一种鉴别紫纹兜兰的核苷酸序列、分子探针和方法

摘要

本发明涉及一种鉴别紫纹兜兰的核苷酸序列、分子探针和方法。本发明鉴别紫纹兜兰的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。用于鉴别紫纹兜兰的核苷酸分子探针上游ZWF：如SEQIDNO.2所示；下游ZWR：如SEQIDNO.3所示。利用核苷酸分子探针ZWF/ZWR，通过常规PCR方法来鉴别紫纹兜兰。本发明样品用量少，仅需少量样品就可以完成整个操作；准确、灵敏度高，ZWF/ZWR为紫纹兜兰专一性分子探针，若为其他兜兰种类，为阴性反应；方法简单，采用PCR技术进行检测，时间短，半日即可完成。

说明书

技术领域

本发明属于利用分子生物学方法鉴别紫纹兜兰的技术领域，涉及一种鉴别紫纹兜兰的核苷酸序列、分子探针和方法。

背景技术

紫纹兜兰（Paphiopedilum purpuratum）是兰科（Orchidaceae）兜兰属（Paphiopedilum）的植物，主要分布于我国广东、广西、云南及香港等省区，越南也有分布。紫纹兜兰不仅花美，叶片也很靓丽，叶面有浅绿色和暗绿色相间的网格斑，具有很高的观赏价值，因而有“香港小姐”的雅称。近年来，由于人为过度采收、走私出境猖獗以及生境破坏严重等原因，野生紫纹兜兰的分布范围逐渐萎缩，数量急剧下降，野生资源已经到了灭绝的边缘，被《濒危野生动植物物种国际贸易公约》列为一级保护植物。因此，为了有效保护和寻找新的紫纹兜兰野生群体，建立快速、准确鉴别紫纹兜兰的方法是十分必要的。

随着分子生物学技术的快速发展，近年来，分子标记鉴定技术取得了快速发展，这也使植物快速鉴定成为可能。目标起始密码子多态（start codon targeted Polymorphism, SCoT）标记是一种基于翻译起始位点的目的基因标记新技术，根据ATG翻译起始位点侧翼保守序列来设计引物，扩增候选功能基因区域进而产生显性多态性标记，具有操作简单、重复性好等特点。本实验应用SCoT标记技术对兜兰属植物进行遗传多样性分析，获得了兜兰SCoT指纹图谱，从中筛选出了紫纹兜兰的特异性序列片段，通过克隆、测序等，设计开发了用于鉴定紫纹兜兰的特异性探针，对有效的鉴别和保护紫纹兜兰种质资源具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供了一种利用分子生物学手段，获得鉴别紫纹兜兰的核苷酸序列。

本发明用于鉴别紫纹兜兰的特征性核苷酸序列来源于SCoT通用引物19（5’-ACCATGGCTACCACCGGC-3’）扩增所得的紫纹兜兰特异性核苷酸序列，具体序列为：

ACCATGGCTACCACCGGCATGTTAAGTTCCTCTATAAATCCACCCTATTCTTTGGAAGATAGAGGGCCTAGTGAATTCATAGTCCCCATCAACTCACCTGGATGCCCCATAAATCTGCCTTCTTCCCTAAGAAGCTTTAGTGAATGATCAAGTCAAAATTAGTCGGCACCCCCAATGTCGGCCTGGGTAACATCCCCGTATCCCTGTAATTATTATTTTTGGCATGACTTCTATTCAAGTATGACGTACTACTTGCTTTCGCAATAATTTTATTTGTTTTTGCACTTTATGCATGGGGCACTATTCCAGTCCTAGTTTAATAATATAATTTGCAGCTATTTAAATCTTTGCAGAGACTCTTTGAAATTACTTAGTGTCATGAGAATAATTCCGAACAACTCAATGTATGGGAAACCCACTTAACCTACTCAATTGACACTCTTATCATCAGTCTTGCCCACGCACAACTGTGATAGCTGAGTTCAAACTAGAGCGGTCGAAGTTAGGGTCGGAATCATTTACCTTGTCCTATTCAATTATCTCTCAGCACACTGATGATTCCAAAGAGTAGCCCAGATATACGAAGCAAAATCATCAAGTTGCATAAAAAAGCTAACATAATTTATAATATTATGCTGTACAAATAAGTTCGACACCCCCATGGTCAGTATGAAGGCTGACAATCCCATGGTCAGTATAGCTGGCACCCCTATGGCCGGTGGTAGCCATGGT，如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供基于上述鉴别紫纹兜兰的核苷酸序列（SEQ ID NO.1）设计的用于鉴别紫纹兜兰的核苷酸分子探针（ZWF/ZWR），该核酸分子探针序列如下：

上游引物ZWF：5’-CCCATAAATCTGCCTTCT-3’，如SEQ ID NO.2所示；

下游引物ZWR：5’-GGGTGCCAGCTATACTGA-3’，如SEQ ID NO.3所示。

上述核苷酸分子探针（ZWF/ZWR），具有极高的专一性，仅与紫纹兜兰发生反应，而不与其他兜兰种类反应。利用该探针通过常规PCR扩增可以快速准确的对紫纹兜兰进行鉴别。

本发明的第三个目的是提供一种鉴别紫纹兜兰的方法。

本发明采用上述核酸分子探针（ZWF/ZWR）作为特异性扩增引物，以紫纹兜兰基因组DNA为模板，经过PCR扩增，电泳检测，可以获得清晰的紫纹兜兰特征性条带，实现对紫纹兜兰的鉴别。

本发明样品用量少，只需少量样品就可以完成整个操作；准确、灵敏度高，ZWF/ZWR为紫纹兜兰专一性分子探针，若为其他兜兰种类，为阴性反应；方法简单，采用PCR技术进行检测，时间较短，半日就可以完成。

附图说明

图1是本发明所述的紫纹兜兰的特征性核苷酸序列及对紫纹兜兰专一性核酸分子探针ZWF和ZWR的位置图，左侧为5’端，右侧为3’端，其中黑色部分为专一性核苷酸分子探针ZWF和ZWR扩增的序列片段大小及位置；

图2是采用SCoT引物19按照常规PCR方法对不同兜兰样品进行PCR反应后的电泳图（箭头所指的条带是紫纹兜兰特有的条带，分子量为732 bp），其中，1、麻栗坡兜兰（云南麻栗坡），2、麻栗坡兜兰（浙江杭州），3、杏黄兜兰（云南丽江），4、硬叶兜兰（云南文山），5、卷萼兜兰（广西南宁），6、亨利兜兰（云南麻栗坡），7、带叶兜兰（广西龙州），8、紫纹兜兰（广东广州），9、彩云兜兰（云南文山），M为DNA 分子量标准marker DL2000。

图3是利用本发明的核酸分子探针ZWF/ZWR对不同兜兰样品进行检测的PCR产物电泳图，1、麻栗坡兜兰（云南麻栗坡），2、麻栗坡兜兰（浙江杭州），3、杏黄兜兰（云南丽江），4、硬叶兜兰（云南文山），5、卷萼兜兰（广西南宁），6、亨利兜兰（云南麻栗坡），7、带叶兜兰（广西龙州），8、紫纹兜兰（广东广州），9、彩云兜兰（云南文山），M为DNA 分子量标准marker DL2000。

具体实施方式

本发明可以从分子水平上较为客观准确的鉴别紫纹兜兰，通过以下实施例对本发明做进一步说明：

实施例 1：紫纹兜兰特征性核苷酸序列的制备

1. 基因组DNA的提取

剪取-80℃保存的兜兰叶片0.2 g 放入研钵中，立即加入液氮研磨至粉末，然后使用上海生工生物工程有限公司的UNIQ-10柱式植物基因组DNA抽提试剂盒提取兜兰属植物基因组DNA，用1%琼脂糖胶对所得DNA 进行电泳检测，并用紫外分光光度计检测DNA 浓度，稀释至50ng/μl。

2. SCoT–PCR反应，电泳检测

利用SCoT通用引物19（5’-ACCATGGCTACCACCGGC-3’）进行PCR反应，引物由上海生工生物工程有限公司合成，反应体系为：2μl 10×Buffer，2μl MgCl₂ (25mM)，0.8μl dNTPs (10mM)，1μl SCoT引物19 (10μM)，1μl模板DNA (50ng/μl)，0.5μl Taq酶(2U/μl)，12.7μl ddH₂O。总体积为20μl。

 PCR反应程序为：94℃预变性4 min；35个循环（94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸2 min）；最后于72℃下延伸10 min。

PCR产物电泳结果见图2，箭头标的条带（分子量为732 bp），是采用SCoT引物19 进行PCR扩增时筛选出的紫纹兜兰特征性条带。如图2(图中，通道1～9为来自9份不同兜兰样品，具体见附图说明；通道M为DNA 分子量标准marker DL2000)所示，仅紫纹兜兰（通道8）在分子量732 bp位置有条带出现，而其他兜兰种类在分子量732 bp位置没有条带出现。因此，此条带为紫纹兜兰的特有条带。

3. 序列测定

利用SCoT通用引物19进行PCR扩增结束后，PCR产物用1.5﹪琼脂糖凝胶电泳，对只在紫纹兜兰中出现的特异SCoT片段（图2中箭头所指片段）进行切胶，采用PCR产物纯化试剂盒（上海生工）回收纯化所切片段。然后将所纯化的DNA片段连接到PUCm-T载体（上海生工）上，转化到大肠杆菌感受态细胞中，然后送生物公司测序（上海生工），得到如SEQ ID NO.1所示的核苷酸组成和排列。

实施例2：紫纹兜兰特异性核苷酸分子探针ZWF/ZWR的制备，PCR反应，电泳检测

在获得紫纹兜兰特异性核苷酸序列的基础上，利用Primer Primer 5.0 软件设计得出ZWF/ZWR的核苷酸序列（分别为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的），引物由上海生工生物工程有限公司合成。然后利用设计合成的引物ZWF/ZWR，对9份不同兜兰样品（具体见附图说明）进行扩增检测。

PCR反应体系为2μl 10×Buffer，2μl MgCl₂ (25mM)，0.8μl dNTPs (10mM)，1μl引物ZWF (10μM)，1μl引物ZWR(10μM)，1μl模板DNA(50ng/μl)，0.5μl Taq酶(2U/μl)，11.7μl ddH₂O。总体积为20μl。

PCR反应程序为94℃预变性4 min；35个循环（94℃变性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸2 min）；最后于72℃下延伸10 min。

用1.5﹪琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，电泳图如图3所示，从图3(图中，通道1～9为来自9份不同的兜兰样品，具体见附图说明；通道M为DNA 分子量标准marker DL2000)可以看出，仅紫纹兜兰（通道8）能扩增出特异性片段，而其他兜兰种类没有扩增出任何条带，这表明本发明的核酸分子探针具有极高的专一性，因此可以用于快速的鉴别紫纹兜兰。将紫纹兜兰的特异性片段送去测序，其序列如SEQ ID NO.1 的106～709位碱基所示，其长度为604 bp，具体序列信息见图1。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  杭州师范大学

 

<120>  一种鉴别紫纹兜兰的核苷酸序列、分子探针和方法

 

<130>  1

 

<160>  3    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  732

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  1

accatggcta ccaccggcat gttaagttcc tctataaatc caccctattc tttggaagat     60

 

agagggccta gtgaattcat agtccccatc aactcacctg gatgccccat aaatctgcct    120

 

tcttccctaa gaagctttag tgaatgatca agtcaaaatt agtcggcacc cccaatgtcg    180

 

gcctgggtaa catccccgta tccctgtaat tattattttt ggcatgactt ctattcaagt    240

 

atgacgtact acttgctttc gcaataattt tatttgtttt tgcactttat gcatggggca    300

 

ctattccagt cctagtttaa taatataatt tgcagctatt taaatctttg cagagactct    360

 

ttgaaattac ttagtgtcat gagaataatt ccgaacaact caatgtatgg gaaacccact    420

 

taacctactc aattgacact cttatcatca gtcttgccca cgcacaactg tgatagctga    480

 

gttcaaacta gagcggtcga agttagggtc ggaatcattt accttgtcct attcaattat    540

 

ctctcagcac actgatgatt ccaaagagta gcccagatat acgaagcaaa atcatcaagt    600

 

tgcataaaaa agctaacata atttataata ttatgctgta caaataagtt cgacaccccc    660

 

atggtcagta tgaaggctga caatcccatg gtcagtatag ctggcacccc tatggccggt    720

 

ggtagccatg gt                                                        732

 

 

<210>  2

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  2

cccataaatc tgccttct                                                   18

 

 

<210>  3

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  3

gggtgccagc tatactga                                                   18