期筛选柑橘胞质杂种的方法，其步骤是：

1、双亲材料的准备：

柑橘胚性悬浮系建立：挑选保存于MT固体培养基上生长旺盛、颗粒细小、颜色淡黄及 组织疏松的转GFP基因国庆1号温州蜜柑愈伤组织于液体悬浮培养基中进行液体悬浮培养。 继代周期为14d，培养条件为暗培养，温度控制在28℃，摇床转速控制在110-120rpm。继代 3次后用于亲本原生质体分离。

叶肉亲本制备：取早金甜橙有核柑橘品种成熟种子，先用1%（w/v）NaOH浸泡5-10min， 中间用玻璃棒搅拌多次以除去果胶，用蒸馏水洗净NaOH后，经1-3%（w/v）NaClO表面 消毒10min，无菌蒸馏水清洗3-5次，去种皮，接种于MT播种培养基，播种25天后，取 充分展开的叶片分离原生质体。

2、柑橘原生质体的分离与纯化：

柑橘亲本原生质体分离参见郭文武等报道的方法（郭文武，邓秀新，史永忠．柑橘细 胞电融合参数选择及种间体细胞杂种植株再生．植物学报，1998，40(4)：417-424）。具体方 法是：（1）转GFP基因国庆1号温州蜜柑愈伤组织原生质体的酶解：在转GFP基因国庆1 号温州蜜柑愈伤组织悬浮系继代的4-7天内，用长吸管吸取约1g愈伤组织于60mm×15mm 小培养皿中，将此培养皿中的液体悬浮培养基吸干后，加入1.5mL左右的缓冲液A，再加 入等体积的酶液A，培养皿用Parafilm封口后在暗培养箱（28℃）中静置酶解16-20h。

叶肉原生质体的酶解：取MT播种培养基上充分展开的有核柑橘品种叶片，用无菌手术 刀片将叶片切成1-2mm的条状，然后放入预先加入了1.5mL左右的缓冲液B的60mm×15 mm培养皿中，最后加入等体积的酶液B，其后操作同于酶解愈伤组织原生质体。

酶解完成后的两种原生质体均通过孔径为45μm的不锈钢筛网过滤，以除去残留材料 和大细胞团，然后用CPW13（配方见表1）洗涤筛网以充分收集原生质体；将滤液倒入10mL 的离心管中960rpm(100g)离心7-8min，弃上清液，将沉淀物与1.0mL的CPW13混匀， 然后将此混合液用吸管轻轻地转移到预先加入了3mL CPW26（配方见表1）的10mL离心 管中，经CPW13/CPW26界面密度梯度离心（960rpm(100g)）2-3min后，用吸管将两液面 间的原生质体带吸出，用电融合液重悬后960rpm(100g)离心洗涤1-2次，每次6-8min。 纯化后的原生质体悬浮于电融合液（0.7mol/L甘露醇﹢0.25m mol/L CaCl₂）中，用血球计 数板将愈伤组织原生质体密度调整为1×10⁶个/mL，叶肉原生质体调整到2×10⁶个/mL。

表1CPW盐配方

3、原生质体融合：

采用日本岛津公司SSH-2型（Shimadzu Somatic Hybridizer-2,Japan）融合仪，融合小池 为FTC-04（容积为1.6mL，电极距离为0.4cm）。柑橘亲本原生质体融合方法参见郭文武等 报道的方法（郭文武，邓秀新，史永忠．柑橘细胞电融合参数选择及种间体细胞杂种植株再 生．植物学报，1998，40(4)：417-424）。具体方法是：融合前先用无菌吸管吸取一定量的电 融合液于融合小池环形槽中，洗涤1-2次，以防原生质体集聚于电极两侧的角落里。然后将 调整了密度的双亲原生质体等体积混合，用长吸管吸取1.6mL原生质体混合液于环形槽中， 轻轻晃动融合小池使混合液均匀分布于环形槽。槽中央加几滴融合液用于保湿，用Parafilm 封口后静置5-10min。待大量原生质体处于同一平面后开始融合，融合参数为：AC100V/cm， AC作用时间60s；DC1250V/cm，DC印加时间40-45μs；脉冲间隔0.5s，脉冲5次。融 合后静置15-20min，以利于融合子的圆球化。最后轻轻吸出融合产物于10mL离心管，用 MA1液体培养基离心洗涤1-2次，原生质体沉淀用MA1液体培养基悬浮。

4、融合产物培养和胞质杂种的早期筛选：

本试验采用在MA培养基中进行固体包埋培养法。具体方法为：

1）洗涤后的原生质体用MA1液体培养基将密度调整到8-10×10⁴个/mL，之后与35-40℃ 的MA2固体培养基等体积混合，用吸管将混合液转移至60mm×15mm培养皿中，每皿1.5 mL左右，Parifilm封口膜封口后在培养箱中进行暗培养，温度维持28℃左右。

2）胞质杂种早期筛选（图2，图3，图4所示）：当原生质体形成肉眼可见的小细胞团（约 1-2mm)或胚状体时（图3），在Olympus IX71倒置荧光显微镜下，用GFP荧光模式（GFP 模式激发波长为460-480nm，发射波长为495-540nm）观察，筛选无GFP荧光的细胞 系即胞质杂种（图4），并用尖头镊子将筛选出的无GFP荧光小细胞团或胚状体挑出，置于 胚状体诱导培养基，乳糖固体培养基或甘油固体培养基，同时覆盖一层MA1液体培养基， 光下进行固液双层培养。

3）等细胞团长到一定大小时，转入到胚状体诱导培养基上诱导胚状体的发生；

4）细胞团长出球形胚、心形胚时，及时转入到胚状体增殖培养基上以利于胚状体 的进一步发育和转绿；

5）将发育到子叶胚期的胚状体转入生芽培养基诱导生芽；

6）将获得的丛芽转入生根培养基诱导生根或进行试管嫁接，具体方法参见文献 （伊华林.试管嫁接提高柑桔三倍体组培苗成苗率试验.中国果树，2000（4）：28-29）， 最后将再生苗移植于温室。

5、胞质杂种的鉴定

1）倍性分析：倍性分析由德国Partec公司生产的流式细胞仪完成。操作程序参照Guo 等（Guo WW,Cheng YJ,Chen CL,Deng XX(2006)Molecular analysis revealed autotetraploid, diploid and tetraploid cybrid plants regenerated from an interspecific somatic fusion in Citrus. Scientia Horticulturae108:162-166）；2006）报道的方法。

结果：由无荧光细胞团再生的植株中大部分为二倍体，可能有少量四倍体。

2）原生质体胞质杂种分子标记鉴定：具体方法参见文献（Cai XD,Fu J,Deng XX,Guo  WW.Production and molecular characterization of potential seedless cybrid plants between pollen  sterile Satsuma mandarin and two seedy Citrus cultivars.Plant Cell Tiss Org,2007,90:275-283）。 分别应用SSR、CAPS和cpSSR分子标记对获得的原生质体杂种核基因组、线粒体基因组进 行分析。

结果：SSR结果表明由无荧光细胞团再生的植株其核基因组来自叶肉亲本早金甜橙， CAPS结果表明其线粒体基因组来自愈伤组织亲本国庆1号温州蜜柑，cpSSR结果表明其叶 绿体基因组可能来自双亲之一或者同时具有双亲的叶绿体基因组。即所有再生植株均为胞质 杂种。

3）以PCR和Southern blot方法鉴定是否含有GFP基因；具体方法参见文献（范净.柑 橘转GFP、APl和LFY基因植株群体的分子鉴定与基因表达研究.[博士学位论文].武汉:华中 农业大学图书馆,2006）。

结果：所有由无荧光细胞团再生的植株将不含GFP基因。即再生植株100%去除了GFP 标记基因，实现对胞质杂种的安全筛选。