治疗黑素瘤的方法及治疗剂组合

摘要

本发明提供抗ETBR抗体和MAP激酶抑制剂的治疗剂组合及使用该治疗剂组合来治疗黑素瘤的方法。

说明书

相关申请

本申请依据35 USC 119(e)要求2011年10月28日提交的美国临时申请No.61/552,893和2012年8月2日提交的美国临时申请No.61/678,978的权益，通过述及将其内容收入本文。

发明领域

一般而言，本发明涉及通过使用某些抗体和小分子药物组合来治疗黑素瘤。

发明背景

黑素瘤是一种攻击性形式的皮肤癌，最近其发病率发生了令人担忧的升高(Thompson JF et al.,Cutaneous melanoma in the era of molecular profiling.Lancet 2009；374:362-5)。虽然凭借手术切除局部化损害能实现痊愈，但是晚期阶段的黑素瘤对当前批准的疗法只有较差的响应。IV期转移性黑素瘤的5年存活率为大约10％(Thompson,Lancet 2009)。新治疗办法(包括针对Bcl2的反义，针对CTLA4的抗体，小分子RAF激酶抑制剂，和过继性免疫疗法)当前处于针对转移性黑素瘤的临床测试(Ascierto PA et al.,Melanoma:amodel for testing new agents in combination therapies.J Transl Med2010；8:38-45)。来自一些这些最新研究的结果看来是令人鼓舞的，但是对总体存活的持久影响可能需要包括别的新药剂的治疗剂组合。

然而，认识到黑素瘤会展现分子变异，例如在细胞对生长因子的响应性所必需的某些信号转导途径中。因此，不是作为单一疾病治疗黑素瘤，而是已经做出尝试将其分层为多种分子亚型从而用最适宜的疗法治疗每种亚型。

黑素瘤的一种亚型包含MAP激酶途径中的异常。MAPK途径是一种磷酸化驱动的信号转导级联，其偶联细胞内应答与生长因子对细胞表面受体的结合。此途径调节数个过程，包括细胞增殖和分化，而且在多种癌症中常常失调(Sebolt-Leopold JS,Herrera R.Targeting the mitogen-activated protein kinasecascade to treat cancer.Nat Rev Cancer.2004；4:937-947)。经典MAPK途径由RAS，RAF，MEK和ERK组成，其中RAS触发RAF/MEK/ERK激酶复合物形成，然后该复合物经由蛋白质磷酸化驱动关键调节物的转录。用靶向该途径中的关键蛋白的药剂抑制MAPK信号传导有潜力在多种肿瘤类型中抑制生长(Wong K-K et al.,Recent developments in anti-cancer agents targeting theRas/Raf/MEK/ERK pathway.Recent Pat Anticancer Drug Discov.2009；4:28-35)。

对MEK/ERK途径的不当激活在外源生长因子缺失下促进细胞生长。GDC-0973(也称作XL518)是一种针对MEK1/2(一种活化ERK1/2的MAPK激酶)的有力的且高度选择性的小分子抑制剂(Johnston S.XL518,a potent,selective,orally bioavailable MEK1inhibitor,downregulates theRas/Raf/MEK/ERK pathway in vivo,resulting in tumor growth inhibition andregression in preclinical models.Presented at:AACR-NCI-EORTC Symposiumon Molecular Targets and Cancer Therapeutics；October 22,2007；San Francisco,CA.Abstract C209)。结果是，自细胞表面(Ras和Raf)至ERK的致癌信号中断。对ERK活化的持久抑制转化成降低增殖和诱导凋亡。在多项临床前研究中，GDC-0973显示出抑制细胞生长和诱导肿瘤消退。

最近，Vemurafenib(也称作，它是一种B-Raf酶抑制剂)得到美国食品药品管理局批准用于治疗晚期黑素瘤。Vemurafenib显示出在黑素瘤细胞系中引起程序性细胞死亡(Sala E,et al.,BRAF silencing by short hairpinRNA or chemical blockade by PLX4032 leads to different responses in melanomaand thyroid carcinoma cells.Mol.Cancer Res.6(5):751-9(May2008))。如果B-Raf具有常见的V600E突变的话，Vemurafenib中断B-Raf/MEK/ERK途径上的B-Raf/MEK步骤。Vemurafenib在其癌症具有V600E BRAF突变(就是说，在B-RAF蛋白上的氨基酸位置编号600，正常的缬氨酸被谷氨酸替换)的黑素瘤患者中是有效的。约60％的黑素瘤具有V600E BRAF突变。没有这种突变的黑素瘤细胞没有表现出受Vemurafenib抑制；矛盾的是，它刺激正常BRAF且可促进肿瘤生长(Hatzivassiliou G et al.,RAF inhibitors prime wild-type RAFto activate the MAPK pathway and enhance growth.Nature 464(7287):431-5；Halaban R et al.,PLX4032,a Selective BRAF(V600E)Kinase Inhibitor,Activatesthe ERK Pathway and Enhances Cell Migration and Proliferation of BRAF(WT)Melanoma Cells.Pigment Cell Melanoma Res 23(2):190-200(February2010))。虽然临床试验揭示与DTIC相比用Vemurafenib治疗的患者中改善的存活，改善的客观响应率，和改善的无进展存活，但是疾病很可能再发(Nazarian R.etal.,Melanomas acquire resistance to B-RAF(V600E)inhibition by RTK or N-RASupregulation.Nature Vol:468,Pages:973-977(16 December 2010))。

尽管黑素瘤癌症疗法有进展，仍然极大地需要别的能够有效抑制赘生性细胞生长的治疗性处理。因而，本发明的一个目标是鉴定治疗剂组合以生成可用于黑素瘤癌症治疗性处理的组合物。

发明概述

本发明涵盖一种在罹患黑素瘤的受试者中进行肿瘤生长抑制(TGI)的方法，其包括与有效量的MAP激酶抑制剂组合对该受试者施用有效量的抗内皮缩血管肽B受体(ETBR)抗体药物缀合物。

一方面，抗ETBR抗体药物缀合物和MAP激酶抑制剂的组合是协同性的。另一方面，关于协同性组合，该TGI多于单独使用抗ETBR抗体药物缀合物看到的TGI或多于单独使用MAP激酶抑制剂看到的TGI。还有又一方面，关于协同性组合，该TGI比单独使用抗ETBR抗体药物缀合物多约10％，或多约15％，或多约20％，或多约25％，或多约30％，或多约35％，或多约40％，或多约45％，或多约50％，或多约55％，或多约60％，或多约65％，或多约70％或该TGI比单独使用MAP激酶抑制剂多约10％，或多约15％，或多约20％，或多约25％，或多约30％，或多约35％，或多约40％，或多约45％，或多约50％，或多约55％，或多约60％，或多约65％，或多约70％。

在上文描述的发明的另一方面，该抗ETBR抗体特异性结合由SEQ IDNO:10的氨基酸编号64至101组成的ETBR表位。在要求保护的方法的还有另一方面，该抗ETBR抗体具有三个可变重链CDR和三个可变轻链CDR，其中VH CDR1为SEQ ID NO:1，VH CDR2为SEQ ID NO:2，VH CDR3为SEQ IDNO:3且其中VL CDR1为SEQ ID NO:4，VL CDR2为SEQ ID NO:5，VL CDR3为SEQ ID NO:6。在要求保护的方法的仍有另一方面，该抗ETBR抗体具有可变重链和可变轻链，其中所述VH为SEQ ID NO:7或9。这种方法的又一方面还包括一种抗ETBR抗体，该抗ETBR抗体还具有VL，该VL为SEQ ID NO:8。

在上文描述的要求保护的方法的一方面，该抗ETBR抗体是缀合至细胞毒素的，其中所述细胞毒素为选自下组的细胞毒剂：毒素，抗生素，放射性同位素和溶核酶，且其中所述细胞毒素为毒素。在要求保护的发明的另一方面，该毒素选自下组：美登木素生物碱类(maytansinoid)，加利车霉素(calicheamicin)和auristatin。在本发明的还有另一方面，该毒素为美登木素生物碱类。

在上文描述的要求保护的方法的一方面，该MAP激酶抑制剂为BRAF抑制剂。在上文描述的要求保护的方法的还有另一方面，该BRAF抑制剂为丙烷-1-磺酸{3-[5-(4-氯苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基]-2,4-二氟-苯基}-酰胺(propane-1-sulfonic acid{3-[5-(4-chlorophenyl)-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridine-3-carbonyl]-2,4-difluoro-phenyl}-amide)。另一方面，该BRAF抑制剂具有下述化学结构：

在上文描述的要求保护的方法的另一方面，该MAP激酶抑制剂为MEK抑制剂。在上文描述的要求保护的方法的还有另一方面，该MEK抑制剂为(S)-(3,4-二氟-2-((2-氟-4-碘苯基)氨基)苯基)(3-羟基-3-(哌啶-2-基)吖丁啶-1-基)甲酮((S)-(3,4-difuoro-2-((2-fluoro-4-iodophenyl)amino)phenyl)(3-hydoxy-3-(piperidin-2yl)azetidin-1-yl)methanone)。在上文描述的要求保护的方法的仍有另一方面，该MEK抑制剂具有下述化学结构：

在本发明的一方面，涵盖的是，描述了一种治疗黑素瘤的方法，其包括对有需要的受试者施用治疗有效量的MAP激酶抑制剂和抗ETBR抗体。在上文描述的要求保护的方法的另一方面，所述黑素瘤是ETBR阳性的。在要求保护的方法的还有另一方面，所述黑素瘤是转移性的。在要求保护的方法的仍有又一方面，所述受试者没有MAP激酶抑制剂的在先疗法。在要求保护的方法的还有又一方面，所述受试者具有V600E BRAF基因突变或所述受试者是BRAF野生型的，没有V600E BRAF突变。在要求保护的方法的仍有又一方面，该受试者没有MAP激酶抑制剂的在先疗法。

在上文描述的要求保护的方法的另一方面，抗ETBR抗体和MAP激酶抑制剂的组合是协同性的。另一方面，关于协同性组合，该TGI多于单独使用抗ETBR抗体看到的TGI或多于单独使用MAP激酶抑制剂看到的TGI。还有又一方面，关于协同性组合，该TGI比单独使用抗ETBR抗体多约10％，或多约15％，或多约20％，或多约25％，或多约30％，或多约35％，或多约40％，或多约45％，或多约50％，或多约55％，或多约60％，或多约65％，或多约70％或该TGI比单独使用MAP激酶抑制剂多约10％，或多约15％，或多约20％，或多约25％，或多约30％，或多约35％，或多约40％，或多约45％，或多约50％，或多约55％，或多约60％，或多约65％，或多约70％。

在上文描述的发明的另一方面，该抗ETBR抗体特异性结合由SEQ IDNO:10的氨基酸编号64至101组成的ETBR表位。在要求保护的方法的还有另一方面，该抗ETBR抗体具有三个可变重链CDR和三个可变轻链CDR，其中VH CDR1为SEQ ID NO:1，VH CDR2为SEQ ID NO:2，VH CDR3为SEQ IDNO:3且其中VL CDR1为SEQ ID NO:4，VL CDR2为SEQ ID NO:5，VL CDR3为SEQ ID NO:6。在要求保护的方法的仍有另一方面，该抗ETBR抗体具有可变重链和可变轻链，其中所述VH为SEQ ID NO:7或9。这种方法的又一方面还包括一种抗ETBR抗体，该抗ETBR抗体还具有VL，该VL为SEQ ID NO:8。

在上文描述的要求保护的方法的一方面，该抗ETBR抗体是缀合至细胞毒素的，其中所述细胞毒素为选自下组的细胞毒剂：毒素，抗生素，放射性同位素和溶核酶，且其中所述细胞毒素为毒素。在要求保护的发明的另一方面，该毒素选自下组：美登木素生物碱类，加利车霉素和auristatin。在本发明的还有另一方面，该毒素为美登木素生物碱类。

在上文描述的要求保护的方法的一方面，该MAP激酶抑制剂为BRAF抑制剂。在上文描述的方法的还有另一方面，该BRAF抑制剂为丙烷-1-磺酸{3-[5-(4-氯苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基]-2,4-二氟-苯基}-酰胺。另一方面，该BRAF抑制剂具有下述化学结构：

在上文描述的要求保护的方法的另一方面，该MAP激酶抑制剂为MEK抑制剂。在上文描述的要求保护的方法的还有另一方面，该MEK抑制剂为(S)-(3,4-二氟-2-((2-氟-4-碘苯基)氨基)苯基)(3-羟基-3-(哌啶-2-基)吖丁啶-1-基)甲酮。在上文描述的要求保护的方法的仍有另一方面，该MEK抑制剂具有下述化学结构：

在本发明的一方面，涵盖的是，描述了一种治疗黑素瘤的方法，其包括对有需要的受试者施用治疗有效量的MAP激酶抑制剂和抗ETBR抗体药物缀合物，其中首先将该MAP激酶抑制剂施用于所述有需要的受试者。在本发明的另一方面，在施用所述MAP激酶抑制剂之后施用所述抗ETBR抗体药物缀合物。或者，本发明涵盖的方法包括同时施用该抗ETBR抗体和该MAP激酶抑制剂。

在本发明的一方面，涵盖的是，描述了一种治疗黑素瘤的方法，其包括对有需要的受试者施用治疗有效量的MAP激酶抑制剂和抗ETBR抗体药物缀合物，其中序贯施用该抗ETBR抗体药物缀合物和该MAP激酶抑制剂，其中首先将该抗ETBR抗体药物缀合物施用于该受试者并在施用该抗ETBR抗体药物缀合物之后将该MAP激酶抑制剂施用于该受试者。

在本发明的一方面，涵盖的是，描述了一种治疗黑素瘤的方法，其包括对有需要的受试者施用治疗有效量的MAP激酶抑制剂和抗ETBR抗体药物缀合物，其中首先将该MAP激酶抑制剂施用于该受试者并在施用该MAP激酶抑制剂之后将该抗ETBR抗体药物缀合物施用于该受试者。

在上述本发明涵盖的方面之外，进一步涵盖的是，描述了一种治疗黑素瘤的方法，其包括对有需要的受试者施用治疗有效量的MAP激酶抑制剂和抗ETBR抗体药物缀合物，其中静脉内施用所述抗ETBR抗体药物缀合物。还涵盖的是，该抗ETBR抗体药物缀合物在本发明要求保护的方法中以约0.1mpk，或约0.2mpk，或约0.3mpk，或约0.5mpk，或约1mpk，或约5mpk，或约10mpk，或约15mpk，或约20mpk，或约25mpk，或约30mpk剂量给药。

在上述本发明涵盖的方面之外，进一步涵盖的是，描述了一种治疗黑素瘤的方法，其包括对有需要的受试者施用治疗有效量的MAP激酶抑制剂和抗ETBR抗体药物缀合物，其中口服施用该MAP激酶抑制剂。还涵盖的是，该BRAF抑制剂在本发明要求保护的方法中以约1mpk，或约2mpk，或约3mpk，或约4mpk，或约5mpk，或约6mpk，或约7mpk，或约8mpk，或约9mpk，或约10mpk，或约11mpk，或约12mpk，或约15mpk，或约20mpk或约30mpk剂量给药。

在本发明的一方面，涵盖用于在罹患黑素瘤的受试者中进行TGI的制品，其包括包含抗ETBR抗体药物缀合物组合物和MAP激酶抑制剂组合物的包装。进一步涵盖的是，所述抗ETBR抗体药物缀合物特异性结合由SEQ IDNO:10的氨基酸编号64至101组成的ETBR表位。或者，还涵盖的是，所述抗ETBR抗体具有三个可变重链CDR和三个可变轻链CDR，其中VH CDR1为SEQ ID NO:1，VH CDR2为SEQ ID NO:2，VH CDR3为SEQ ID NO:3且其中VL CDR1为SEQ ID NO:4，VL CDR2为SEQ ID NO:5，VL CDR3为SEQ IDNO:6。涵盖的又一备选方案是，抗ETBR抗体具有可变重链和可变轻链，其中所述VH为SEQ ID NO:7或9。在还有另一备选方案中，抗ETBR抗体具有可变重链和可变轻链，其中所述VH为SEQ ID NO:7或9且该VL为SEQ ID NO:8。在制品的另一方面，该抗ETBR抗体是缀合至细胞毒素的，其中所述细胞毒素为选自下组的细胞毒剂：毒素，抗生素，放射性同位素和溶核酶。在又一方面，该细胞毒素为毒素，其中所述毒素选自下组：美登木素生物碱类，加利车霉素和auristatin。一方面，该毒素为美登木素生物碱类。

在上文描述的治疗黑素瘤的方法的一方面，还涵盖的是，该MAP激酶抑制剂为BRAF抑制剂。在上文描述的方法的还有另一方面，该BRAF抑制剂为丙烷-1-磺酸{3-[5-(4-氯苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基]-2,4-二氟-苯基}-酰胺。进一步地，涵盖的是，该BRAF抑制剂具有下述化学结构：

在上文描述的要求保护的方法的另一方面，该MAP激酶抑制剂为MEK抑制剂。在上文描述的要求保护的方法的还有另一方面，该MEK抑制剂为(S)-(3,4-二氟-2-((2-氟-4-碘苯基)氨基)苯基)(3-羟基-3-(哌啶-2-基)吖丁啶-1-基)甲酮。在上文描述的要求保护的方法的仍有另一方面，该MEK抑制剂具有下述化学结构：

在本发明的一方面，涵盖用于在受试者中治疗黑素瘤的制品，其包括包含抗ETBR抗体药物缀合物组合物和MAP激酶抑制剂组合物的包装。进一步涵盖的是，所述抗ETBR抗体特异性结合由SEQ ID NO:10的氨基酸编号64至101组成的ETBR表位。或者，还涵盖的是，所述抗ETBR抗体具有三个可变重链CDR和三个可变轻链CDR，其中VH CDR1为SEQ ID NO:1，VH CDR2为SEQ ID NO:2，VH CDR3为SEQ ID NO:3且其中VL CDR1为SEQ ID NO:4，VL CDR2为SEQ ID NO:5，VL CDR3为SEQ ID NO:6。涵盖的又一备选方案是，抗ETBR抗体具有可变重链和可变轻链，其中所述VH为SEQ ID NO:7或9。在还有另一备选方案中，抗ETBR抗体具有可变重链和可变轻链，其中所述VH为SEQ ID NO:7或9且该VL为SEQ ID NO:8。在制品的另一方面，该抗ETBR抗体是缀合至细胞毒素的，其中所述细胞毒素为选自下组的细胞毒剂：毒素，抗生素，放射性同位素和溶核酶。在又一方面，该细胞毒素为毒素，其中所述毒素选自下组：美登木素生物碱类，加利车霉素和auristatin。一方面，该毒素为美登木素生物碱类。

在上文描述的制品的一方面，还涵盖的是，该MAP激酶抑制剂为BRAF抑制剂。在上文描述的制品的还有另一方面，该BRAF抑制剂为丙烷-1-磺酸{3-[5-(4-氯苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基]-2,4-二氟-苯基}-酰胺。进一步地，涵盖的是，该BRAF抑制剂具有下述化学结构：

在上文描述的制品的另一方面，该MAP激酶抑制剂为MEK抑制剂。在上文描述的制品的还有另一方面，该MEK抑制剂为(S)-(3,4-二氟-2-((2-氟-4-碘苯基)氨基)苯基)(3-羟基-3-(哌啶-2-基)吖丁啶-1-基)甲酮。在上文描述的制品的仍有另一方面，该MEK抑制剂具有下述化学结构：

涵盖的是，本发明的一方面是抗ETBR抗体药物缀合物和MAP激酶抑制剂在制备用于黑素瘤TGI的药物中的用途。进一步涵盖的是，所述抗ETBR抗体特异性结合由SEQ ID NO:10的氨基酸编号64至101组成的ETBR表位。或者，还涵盖的是，所述抗ETBR抗体具有三个可变重链CDR和三个可变轻链CDR，其中VH CDR1为SEQ ID NO:1，VH CDR2为SEQ ID NO:2，VH CDR3为SEQ ID NO:3且其中VL CDR1为SEQ ID NO:4，VL CDR2为SEQ ID NO:5，VL CDR3为SEQ ID NO:6。涵盖的又一备选方案是，抗ETBR抗体具有可变重链和可变轻链，其中所述VH为SEQ ID NO:7或9。在还有另一备选方案中，抗ETBR抗体具有可变重链和可变轻链，其中所述VH为SEQ ID NO:7或9且该VL为SEQ ID NO:8。在制品的另一方面，该抗ETBR抗体是缀合至细胞毒素的，其中所述细胞毒素为选自下组的细胞毒剂：毒素，抗生素，放射性同位素和溶核酶。在又一方面，该细胞毒素为毒素，其中所述毒素选自下组：美登木素生物碱类，加利车霉素和auristatin。一方面，该毒素为美登木素生物碱类。

在上文描述的药物的用途的一方面，还涵盖的是，该MAP激酶抑制剂为BRAF抑制剂。在上文描述的药物的用途的还有另一方面，该BRAF抑制剂为丙烷-1-磺酸{3-[5-(4-氯苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基]-2,4-二氟-苯基}-酰胺。进一步地，涵盖的是该BRAF抑制剂具有下述化学结构：

在上文描述的药物的用途的另一方面，该MAP激酶抑制剂为MEK抑制剂。在上文描述的药物的用途的还有另一方面，该MEK抑制剂为(S)-(3,4-二氟-2-((2-氟-4-碘苯基)氨基)苯基)(3-羟基-3-(哌啶-2-基)吖丁啶-1-基)甲酮。在上文描述的药物的用途的仍有另一方面，该MEK抑制剂具有下述化学结构：

涵盖的是，本发明的一方面是包含抗ETBR抗体药物缀合物组合物和MAP激酶抑制剂组合物的制品在制备用于黑素瘤TGI的药物中的用途。进一步涵盖的是，所述抗ETBR抗体特异性结合由SEQ ID NO:10的氨基酸编号64至101组成的ETBR表位。或者，还涵盖的是，所述抗ETBR抗体具有三个可变重链CDR和三个可变轻链CDR，其中VH CDR1为SEQ ID NO:1，VH CDR2为SEQ ID NO:2，VH CDR3为SEQ ID NO:3且其中VL CDR1为SEQ ID NO:4，VL CDR2为SEQ ID NO:5，VL CDR3为SEQ ID NO:6。涵盖的又一备选方案是，抗ETBR抗体具有可变重链和可变轻链，其中所述VH为SEQ ID NO:7或9。在还有另一备选方案中，抗ETBR抗体具有可变重链和可变轻链，其中所述VH为SEQ ID NO:7或9且该VL为SEQ ID NO:8。在制品的用途的另一方面，该抗ETBR抗体是缀合至细胞毒素的，其中所述细胞毒素为选自下组的细胞毒剂：毒素，抗生素，放射性同位素和溶核酶。在又一方面，该细胞毒素为毒素，其中所述毒素选自下组：美登木素生物碱类，加利车霉素和auristatin。一方面，该毒素为美登木素生物碱类。

在上文描述的制品的用途的一方面，还涵盖的是，该MAP激酶抑制剂为BRAF抑制剂。在上文描述的制品的用途的还有另一方面，该BRAF抑制剂为丙烷-1-磺酸{3-[5-(4-氯苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基]-2,4-二氟-苯基}-酰胺。进一步地，涵盖的是该BRAF抑制剂具有下述化学结构：

在上文描述的制品的用途的另一方面，该MAP激酶抑制剂为MEK抑制剂。在上文描述的制品的用途的还有另一方面，该MEK抑制剂为(S)-(3,4-二氟-2-((2-氟-4-碘苯基)氨基)苯基)(3-羟基-3-(哌啶-2-基)吖丁啶-1-基)甲酮。在上文描述的制品的用途的仍有另一方面，该MEK抑制剂具有下述化学结构：

附图简述

图1是MAP激酶途径的示意图。

图2展示在体外受体水平与ADC细胞杀伤的关系。所示受体拷贝数/细胞是通过Scatchard分析估算的。小图A和小图B分别显示通过抗ET_BR>BR>

图3显示异种移植物小鼠模型中抗ETBR ADC的体内功效。在接种UACC-257X2.2(小图A)或A2058(小图B)细胞的小鼠中建立皮下肿瘤。当肿瘤体积达到大约200mm³时(第0天)，给予动物单次IV注射所示剂量的对照ADC(对照-vc-MMAE)或抗ETBR>

图4显示用不同浓度的BRAFi-945处理24小时的UACC-257X2.2黑素瘤细胞中的ET_BR表达。小图A显示对RPL19转录物标准化的ETBR转录物。小图B显示50μg全细胞裂解物中总ETBR和GAPDH(对照)蛋白的表达。小图C显示活细胞中的表面ETBR蛋白表达，如通过流式细胞术看到的，其中第一个峰指示单独用第二检测试剂处理的细胞，中间的峰指示未用BRAF抑制剂处理的细胞，而最后一个峰指示用BRAF抑制剂处理的细胞。

图5显示不同剂量的抗ET_BR>3时(第0天)，每天一次给动物口服给药BRAFi-945或媒介对照，持续21天。第1天(在两剂BRAFi-945之后)，给予动物单次IV注射媒介或所示剂量的抗ET_BR>BR-ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)组合；小图B显示1mpk>BR-ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)组合；小图C显示6mpk>BR-ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)组合；小图D显示6mpk>BR-ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)组合；而小图E显示20mpkBRAFi-945和3mpk抗ET_BR-ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)组合。

图6显示用不同浓度的BRAF抑制剂RG7204处理24小时的COLO 829黑素瘤细胞中的ETBR表达。小图A显示对RPL19转录物标准化的ETBR转录物。小图B显示50μg全细胞裂解物中总ETBR和GAPDH(对照)蛋白的表达。小图C显示活细胞中的表面ETBR蛋白表达，如通过流式细胞术看到的，其中第一个峰指示单独用第二检测试剂处理的细胞，第二个峰指示未用BRAF抑制剂处理的细胞，而第三个峰指示用BRAF抑制剂处理的细胞。

图7展示抗ET_BR>3时(第0天)，每天两次给动物口服给药RG7204，持续21天。第1天(在三剂RG7204之后)，给予动物单次IV注射媒介或所示剂量的抗ET_BR>BR-ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)与30mpk>BR-ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)与30mpk>BR-ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)与10mpk>BR-ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)与10mpk>

图8显示用不同浓度的BRAF抑制剂RG7204处理24小时的A2058黑素瘤细胞中的ETBR表达。小图A显示对RPL19转录物标准化的ETBR转录物；小图B显示100μg全细胞裂解物中总ETBR和GAPDH(对照)蛋白的表达；而小图C显示活细胞中的表面ETBR蛋白表达，如通过流式细胞术看到的。第一个峰指示单独用第二检测试剂处理的细胞，第二个峰指示未用BRAF抑制剂处理的细胞，而第三个峰指示用BRAF抑制剂处理的细胞。

图9展示抗ET_BR>3时(第0天)，每天两次给动物口服给药RG7204，持续21天。第1天(在三剂RG7204之后)，给予动物单次IV注射媒介或所示剂量的抗ET_BR>BR-ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)与10mpkRG7204组合；小图B显示6mpk抗ET_BR-ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)与30mpkRG7204组合；小图C显示3mpk抗ET_BR-ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)与10mpkRG7204组合；而小图D显示3mpk抗ET_BR-ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)与30mpk>

图10显示用BRAFi RG7204实施的Western印迹实验，显示25至100μg来自IPC-298黑素瘤细胞的全细胞裂解物中总ETBR，Perk和erk蛋白和对照蛋白GAPDH和β-微管蛋白的表达。

图11显示与0.1μM，1μM和10μM BRAFi RG7204(分别为小图A，B和C)一起温育后IPC-298活细胞中的表面ETBR蛋白表达，如通过流式细胞术看到的。第一个峰指示单独用第二检测试剂处理的细胞，第二个峰指示用BRAF抑制剂处理的细胞，而第三个峰指示未用BRAF抑制剂处理的细胞。

图12显示用0μM，0.01μM，0.1μM和1μM浓度的MEKi-623(小图A)和MEKi-973(小图B)实施的Western印迹实验，显示50μg来自COLO829黑素瘤细胞的全细胞裂解物中总ETBR，Perk和erk蛋白和对照蛋白GAPDH和β-微管蛋白的表达。

图13显示与0.01μM(小图A和D)，0.1μM(小图B和E)和1μM(小图C和F)MEKi-623(分别为小图A，B和C)或MEKi-973(分别为小图D，E和F)一起温育后COLO829活细胞中的表面ETBR蛋白表达，如通过流式细胞术看到的。第一个峰指示单独用第二检测试剂处理的细胞，第二个峰指示未用MEK抑制剂处理的细胞，而第三个峰指示用MEK抑制剂处理的细胞。

图14显示用不同浓度的MEKi-623(小图A)或MEKi-973(小图B)处理24小时的A2058黑素瘤细胞中的ETBR mRNA表达，对RPL19转录物标准化。

图15显示用0μM，0.01μM，0.1μM和1μM浓度的MEKi-623(小图A)和MEKi-973(小图B)实施的Western印迹实验，显示50-100μg来自A2058黑素瘤细胞的全细胞裂解物中总ETBR，Perk和erk蛋白和对照蛋白GAPDH和β-微管蛋白的表达。

图16显示与0.01μM(小图A和D)，0.1μM(小图B和E)和1μM(小图C和F)MEKi-623(分别为小图A，B和C)或MEKi-973(分别为小图D，E和F)一起温育后A2058活细胞中的表面ETBR蛋白表达，如通过流式细胞术看到的。第一个峰指示单独用第二检测试剂处理的细胞，第二个峰指示未用MEK抑制剂处理的细胞，而第三个峰指示用MEK抑制剂处理的细胞。

图17展示抗ET_BR>3时(第0天)，每天一次给动物口服给药MEKi-973，持续21天。第1天(在两剂MEKi-973之后)，给予动物单次IV注射媒介或所示剂量的抗ET_BR>BR-ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)与7.5mpk>BR-ADC比较。

图18显示用不同浓度的MEKi-623(小图A)或MEKi-973(小图B)处理24小时的SK23-MEL黑素瘤细胞中的ET_BR转录物表达，对RPL19转录物标准化。

图19显示用0μM，0.01μM，0.1μM和1μM浓度的MEKi-623(小图A)和MEKi-973(小图B)实施的Western印迹实验，显示50μg来自SK23-MEL黑素瘤细胞的总细胞裂解物中总ETBR，Perk和erk蛋白和对照蛋白GAPDH和β-微管蛋白的表达。

图20显示与0.01μM(小图A和D)，0.1μM(小图B和E)和1μM(小图C和F)MEKi-623(分别为小图A，B和C)或MEKi-973(分别为小图D，E和F)一起温育后活SK23-MEL细胞中的表面ETBR蛋白表达，如通过流式细胞术看到的。第一个峰指示单独用第二检测试剂处理的细胞，第二个峰指示未用MEK抑制剂处理的细胞，而第三个峰指示用MEK抑制剂处理的细胞。

图21展示抗ET_BR>BR-ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)与7.5mpk>BR-ADC比较。小图C显示3mpk抗ET_BR-ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)与3mpk>BR-ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)或3mpk>BR-ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)与7.5mpk>BR-ADC比较。小图E显示6mpk抗ET_BR-ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)与3mpk>BR-ADC比较。

图22显示用0μM，0.01μM，0.1μM和1μM浓度的MEKi-623(小图A)和MEKi-973(小图B)实施的Western印迹实验，显示25-100μg来自IPC-298黑素瘤细胞的全细胞裂解物中总ETBR，Perk和erk蛋白和对照蛋白GAPDH和β-微管蛋白的表达。

图23显示与0.01μM(小图A和D)，0.1μM(小图B和E)和1μM(小图C和F)MEKi-623(分别为小图A，B和C)或MEKi-973(分别为小图D，E和F)一起温育后活IPC-298细胞中的表面ETBR蛋白表达，如通过流式细胞术看到的。第一个峰指示单独用第二检测试剂处理的细胞，第二个峰指示未用MEK抑制剂处理的细胞，而第三个峰指示用MEK抑制剂处理的细胞。

图24展示抗ET_BR>BR-ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)与1mpk>BR-ADC比较。

图25展示抗ET_BR>BR-ADC(Hu5E9v1-vc-MMAE)与7.5mpk>BR-ADC比较。

图26描绘用媒介或30mpk BRAFi RG7204处理的COLO 829肿瘤中磷酸化erk和总erk蛋白的表达。

图27描绘用BRAFi RG7204处理3天的COLO 829肿瘤中(小图A)和用MEKi-973处理3天的A2058肿瘤中(小图B)的ETBR转录物表达。小图A显示COLO 829细胞系中，用媒介对照或10mpk或30mpk RG7204处理的COLO892肿瘤中的ETBR转录物，对对照GAPDH进行标准化。小图B显示用媒介对照或5或10mpk MEKi-973处理的A2058肿瘤中的ETBR转录物，对对照Hprt1进行标准化。

发明详述

I.定义

出于本文中的目的，“受体人框架”指包含自人免疫球蛋白框架或如下文定义的人共有框架衍生的轻链可变域(VL)框架或重链可变域(VH)框架的氨基酸序列的框架。自人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生”的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或2或更少。在一些实施方案中，VL受体人框架与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列上相同。

“亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)来表述。亲和力可以通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的方法。下文描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性和例示性的实施方案。

“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVR)中具有一处或多处改变的抗体，与不拥有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致该抗体对抗原的亲和力改善。

术语“抗ETBR抗体”和“结合ETBR的抗体”指能够以足够的亲和力结合内皮缩血管肽B受体(ETBR)，使得抗体可用作靶向ETBR中的诊断和/或治疗剂的抗体。在一个实施方案中，抗ETBR抗体对无关的、非ETBR蛋白的结合程度小于抗体对ETBR的结合的约10％，如例如通过放射性免疫测定法(RIA)测量的。在某些实施方案中，结合ETBR的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM(例如10^-8M或更少，例如10^-8M至10^-13M，例如10^-9M至10^-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗ETBR抗体结合来自不同物种的ETBR间保守的ETBR表位。

本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。

“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体中与完整抗体结合的抗原结合的部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)₂；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

与参照抗体“结合相同表位的抗体”指在竞争测定法中将参照抗体对其抗原的结合阻断50％或更多的抗体，且反之，参照抗体在竞争测定法中将该抗体对其抗原的结合阻断50％或更多。本文中提供了一种例示性的竞争测定法。

如本文中使用的，术语“BRAF”指一种丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶B-Raf，也称作原癌基因B-Raf或v-Raf鼠肉瘤病毒癌基因同系物B1，它是在人中由BRAF基因编码的蛋白质。B-Raf蛋白涉及发送细胞中和细胞生长中的信号。

如本文中使用的，术语“BRAF抑制剂”或“BRAFi”指任何数目的已知小分子药物化合物，其能抑制或中断B-Raf/MEK/ERK途径上的B-Raf/MEK步骤。合适的BRAFi的例子可包括但不限于那些在2010年8月27日提交的国际专利申请PCT/US2010/047007，2010年8月27日提交的国际专利申请PCT/US2010/046975，2010年8月27日提交的国际专利申请PCT/US2010/046952，2010年8月27日提交的国际专利申请PCT/US2010/046955，和2006年6月21日提交的国际专利申请PCT/US2006/024361中描述的。另一个例子可以是但不限于GSK 2118436，其具有CAS注册号405554-55-4，也称作5-[2-[4-[2-(二甲基氨基)乙氧基]苯基]-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑-4-基]-2,3-二氢-1H-二氢茚-1-酮肟(5-[2-[4-[2-(Dimethylamino)ethoxy]phenyl]-5-(4-pyridinyl)-1H-imidazol-4-yl]-2,3-dihydro-1H-inden-1-one oxime)。

术语“嵌合”抗体指其中的重和/或轻链的一部分自特定的来源或物种衍生，而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生的抗体。

抗体的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。抗体有5大类：IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM，并且这些中的几种可以进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁、和IgA₂。与不同类免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ、和μ。

如本文中所使用的，术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒剂包括但不限于：放射性同位素(例如At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²、Zr⁸⁹和Lu的放射性同位素)；化学治疗剂或药物(例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamicin)、长春花生物碱类(vinca>

“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。

药剂(例如药物配制剂)的“有效量”指在必需的剂量和时段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。

如本文中使用的，术语“ETBR”指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物，诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠))的任何天然内皮缩血管肽B受体(ETBR)，除非另有指示。该术语涵盖“全长”、未加工的ETBR以及源自细胞中的加工的任何形式的ETBR。该术语还涵盖ETBR的天然存在的变体，例如剪接变体或等位变体。SEQ ID NO:10中显示了一种例示性人ETBR的氨基酸序列(参见Nakamuta M et al.,Cloning and Sequence Analysis ofa cDNA encoding Human non-selective type of endothelin receptor,BiochemBiophys Res Commun.1991May31:177(1):34-9)。

如本文中使用的，术语“抗ETBR抗体-ADC”指与毒素缀合的，本文中描述的任何抗ETBR抗体。此类毒素包括但不限于美登木素生物碱类或具体地单甲基auristatin(MMAE)。涵盖抗ETBR抗体-ADC作为一类“本发明的抗ETBR抗体”。

本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区一部分的C端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区自Cys226，或自Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有规定，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统，又称作EU索引，如记载于Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991。

“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基外的可变域残基。一般地，可变域的FR由4个FR域组成：FR1、FR2、FR3、和FR4。因而，HVR和FR序列在VH(或VL)中一般以如下的顺序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

术语“全长抗体”、“完整抗体”、和“全抗体”在本文中可互换使用，指与天然抗体结构具有基本上类似的结构或者具有含有如本文中所限定的Fc区的重链的抗体。

如本文中使用的，术语“945”或“BRAFi-945”指一种B-Raf酶抑制剂，其为4-氨基-N-(6-氯-2-氟-3-(3-氟丙基磺酰胺基)苯基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-甲酰胺(4-amino-N-(6-chloro-2-fluoro-3-(3-fluoro propyl sulfonamido)phenyl)thieno[3,2-d]pyrimidine-7-carboxamide)且其具有的结构具有2010年8月27日提交的国际专利申请PCT/US2010/046955(通过述及将其完整收入本文)实施例15中公开的下式：

术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”、和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且指已经导入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞及自其衍生的后代而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可以与亲本细胞不完全相同，而是可以含有突变。本文中包括具有与在初始转化细胞中筛选或选择的相同的功能或生物学活性的突变体后代。

“人抗体”指拥有与由人或人细胞生成的或利用人抗体全集或其它人抗体编码序列自非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

“人共有框架”指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常存在的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变域序列亚组。通常，序列亚组是如Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第五版,NIH Publication91-3242,Bethesda MD(1991),第1-3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组III。

“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体会包含至少一个，通常两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，且所有或基本上所有FR对应于人抗体的那些。任选地，人源化抗体可以至少包含自人抗体衍生的抗体恒定区的一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”指已经经历人源化的抗体。

如本文中所使用的，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变的和/或形成结构上限定的环(“高变环”)的每个区。一般地，天然的4链抗体包含6个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，且三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR一般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后一种是最高序列变异性的和/或牵涉抗原识别。例示性的高变环存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)、和96-101(H3)(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。例示性的CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基24-34、L2的50-56、L3的89-97、H1的31-35B、H2的50-65、和H3的95-102(Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。除了VH中的CDR1外，CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”，或“SDR”，其是接触抗原的残基。SDR包含在称作缩短的-CDR，或a-CDR的CDR区内。例示性的a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2、和a-CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基31-34、L2的50-55、L3的89-96、H1的31-35B、H2的50-58、和H3的95-102(见Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))。除非另有指示，可变域中的HVR残基和其它残基(例如，FR残基)在本文中依照Kabat等，见上文编号。

“免疫缀合物”指与一种或多种异源分子(包括但不限于细胞毒剂)缀合的抗体。

“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如，牛、绵羊、猫、犬、和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类诸如猴)、家兔、和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。

“分离的”抗体指已经与其天然环境的组分分开的抗体。在一些实施方案中，抗体纯化至大于95％或99％的纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)测定的。关于用于评估抗体纯度的方法的综述，见例如Flatman等,J.Chromatogr.B848:79-87(2007)。

“分离的”核酸指已经与其天然环境的组分分开的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中含有的核酸分子，但是核酸分子在染色体外或在与其天然染色体位置不同的染色体位置处存在。

“编码抗ETBR抗体的分离的核酸”指编码抗体重和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括单一载体或分开的载体中的此类核酸分子，和存在于宿主细胞中的一个或多个位置的此类核酸分子。

如本文中使用的，术语“丝裂原活化的蛋白激酶”(MAP激酶)指属于CMGC(CDK/MAPK/GSK3/CLK)激酶组的丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶。哺乳动物的ERK1/2途径大概是表征最好的MAPK系统。此途径最重要的上游活化物是Raf蛋白(A-Raf，B-Raf或c-Raf)，对生长因子(EGF，FGF，PDGF，等)的应答的关键介导物。

如本文中使用的，术语“MAPK/ERK激酶”(MEK)指一种酪氨酸激酶，其占据MAPK途径中的中心作用。组成性有活性形式的MEK的表达导致细胞系转化。

如本文中使用的，术语“MEK抑制剂”(MEKi)指任何数目的已知小分子药物化合物，其能抑制或中断MAP激酶途径上的MEK步骤。合适的MEKi的例子可包括但不限于那些作为MEKi-623，MEKi-973，或GSK1120212描述的。

如本文中使用的，术语“MEKi-973”指MEK抑制剂(S)-(3,4-二氟-2-((2-氟-4-碘苯基)氨基)苯基)(3-羟基-3-(哌啶-2-基)吖丁啶-1-基)甲酮(3,4-difuoro-2-((2-fluoro-4-iodophenyl)amino)phenyl)(3-hydoxy-3-(piperidin-2yl)azetidin-1-yl)methanone)，其具有下述结构：

如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生成期间发生的可能的变体抗体外，此类变体一般以极小量存在。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此，修饰语“单克隆”指示抗体自一群基本上同质的抗体获得的特征，而不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，可以通过多种技术来生成要依照本发明使用的单克隆抗体，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于生成单克隆抗体的此类方法和其它例示性方法。

“裸抗体”指未与异源模块(例如细胞毒性模块)或放射性标记物缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物配制剂中。

“天然抗体”指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，由二硫化物键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，又称作可变重域或重链可变域，接着是三个恒定域(CH1、CH2、和CH3)。类似地，从N至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，又称作可变轻域或轻链可变域，接着是一个恒定轻(CL)域。根据其恒定域氨基酸序列，抗体轻链可归入两种型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。

术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包含的用法说明书，其含有关于涉及此类治疗产品应用的适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或警告的信息。

关于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定用于比对序列的合适参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为了本发明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.编写，并且源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(US Copyright Office,Washington D.C.,20559)，其中其以美国版权注册号TXU510087注册。公众自Genentech,Inc.(South San Francisco,California)可获得ALIGN-2程序，或者可以从源代码编译。ALIGN2程序应当编译成在UNIX操作系统(包括数码UNIX V4.0D)上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。

在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：

分数X/Y乘100

其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。应当领会，若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中所使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。

术语“药物配制剂”指所处形式使得容许其中含有的活性成分的生物学活性是有效的，且不含对会接受配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的别的组分的制剂。

“药学可接受载体”指药物配制剂中与活性成分不同的，且对受试者无毒的成分。药学可接受载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂、或防腐剂。

术语“RG7204”指一种B-Raf酶抑制剂，其具有分子式C₂₃H₁₈CIF₂N₃O₃S和下述结构：

如本文中所使用的，“治疗/处理”(及其语法变型)指试图改变所治疗个体的天然过程的临床干预，并且可以为了预防或者在临床病理学的过程期间实施。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或再发生、减轻症状、减轻/减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展速率、改善或减轻疾病状态、和消退或改善的预后。在一些实施方案中，使用本发明的抗体来延迟疾病的形成或减缓疾病的进展。

术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中牵涉抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链可变域(分别为VH和VL)一般具有类似的结构，其中每个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR)(见例如Kindt等KubyImmunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007))。单个VH或VL域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别使用来自结合抗原的抗体的VH或VL域筛选互补VL或VH域的文库来分离结合特定抗原的抗体。见例如，Portolano等,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等,Nature352:624-628(1991)。

如本文中所使用的，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体及整合入接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。

II.组合物和方法

一方面，本发明部分基于结合ETBR的抗体。本发明的抗体可用于例如治疗黑素瘤。

例示性抗ETBR抗体

一方面，本发明提供一种分离的结合ETBR的抗体。在某些实施方案中，抗ETBR抗体包含至少一种，两种，三种，四种，五种，或六种选自下述的CDR：(a)CDR-L1(KSSQSLLDSDGKTYLN；SEQ ID NO:7)，(b)CDR-L2(LVSKLDS；SEQ ID NO:8)，(c)CDR-L3(WQGTHFPYT；SEQ ID NO:9)，(d)CDR-H1(GYTFTSYWMQ；SEQ ID NO:1)，(e)CDR-H2(TIYPGDGDTSYAQKFKG；SEQ ID NO:2)，和(f)CDR-H3(WGYAYDIDN；SEQ ID NO:3)。

在任何上述实施方案中，抗ETBR抗体是人源化的。在一个实施方案中，抗ETBR抗体包含任何上述实施方案中的CDR，且进一步包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。另一方面，本发明提供一种分离的抗ETBR抗体，其具有VL氨基酸序列SEQ ID NO:8和VH氨基酸序列SEQ IDNO:7。还有另一方面，本发明提供一种抗ETBR抗体，其具有VL序列SEQ IDNO:8和VH氨基酸序列SEQ ID NO:9。

另一方面，抗ETBR抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:7或9具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或删除，但是包含该序列的抗ETBR抗体保留结合ETBR的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:7或9中替代，插入和/或删除总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，在CDR以外的区域中(即在FR中)发生替代，插入，或删除。

另一方面，提供一种抗ETBR抗体，其中该抗体包含与氨基酸序列SEQ IDNO:8具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或删除，但是包含该序列的抗ETBR抗体保留结合ETBR的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:8中替代，插入和/或删除总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，在HVR以外的区域中(即在FR中)发生替代，插入，或删除。

另一方面，提供一种抗ETBR抗体，其中该抗体包含上文提供的任何实施方案中的VH和上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ ID NO:7或9和SEQ ID NO:8中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。

又一方面，本发明提供与本文中提供的抗ETBR抗体结合相同表位的抗体。例如，在某些实施方案中，提供与包含VH序列SEQ ID NO:7或9和VL序列SEQ ID NO:8的抗ETBR抗体结合相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供结合ETBR N端胞外域#1片段内由SEQ ID NO:10的氨基酸编号64至101组成的表位的抗ETBR抗体。

在本发明的又一个方面，依照任何上述实施方案的抗ETBR抗体为单克隆抗体，包括嵌合抗体，人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，抗ETBR抗体为抗体片段，例如Fv，Fab，Fab’，scFv，双抗体，或F(ab’)₂片段。在另一个实施方案中，抗体为全长抗体，例如完整IgG1抗体或其它抗体类或同种型，如本文中定义的。

在又一个方面，依照任何上述实施方案的抗ETBR抗体可单一地或组合地并入下文1-7节中描述的任何特征：

抗体亲和力

在某些实施方案中，本文中提供的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM(例如10^-8M或更少，例如10^-8M至10^-13M，例如，10^-9M至10^-13M)的解离常数(Kd)。

在一个实施方案中，Kd是通过如下述测定法所述用Fab型式的感兴趣抗体及其抗原实施的放射性标记抗原结合测定法(RIA)来测量的。通过在存在未标记抗原的滴定系列的情况中用最小浓度的(¹²⁵I)标记抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(见例如Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为了建立测定法的条件，将多孔板(Thermo Scientific)用50mM碳酸钠(pH9.6)中的5μg/ml捕捉用抗Fab抗体(Cappel Labs)包被过夜，随后用PBS中的2％(w/v)牛血清清蛋白于室温(约23℃)封闭2-5小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[¹²⁵I]-抗原与连续稀释的感兴趣Fab混合(例如与Presta等,Cancer>)洗板8次。平板干燥后，加入150μl/孔闪烁液(MICROSCINT-20^TM；Packard)，然后在TOPCOUNT>TM伽马计数器(Packard)上对平板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20％的浓度用于竞争性结合测定法。

依照另一个实施方案，Kd是使用表面等离振子共振测定法使用-2000或-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)于25℃使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简言之，依照供应商的用法说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠pH4.8稀释至5μg/ml(约0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注射以获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，于25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05％聚山梨酯20(TWEEN-20^TM)表面活性剂的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型( Evaluation Software version3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(k_on)和解离速率(k_off)。平衡解离常数(Kd)以比率k_off/k_on计算。见例如Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过10⁶M^-1s^-1，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv>TM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，在存在浓度渐增的抗原的情况中，测量PBS>

抗体片段

在某些实施方案中，本文中提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)₂、Fv、和scFv片段，及下文所描述的其它片段。关于某些抗体片段的综述，见Hudson等Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，见例如于The Pharmacology of MonoclonalAntibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,(Springer-Verlag,New York),第269-315页(1994)；还可见WO 93/16185；及美国专利No.5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)₂片段的讨论，见美国专利No.5,869,046。

双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的。见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)；及Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也记载于Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)。

单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或整个或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；见例如美国专利No.6,248,516 B1)。

可以通过多种技术，包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消化及重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)的生成来生成抗体片段，如本文中所描述的。

嵌合的和人源化的抗体

在某些实施方案中，本文中提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体记载于例如美国专利No.4,816,567；及Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。在一个例子中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，自小鼠、大鼠、仓鼠、家兔、或非人灵长类，诸如猴衍生的可变区)和人恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类转换的”抗体，其中类或亚类已经自亲本抗体的类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。

在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般地，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中HVR，例如CDR(或其部分)自非人抗体衍生，而FR(或其部分)自人抗体序列衍生。任选地，人源化抗体还会至少包含人恒定区的一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基用来自非人抗体(例如衍生HVR残基的抗体)的相应残基替代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。

人源化抗体及其生成方法综述于例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)，并且进一步记载于例如Riechmann等,Nature332:323-329(1988)；Queen等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337,7,527,791,6,982,321和7,087,409；Kashmiri等,Methods 36:25-34(2005)(描述了SDR(a-CDR)嫁接)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了“重修表面”)；Dall’Acqua等,Methods 36:43-60(2005)(描述了“FR改组”)；及Osbourn等,Methods 36:61-68(2005)和Klimka等,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述了FR改组的“引导选择”方法)。

可以用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合(best-fit)”方法选择的框架区(见例如Sims等J.Immunol.151:2296(1993))；自轻或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列衍生的框架区(见例如Carter等Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；及Presta等J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟的(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(见例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和通过筛选FR文库衍生的框架区(见例如Baca等,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)及Rosok等,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。

人抗体

在某些实施方案中，本文中提供的抗体是人抗体。可以使用本领域中已知的多种技术来生成人抗体。一般地，人抗体记载于van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)。

可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体，所述转基因动物已经修饰为响应抗原性攻击而生成完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有所有或部分人免疫球蛋白基因座，其替换内源免疫球蛋白基因座，或者其在染色体外存在或随机整合入动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，一般已经将内源免疫球蛋白基因座灭活。关于自转基因动物获得人抗体的方法的综述，见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还可见例如美国专利No.6,075,181和6,150,584，其描述了XENOMOUSE^TM技术；美国专利No.5,770,429，其描述了技术；美国专利No.7,041,870，其描述了K-M 技术，和美国专利申请公开文本No.US 2007/0061900，其描述了技术)。可以例如通过与不同人恒定区组合进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。

也可以通过基于杂交瘤的方法生成人抗体。已经描述了用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系(见例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；及Boerner等,J.Immunol.,147:86(1991))。经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也记载于Li等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。其它方法包括那些例如记载于美国专利No.7,189,826(其描述了自杂交瘤细胞系生成单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(其描述了人-人杂交瘤)的。人杂交瘤技术(Trioma技术)也记载于Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)及Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)。

也可以通过分离自人衍生的噬菌体展示文库选择的Fv克隆可变域序列生成人抗体。然后，可以将此类可变域序列与期望的人恒定域组合。下文描述了自抗体文库选择人抗体的技术。

文库衍生的抗体

可以通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体来分离本发明的抗体。例如，用于生成噬菌体展示文库并对此类文库筛选拥有期望结合特征的抗体的多种方法是本领域中已知的。此类方法综述于例如Hoogenboom等于Methods in Molecular Biology178:1-37(O’Brien等编,Human Press,Totowa,NJ,2001)，并且进一步记载于例如McCafferty等,Nature348:552-554；Clackson等,Nature 352:624-628(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,于Methods in Molecular Biology248:161-175(Lo编,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；及Lee等,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)。

在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的全集分别通过聚合酶链式反应(PCR)克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以对所述噬菌体文库筛选抗原结合噬菌体，如记载于Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)的。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或以Fab片段展示抗体片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以(例如自人)克隆未免疫全集以在没有任何免疫的情况中提供针对一大批非自身和还有自身抗原的抗体的单一来源，如由Griffiths等,EMBO J,12:725-734(1993)描述的。最后，也可以通过自干细胞克隆未重排的V基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排来合成生成未免疫文库，如由Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开文本包括例如：美国专利No.5,750,373、和美国专利公开文本No.2005/0079574,2005/0119455,2005/0266000,2007/0117126,2007/0160598,2007/0237764,2007/0292936和2009/0002360。

认为自人抗体文库分离的抗体或抗体片段是本文中的人抗体或人抗体片段。

多特异性抗体

在某些实施方案中，本文中提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两种不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性之一针对ETBR，而另一种针对任何其它抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合ETBR的两种不同表位。也可以使用双特异性抗体来将细胞毒剂定位于表达ETBR的细胞。双特异性抗体可以以全长抗体或抗体片段制备。

用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链的重组共表达(见Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983))、WO 93/08829、和Traunecker等,EMBO J.10:3655(1991))、和“突起-入-空穴”工程化(见例如美国专利No.5,731,168)。也可以通过用于生成抗体Fc-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(WO 2009/089004A1)；交联两种或更多种抗体或片段(见例如美国专利No.4,676,980,及Brennan等,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(见例如Kostelny等,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术(见例如Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；及使用单链Fv(sFv)二聚体(见例如Gruber等,J.Immunol.,152:5368(1994))；及如例如Tutt等J.Immunol.147:60(1991)中所描述的，制备三特异性抗体来生成多特异性抗体。

本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化改造抗体，包括“章鱼抗体”(见例如US 2006/0025576A1)。

本文中的抗体或片段还包括包含结合ETBR及另一种不同抗原的抗原结合位点的“双重作用FAb”或“DAF”(见例如US 2008/0069820)。

抗体变体

在某些实施方案中，涵盖本文中提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可以期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将合适的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体的氨基酸序列内的残基的删除、和/或插入和/或替代。可以进行删除、插入、和替代的任何组合以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有期望的特征，例如，抗原结合。

替代、插入、和删除变体

在某些实施方案中，提供了具有一处或多处氨基酸替代的抗体变体。替代诱变感兴趣的位点包括HVR和FR。保守替代在表1中在“保守替代”的标题下显示。更实质的变化在表1中在“例示性替代”的标题下提供，并且如下文参照氨基酸侧链类别进一步描述的。可以将氨基酸替代引入感兴趣的抗体中，并且对产物筛选期望的活性，例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC。

表1

依照共同的侧链特性，氨基酸可以如下分组：

疏水性的：正亮氨酸,Met,Ala,Val,Leu,Ile；

中性、亲水性的：Cys,Ser,Thr,Asn,Gln；

酸性的：Asp,Glu；

碱性的：His,Lys,Arg；

影响链取向的残基：Gly,Pro；

芳香族的：Trp,Tyr,Phe。

非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。

一类替代变体牵涉替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般地，为进一步研究选择的所得变体相对于亲本抗体会具有某些生物学特性的改变(例如改善)(例如升高的亲和力、降低的免疫原性)和/或会基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。一种例示性的替代变体是亲和力成熟的抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来方便地生成。简言之，将一个或多个HVR残基突变，并将变体抗体在噬菌体上展示，并对其筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。

可以对HVR做出变化(例如，替代)，例如以改善抗体亲和力。可以对HVR“热点”，即由在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子编码的残基(见例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))，和/或SDR(a-CDR)做出此类变化，对所得的变体VH或VL测试结合亲和力。通过次级文库的构建和再选择进行的亲和力成熟已经记载于例如Hoogenboom等于Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等编,Human Press,Totowa,NJ,(2001))。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组、或寡核苷酸指导的诱变)将多样性引入为成熟选择的可变基因。然后，创建次级文库。然后，筛选文库以鉴定具有期望的亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法牵涉HVR指导的方法，其中将几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)随机化。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定牵涉抗原结合的HVR残基。特别地，经常靶向CDR-H3和CDR-L3。

在某些实施方案中，可以在一个或多个HVR内发生替代、插入、或删除，只要此类变化不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以对HVR做出保守变化(例如，保守替代，如本文中提供的)，其不实质性降低结合亲和力。此类变化可以在HVR“热点”或SDR外部。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR是未改变的，或者含有不超过1、2或3处氨基酸替代。

一种可用于鉴定抗体中可以作为诱变靶位的残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如由Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所描述的。在此方法中，鉴定一个残基或一组靶残基(例如，带电荷的残基诸如arg、asp、his、lys、和glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)替换以测定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始替代表明功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的替代。或者/另外，利用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体与抗原间的接触点。作为替代的候选，可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有期望的特性。

氨基酸序列插入包括长度范围为1个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基端融合，及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N或C端与酶(例如对于ADEPT)或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合物。

糖基化变体

在某些实施方案中，改变本文中提供的抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列，使得创建或消除一个或多个糖基化位点来方便地实现对抗体的糖基化位点的添加或删除。

在抗体包含Fc区的情况中，可以改变其附着的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体通常包含分支的、双触角寡糖，其一般通过N连接附着于Fc区的CH2域的Asn297。见例如Wright等TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖、和唾液酸，以及附着于双触角寡糖结构“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本发明抗体中的寡糖进行修饰以创建具有某些改善的特性的抗体变体。

在一个实施方案中，提供了抗体变体，其具有缺乏附着(直接或间接)于Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此类抗体中的岩藻糖量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。通过相对于附着于Asn297的所有糖结构(例如，复合的、杂合的和高甘露糖的结构)的总和，计算Asn297处糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖量，如通过MALDI-TOF质谱术测量的，例如如记载于WO 2008/077546的。Asn297指位于Fc区中的约第297位(Fc区残基的Eu编号方式)的天冬酰胺残基；然而，Asn297也可以由于抗体中的微小序列变异而位于第297位上游或下游约±3个氨基酸，即在第294位和第300位之间。此类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。见例如美国专利公开文本No.US 2003/0157108(Presta,L.)；US 2004/0093621(KyowaHakko Kogyo Co.,Ltd)。涉及“脱岩藻糖基化的”或“岩藻糖缺乏的”抗体变体的出版物的例子包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够生成脱岩藻糖基化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13 CHO细胞(Ripka等Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请No US2003/0157108A1,Presta,L；及WO 2004/056312 A1,Adams等，尤其在实施例11)，和敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(见例如Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；及WO2003/085107)。

进一步提供了具有两分型寡糖的抗体变体，例如其中附着于抗体Fc区的双触角寡糖是通过GlcNAc两分的。此类抗体变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的例子记载于例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等)；美国专利No.6,602,684(Umana等)；及US 2005/0123546(Umana等)。还提供了在附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体记载于例如WO 1997/30087(Patel等)；WO 1998/58964(Raju,S.)；及WO 1999/22764(Raju,S.)。

Fc区变体

在某些实施方案中，可以将一处或多处氨基酸修饰引入本文中提供的抗体的Fc区中，由此生成Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如替代)的人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。

在某些实施方案中，本发明涵盖拥有一些但不是所有效应器功能的抗体变体，所述效应器功能使其成为如下应用的期望候选物，其中抗体的体内半衰期是重要的，而某些效应器功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消减。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺乏FcγR结合(因此有可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页上的表3中汇总了造血细胞上的FcR表达。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性例子记载于美国专利No.5,500,362(见例如Hellstrom,I.等Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(见Bruggemann,M.等,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。或者，可以采用非放射性测定方法(见例如用于流式细胞术的ACTI^TM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.MountainView,CA；和CytoTox非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如披露于Clynes等Proc.Nat’l Acad.Sci.USA95:652-656(1998)的。也可以实施C1q结合测定法以确认抗体不能结合C1q，并且因此缺乏CDC活性。见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以实施CDC测定法(见例如Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等,Blood101:1045-1052(2003)；及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood103:2738-2743(2004))。也可以使用本领域中已知的方法来实施FcRn结合和体内清除/半衰期测定(见例如Petkova,S.B.等,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。

具有降低的效应器功能的抗体包括那些具有Fc区残基238,265,269,270,297,327和329中的一个或多个的替代的(美国专利No.6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两处或更多处具有替代的Fc突变体，包括残基265和297替代成丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利No.7,332,581)。

描述了具有改善的或降低的对FcR的结合的某些抗体变体(见例如美国专利No.6,737,056；WO 2004/056312，及Shields等,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。

在某些实施方案中，抗体变体包含具有改善ADCC的一处或多处氨基酸替代，例如Fc区的位置298、333、和/或334(残基的EU编号方式)的替代的Fc区。

在一些实施方案中，对Fc区做出改变，其导致改变的(即，改善的或降低的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如记载于美国专利No.6,194,551、WO 99/51642、及Idusogie等J.Immunol.164:4178-4184(2000)的。

具有延长的半衰期和改善的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体记载于US2005/0014934A1(Hinton等)，新生儿Fc受体(FcRn)负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)及Kim等,J.Immunol.24:249(1994))。那些抗体包含其中具有改善Fc区对FcRn结合的一处或多处替代的Fc区。此类Fc变体包括那些在Fc区残基238,256,265,272,286,303,305,307,311,312,317,340,356,360,362,376,378,380,382,413,424或434中的一处或多处具有替代，例如，Fc区残基434的替代的(美国专利No.7,371,826)。

还可见Duncan和Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利No.5,648,260；美国专利No.5,624,821；及WO 94/29351，其关注Fc区变体的其它例子。

经半胱氨酸工程化改造的抗体变体

在某些实施方案中，可以期望创建经半胱氨酸工程化改造的抗体，例如，“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在具体的实施方案中，替代的残基存在于抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸替代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点，并且可以用于将抗体与其它模块，诸如药物模块或接头-药物模块缀合，以创建免疫缀合物，如本文中进一步描述的。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸替代下列残基之任一个或多个：轻链的V205(Kabat编号方式)；重链的A118(EU编号方式)；和重链Fc区的S400(EU编号方式)。可以如例如美国专利No.7,521,541所述生成经半胱氨酸工程化改造的抗体。

抗体衍生物

在某些实施方案中，可以进一步修饰本文中提供的抗体以含有本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质模块。适合于抗体衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)、和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着到抗体上的聚合物数目可以变化，而且如果附着了超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体要改进的具体特性或功能、抗体衍生物是否将用于指定条件下的治疗等。

在另一个实施方案中，提供了抗体和可以通过暴露于辐射选择性加热的非蛋白质性质模块的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质性质模块是碳纳米管(Kam等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长的，并且包括但不限于对普通细胞没有损害，但是将非蛋白质性质模块加热至抗体-非蛋白质性质模块附近的细胞被杀死的温度的波长。

重组方法和组合物

可以使用重组方法和组合物来生成抗体，例如，如记载于美国专利No.4,816,567的。在一个实施方案中，提供了编码本文中所描述的抗ETBR抗体的分离的核酸。此类核酸可以编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻和/或重链)。在又一个实施方案中，提供了包含此类核酸的一种或多种载体(例如，表达载体)。在又一个实施方案中，提供了包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经用下述各项转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体VL的氨基酸序列和包含抗体VH的氨基酸序列，或(2)第一载体和第二载体，所述第一载体包含编码包含抗体VL的氨基酸序列的核酸，所述第二载体包含编码包含抗体VH的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了生成抗ETBR抗体的方法，其中该方法包括在适合于表达抗体的条件下培养包含编码抗体的核酸的宿主细胞，如上文提供的，并且任选地，自宿主细胞(或宿主细胞培养液)回收抗体。

对于抗ETBR抗体的重组生成，将编码抗体的核酸(例如如上文所描述的)分离，并插入一种或多种载体中，以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规规程将此类核酸容易地分离并测序(例如，通过使用寡核苷酸探针来进行，所述寡核苷酸探针能够特异性结合编码抗体的重和轻链的基因)。

适合于克隆或表达抗体编码载体的宿主细胞包括本文中所描述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中生成抗体，特别是在不需要糖基化和Fc效应器功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，见例如美国专利No.5,648,237,5,789,199和5,840,523(还可见Charlton,Methods in MolecularBiology,第248卷(B.K.C.Lo编,Humana Press,Totowa,NJ,2003),第245-254页，其描述了抗体片段在大肠杆菌(E.coli.)中的表达)。表达后，可以将抗体在可溶性级分中自细菌细胞浆分离，并可以进一步纯化。

在原核生物外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母是适合于抗体编码载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”，导致生成具有部分或完全人的糖基化样式的抗体的真菌和酵母菌株。见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)；及Li等,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。

适合于表达糖基化抗体的宿主细胞也自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)衍生。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定出许多杆状病毒株，其可以与昆虫细胞一起使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。

也可以利用植物细胞培养物作为宿主。见例如美国专利No.5,959,177,6,040,498,6,420,548,7,125,978和6,417,429(其描述了用于在转基因植物中生成抗体的PLANTIBODIES^TM技术)。

也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适应于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293细胞，如记载于例如Graham等,J.Gen Virol.36:59(1977)的)；幼年仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如记载于例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)的)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如记载于例如Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)的；MRC5细胞；和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR^->

测定法

可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的抗ETBR抗体鉴定，筛选，或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。

结合测定法和其它测定法

一方面，对本发明的抗体测试其抗原结合活性，例如通过已知的方法诸如ELISA，Western印迹，等。

另一方面，可使用竞争测定法来鉴定与例如Hu5E9v.1或Hu5E9v.2竞争结合ETBR的抗体。在某些实施方案中，此类竞争性抗体结合Hu5E9v.1或Hu5E9v.2所结合的相同表位(例如线性或构象表位)。用于定位抗体所结合表位的详细例示性方法提供于Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols,”inMethods in Molecular Biology vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)。在本发明的一方面，本文中描述的抗ETBR抗体特异性结合由SEQ ID NO:10的氨基酸编号64至101组成的ETBR表位。

在一种例示性竞争测定法中，在包含结合ETBR的第一标记抗体(例如Hu5E9v.1或Hu5E9v.2)和第二未标记抗体(其要测试与第一抗体竞争与ETBR的结合的能力)的溶液中温育固定化的ETBR。第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，在包含第一标记抗体但不包含第二未标记抗体的溶液中温育固定化的ETBR。在允许第一抗体结合ETBR的条件下温育后，除去过量的未结合抗体，并测量与固定化ETBR缔合的标记物的量。如果测试样品中与固定化ETBR缔合的标记物的量相对于对照样品实质性降低，那么这指示第二抗体与第一抗体竞争结合ETBR。参见Harlow and Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。

活性测定法

一方面，提供了用于鉴定抗ETBR抗体和/或BRAFi化合物是否具有生物学活性的的测定法。生物学活性可包括实施例中描述的那些，例如体外黑素瘤细胞存活测定法或体内异种移植物模型，其中将黑素瘤细胞系移植入裸鼠并评估肿瘤生长抑制(TGI)。

免疫缀合物

本发明还提供了包含与一种或多种细胞毒剂，诸如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如，蛋白质毒素、细菌、真菌、植物、或动物起源的酶活性毒素、或其片段)、或放射性同位素缀合的本文中的抗ETBR抗体的免疫缀合物。

本发明还提供包含缀合有一种或多种细胞毒剂的抗体的免疫缀合物(可互换的称为“抗体-药物缀合物”或“ADC”)，所述细胞毒剂诸如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白质毒素，细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素，或其片段)、或放射性同位素(即放射缀合物)。

免疫缀合物已经在癌症治疗中用于局部投递细胞毒剂(即杀死或抑制细胞生长或增殖的药物)(Xie et al(2006)Expert.Opin.Biol.Ther.6(3):281-291；Kovtun et al(2006)Cancer Res.66(6):3214-3121；Law et al(2006)Cancer Res.66(4):2328-2337；Lambert,J.(2005)Curr.Opinion in Pharmacology5:543-549；Wu et al(2005)Nature Biotechnology23(9):1137-1146；Payne,G.(2003)i3:207-212；Syrigos and Epenetos(1999)Anticancer Research19:605-614；Niculescu-Duvaz and Springer(1997)Adv.Drug Deliv.Rev.26:151-172；U.S.Pat.No.4,975,278)。免疫缀合物容许将药物模块靶向投递至肿瘤，并在那儿进行细胞内积累，而系统施用未经缀合的药物可能在试图消除的肿瘤细胞以外导致不可接受的对正常细胞的毒性水平(Baldwin等,Lancet(1986年3月15日)第603-05页；Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In CancerTherapy：A Review”，在《Monoclonal Antibodies'84：Biological And ClinicalApplications》中，A.Pinchera等人编，第475-506页，1985)。多克隆抗体和单克隆抗体皆有报导可用于这些策略(Rowland等,Cancer Immunol.Immunother.21：183-87(1986))。这些方法中所使用的药物包括道诺霉素(daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate)和长春地辛(vindesine)(Rowland等,1986,见上文)。抗体-毒素缀合物中所使用的毒素包括细菌毒素诸如白喉毒素、植物毒素诸如蓖麻毒蛋白、小分子毒素诸如格尔德霉素(geldanamycin)(Mandler等,J.Nat.Cancer Inst.92(19)：1573-1581(2000)；Mandler等,Bioorganic&Med.Chem.Letters 10：1025-1028(2000)；Mandler等,Bioconjugate Chem.13：786-791(2002))、美登木素生物碱类(EP1391213；Liu等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623(1996))、和加利车霉素(Lode等,Cancer Res.58：2928(1998)；Hinman等,Cancer Res.53：3336-3342(1993))。设计和改进ADC的努力聚焦于单克隆抗体(mAb)的选择性以及药物作用机制、药物连接、药物/抗体比(载荷)、和药物释放特性(McDonagh(2006)Protein Eng.Design&Sel.；Doronina et al(2006)Bioconj.Chem.17:114-124；Erickson et al(2006)Cancer Res.66(8):1-8；Sanderson et al(2005)Clin.Cancer Res.11:843-852；Jeffrey et al(2005)J.Med.Chem.48:1344-1358；Hamblett et al(2004)Clin.Cancer Res.10:7063-7070)。毒素可通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制在内的机制发挥其细胞毒性效果。有些细胞毒药物在与大的抗体或蛋白质受体配体缀合时趋于失活或活性降低。

(ibritumomab>TM(gemtuzumab>

在某些实施方案中，免疫缀合物包含抗体和化疗剂或其它毒素。本文(例如上文)描述了可用于生成免疫缀合物的化疗剂。也可使用酶活性毒素及其片段，本文中有描述。

在某些实施方案中，免疫缀合物包含抗体和一种或多种小分子药物模块(毒素)，包括但不限于小分子药物诸如加利车霉素，美登木素生物碱类，多拉司他汀类，auristatin，蒽环类抗生素，紫杉烷，单端孢霉素(trichothecene)，和CC1065，及这些药物具有细胞毒素活性的衍生物。下文更为详细地讨论了此类免疫缀合物的例子。

例示性的免疫缀合物

本发明的免疫缀合物(或“抗体-药物缀合物”(“ADC”))可以是下文通式I，其中抗体经任选的接头(L)与一个或多个药物模块(D)缀合(即共价附着)。

Ab-(L-D)_p>

因而，抗体可直接地或经接头地缀合至药物。在通式I中，p是每个抗体的平均药物模块数，其范围可以是例如每个抗体约1个到约20个药物模块，在某些实施方案中是每个抗体1个到约8个药物模块。

例示性的接头

接头可以包含一种或多种接头构件。例示性的接头构件包括6-马来酰亚氨基己酰基(“MC”)、马来酰亚氨基丙酰基(“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、对氨基苄氧羰基(“PAB”)、N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(“SPP”)，N-琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1羧酸酯(“SMCC”)，和N-琥珀酰亚氨基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(“SIAB”)。本领域已知多种接头构件，下文描述了其中一些。

接头可以是便于在细胞中释放药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头(例如腙)、蛋白酶敏感(例如肽酶敏感)接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫化物接头(Chari等,Cancer Research 52:127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。

在某些实施方案中，接头是如下面式II所示的：

-A_a-W_w-Y_y-II

其中A是延伸物(stretcher)单元，而a是0到1的整数；W是氨基酸单元，而w是0到12的整数；Y是间隔物单元，而y是0、1或2；且Ab、D和p如上文通式I的定义。此类接头的例示性实施方案记载于US 2005-0238649 A1，明确收入本文作为参考。

在有些实施方案中，接头构件可以包含将抗体连接至另一接头构件或药物模块的“延伸物单元”。例示性的延伸物单元显示于下文(其中波形线指示共价附着至抗体的位点)：

在有些实施方案中，接头构件可以包含氨基酸单元。在一个这样的实施方案中，氨基酸单元容许蛋白酶切割接头，由此便于在暴露于胞内蛋白酶(诸如溶酶体酶)后从免疫缀合物释放药物。参见例如Doronina等(2003)Nat.Biotechnol.21:778-784。例示性的氨基酸单元包括但不限于二肽、三肽、四肽和五肽。例示性的二肽包括：缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)；丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)；苯丙氨酸-赖氨酸(fk或phe-lys)；或N-甲基-缬氨酸-瓜氨酸(Me-val-cit)。例示性的三肽包括：甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。氨基酸单元可以包含天然存在的氨基酸残基，以及次要氨基酸(minor amino acid)和非天然存在氨基酸类似物，诸如瓜氨酸。氨基酸单元可以在它们对特定酶(例如肿瘤相关蛋白酶，组织蛋白酶B、C和D，或血浆蛋白酶(plasmin protease))的酶促切割的选择性方面进行设计和优化。

在有些实施方案中，接头构件可以包含将抗体连接(或是直接的或是通过延伸物单元和/或氨基酸单元)至药物模块的“间隔物”单元。间隔物单元可以是“自我牺牲的”(self-immolative)或“非自我牺牲的”。“非自我牺牲的”间隔物单元指间隔物单元的部分或整体在ADC的酶促(蛋白水解)切割后保持结合于药物模块的间隔物单元。非自我牺牲的间隔物单元的例子包括但不限于甘氨酸间隔物单元和甘氨酸-甘氨酸间隔物单元。还涵盖对序列特异性酶促切割敏感的肽间隔物的其它组合。例如，肿瘤细胞相关蛋白酶对含甘氨酸-甘氨酸间隔物单元的ADC的酶促切割将导致甘氨酸-甘氨酸-药物模块从ADC的剩余部分释放。在一个这样的实施方案中，甘氨酸-甘氨酸-药物模块然后在肿瘤细胞中进行分开的水解步骤，如此从药物模块切割甘氨酸-甘氨酸间隔物单元。

“自我牺牲的”间隔物单元容许释放药物模块而没有分开的水解步骤。在某些实施方案中，接头的间隔物单元包含对氨基苄基单元。在一个这样的实施方案中，将对氨基苯甲醇经酰胺键附着至氨基酸单元，并且在苯甲醇与细胞毒剂之间生成氨基甲酸酯、甲基氨基甲酸酯或碳酸酯。参见例如Hamann等(2005)Expert Opin.Ther.Patents(2005)15:1087-1103。在一个实施方案中，间隔物单元是对氨基苄氧羰基(PAB)。在某些实施方案中，对氨基苄基单元的亚苯基部分是用Qm取代的，其中Q是-C₁-C₈烃基、-O-(C₁-C₈烃基)、-卤素、-硝基或-氰基；而m是范围为0-4的整数。自我牺牲的间隔物单元的例子进一步包括但不限于在电子上与对氨基苯甲醇相似的芳族化合物(参见例如US2005/0256030>

在一个实施方案中，间隔物单元是下文所示分支的双(羟甲基)苯乙烯(BHMS)单元，其可用于掺入和释放多个药物。

其中Q是-C₁-C₈烃基、-O-(C₁-C₈烃基)、-卤素、硝基或氰基；m是范围为0-4的整数；n是0或1；而p的范围是1到约20。

在另一个实施方案中，接头L可以为树枝状类型接头，其用于通过支化多官能接头模块与抗体共价结合一个以上药物模块(Sun等(2002)Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215；Sun等(2003)Bioorganic&Medicinal Chemistry 11:1761-1768)。树枝状接头可以增加药物与抗体的摩尔比，即载荷，它与ADC的效能相关。因此，如果半胱氨酸改造的抗体仅带有一个反应性半胱氨酸巯基，那么可以通过树枝状接头结合众多药物模块。

显示了下文通式II的ADC背景中的例示性接头构件及其组合：

接头构件，包括延伸物、间隔物和氨基酸单元，可以通过本领域已知方法合成，诸如US 2005-0238649 A1中所记载的。

例示性的药物模块

美登素和美登木素生物碱类

在有些实施方案中，免疫缀合物包含缀合有一个或多个美登木素生物碱分子的抗体。美登木素生物碱类是通过抑制微管蛋白多聚化来发挥作用的有丝分裂抑制剂。美登素最初从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)分离得到(美国专利3,896,111)。随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱类，诸如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利4,151,042)。例如下列美国专利公开了合成美登醇及其衍生物和类似物：4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；及4,371,533。

美登木素生物碱类药物模块在抗体药物缀合物中是有吸引力的药物模块，因为它们：(i)相对易于通过发酵或发酵产物的化学修饰或衍生化来制备；(ii)易于用适于通过非二硫化物接头缀合至抗体的官能基衍生化；(iii)在血浆中稳定；且(iv)有效针对多种肿瘤细胞系。

适于用作美登木素生物碱类药物模块的美登素化合物是本领域公知的，而且可以依照已知方法从天然来源分离，或是使用遗传工程技术生产(参见Yu et al(2002)PNAS 99:7968-7973)。美登醇和美登醇类似物也可以依照已知方法合成制备。

例示性的美登木素生物碱类药物模块包括那些具有修饰的芳香环的，诸如：C-19-脱氯(美国专利No.4256746)(通过安丝菌素(ansamytocin)P2的氢化铝锂还原来制备)；C-20-羟基(或C-20-脱甲基)+/-C-19-脱氯(美国专利No.4361650和4307016)(通过使用链霉菌或放线菌的脱甲基化或使用LAH的脱氯化来制备)；及C-20-脱甲氧基,C-20-酰氧基(-OCOR),+/-脱氯(美国专利No.4,294,757)(通过使用酰氯的酰化来制备)，以及在其它位置具有修饰的。

例示性的美登木素生物碱类药物模块还包括那些具有修饰的，诸如：C-9-SH(美国专利No.4424219)(通过美登醇与H₂S或P₂S₅的反应来制备)；C-14-烷氧基甲基(脱甲氧基/CH₂OR)(US>2OH或CH₂OAc)(美国专利No.4450254)(自诺卡氏菌制备)；C-15-羟基/酰氧基(US>

已知美登素化合物上的许多位置作为连接位置是有用的，这取决于连接的类型。例如，为了形成酯键，具有羟基的C-3位、用羟甲基修饰的C-14位、用羟基修饰的C-15位和具有羟基的C-20位均是合适的。

美登木素生物碱药物模块包括那些具有如下结构的：

其中波状线表示美登木素生物碱药物模块的硫原子共价附着至ADC的接头。R可以独立为H或C₁-C₆烃基。使酰胺基附着至硫原子的亚烃基链可以为甲基(methanyl)、乙基(ethanyl)或丙基，即m为1、2或3(US>

本发明的化合物涵盖美登木素生物碱药物模块的所有立体异构体，即D的手性碳处的R和S构型的任何组合(US 7276497；US 6913748；US 6441163；US 633410(RE39151)；US 5208020；Widdison et al(2006)J.Med.Chem.49:4392-4408,通过述及将其完整收录)。在一个实施方案中，美登木素生物碱药物模块会具有如下的立体化学：

美登木素生物碱类药物模块的例示性实施方案包括具有如下结构的DM1、DM3和DM4：

其中波形线指示药物的硫原子对抗体-药物缀合物的接头(L)的共价附着。通过SMCC连接至DM1的(trastuzumab)已有报告(WO2005/037992；US 2005/0276812；US 2005/016993)。

其它例示性的美登木素生物碱类抗体-药物缀合物具有如下结构和缩写(其中Ab是抗体，而p是1到约8)：

其中DM1经BMPEO接头连接抗体硫醇基的例示性抗体-药物缀合物具有如下结构和缩写：

其中Ab是抗体；n是0、1或2；而p是1、2、3或4。

例如下列专利公开了包含美登木素生物碱类的免疫缀合物及其制备方法和治疗用途：美国专利5,208,020；5,416,064；US 2005/0276812 A1；及欧洲专利EP 0 425 235 B1，在此通过述及明确收录其公开内容。Liu et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-8623(1996)记载了包含与针对人结肠直肠癌的单克隆抗体C242连接的称为DM1的美登木素生物碱的免疫缀合物。发现该缀合物具有针对培养的结肠癌细胞的高度细胞毒性，而且在体内肿瘤生长测定法中显示抗肿瘤活性。Chari et al.,Cancer Research 52:127-131(1992)记载了其中美登木素生物碱经二硫化物接头与结合人结肠癌细胞系上抗原的鼠抗体A7或结合HER-2/neu癌基因的另一种鼠单克隆抗体TA.1缀合的免疫缀合物。在体外在人乳癌细胞系SK-BR-3上测试了TA.1-美登木素生物碱缀合物的细胞毒性，该细胞系每个细胞表达3x10⁵个HER-2表面抗原。药物缀合物达到了与游离美登木素生物碱药物相似程度的细胞毒性，这可通过增加每个抗体分子缀合的美登木素生物碱分子数目来提高。A7-美登木素生物碱缀合物在小鼠中显示低系统性细胞毒性。

抗体-美登木素生物碱缀合物通过将抗体与美登木素生物碱分子化学连接且不显著削弱抗体或美登木素生物碱分子的生物学活性来制备。参见例如美国专利No.5,208,020(在此通过述及明确收录其公开内容)。每个抗体分子缀合平均3-4个美登木素生物碱分子在增强针对靶细胞的细胞毒性中显示功效，且对抗体的功能或溶解度没有负面影响，尽管预计甚至一个分子的毒素/抗体也将较之裸抗体的使用增强细胞毒性。美登木素生物碱类在本领域是众所周知的，而且可通过已知技术合成或从天然来源分离。例如美国专利5,208,020和上文提及的其它专利及非专利发表物中公开了合适的美登木素生物碱类。优选的美登木素生物碱类是美登醇和美登醇分子的芳香环或其它位置经过修饰的美登醇类似物，诸如各种美登醇酯。

本领域知道许多连接基团可用于制备抗体-美登木素生物碱缀合物，包括例如美国专利5,208,020或欧洲专利0 425 235 B1；Chari et al.,CancerResearch 52:127-131(1992)；及US 2005/016993A1中所公开的，明确将其公开内容收入本文作为参考。包含接头构件SMCC的抗体-美登木素生物碱类缀合物可以如US 2005/0276812 A1,“Antibody-drug conjugates and Methods”中所披露的来制备。接头包含二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团或酯酶不稳定基团，正如上文所述专利中所公开的。本文中描述和例示了别的接头。

可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和美登木素生物碱的缀合物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的双功能衍生物。在某些实施方案中，偶联剂是N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson et al.,Biochem.J.173:723-737(1978))或N-琥珀酰亚氨基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，由此提供二硫键连接。

根据连接的类型，可将接头附着于美登木素生物碱分子的多个位置。例如，可使用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯键。反应可发生在具有羟基的C-3位置、经羟甲基修饰的C-14位置、经羟基修饰的C-15位置和具有羟基的C-20位置。在一个实施方案中，在美登醇或美登醇类似物的C-3位置形成键连接。

Auristatin和多拉司他汀

在有些实施方案中，免疫缀合物包含与多拉司他汀(dolastatin)或多拉司他汀肽类似物或衍生物(例如auristatin)(美国专利No.5,635,483；5,780,588)缀合的抗体。多拉司他汀类和auristatin类已经显示出干扰微管动力学、GTP水解、及核和细胞分裂(Woyke et al(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12):3580-3584)且具有抗癌(美国专利No.5663149)和抗真菌活性(Pettit et al(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42:2961-2965)。多拉司他汀或auristatin药物模块可经由肽药物模块的N(氨基)末端或C(羧基)末端附着于抗体(WO02/088172)。

例示性的auristatin实施方案包括N-末端连接的单甲基auristatin药物模块DE和DF(US 7498298)。

肽药物模块可以选自下文通式D_E和D_F：

其中D_E和D_F的波形线指示抗体或抗体-接头构件的共价附着位点，且每个位置是独立的

R²选自H和C₁-C₈烷基；

R³选自H、C₁-C₈烷基、C₃-C₈碳环、芳基、C₁-C₈烷基-芳基、C₁-C₈烷基-(C₃-C₈碳环)、C₃-C₈杂环和C₁-C₈烷基-(C₃-C₈杂环)；

R⁴选自H、C₁-C₈烷基、C₃-C₈碳环、芳基、C₁-C₈烷基-芳基、C₁-C₈烷基-(C₃-C₈碳环)、C₃-C₈杂环和C₁-C₈烷基-(C₃-C₈杂环)；

R⁵选自H和甲基；

或者R⁴与R⁵一起形成碳环且具有通式-(CR^aR^b)_n-，其中R^a和R^b独立地选自H、C₁-C₈烷基和C₃-C₈碳环，而n选自2、3、4、5和6；

R⁶选自H和C₁-C₈烷基；

R⁷选自H、C₁-C₈烷基、C₃-C₈碳环、芳基、C₁-C₈烷基-芳基、C₁-C₈烷基-(C₃-C₈碳环)、C₃-C₈杂环和C₁-C₈烷基-(C₃-C₈杂环)；

每个R⁸独立地选自H、OH、C₁-C₈烷基、C₃-C₈碳环和O-(C₁-C₈烷基)；

R⁹选自H和C₁-C₈烷基；

R¹⁰选自芳基或C₃-C₈杂环；

Z为O、S、NH或NR¹²，其中R¹²为C₁-C₈烷基；

R¹¹选自H、C₁-C₂₀烷基、芳基、C₃-C₈杂环、-(R¹³O)_m-R¹⁴或-(R¹³O)_m-CH(R¹⁵)₂；

m是范围为1-1000的整数；

R¹³为C₂-C₈烷基；

R¹⁴为H或C₁-C₈烷基；

R¹⁵每次出现独立为H、COOH、-(CH₂)_n-N(R¹⁶)₂、-(CH₂)_n-SO₃H或-(CH₂)_n-SO₃-C₁-C₈烷基；

R¹⁶每次出现独立为H、C₁-C₈烷基或-(CH₂)_n-COOH；

R¹⁸选自-C(R⁸)₂-C(R⁸)₂-芳基、-C(R⁸)₂-C(R⁸)₂-(C₃-C₈杂环)和-C(R⁸)₂-C(R⁸)₂-(C₃-C₈碳环)；且

n是范围为0到6的整数。

在一个实施方案中，R³、R⁴和R⁷独立为异丙基或仲丁基，而R⁵为-H或甲基。在一个例示性的实施方案中，R³和R⁴各自为异丙基，R⁵为-H，而R⁷为仲丁基。在又一个实施方案中，R²和R⁶各自为甲基，而R⁹为-H。在又一个实施方案中，R⁸每次出现为-OCH₃。在一个例示性的实施方案中，R³和R⁴各自为异丙基，R²和R⁶各自为甲基，R⁵为-H，R⁷为仲丁基，R⁸每次出现为-OCH₃，而R⁹为-H。在一个实施方案中，Z为-O-或-NH-。在一个实施方案中，R¹⁰为芳基。在一个例示性的实施方案中，R¹⁰为-苯基。在一个例示性的实施方案中，若Z为-O-，则R¹¹为-H、甲基或叔丁基。在一个实施方案中，若Z为-NH，则R¹¹为-CH(R¹⁵)₂，其中R¹⁵为-(CH₂)_n-N(R¹⁶)₂，而R¹⁶为-C₁-C₈烷基或-(CH₂)_n-COOH。在另一个实施方案中，若Z为-NH，则R¹¹为-CH(R¹⁵)₂，其中R¹⁵为-(CH₂)_n-SO₃H。

通式D_E的一种例示性auristatin实施方案是MMAE，其中波形线指示共价附着至抗体-药物缀合物的接头(L)：

通式D_F的一种例示性auristatin实施方案是MMAF，其中波形线指示共价附着至抗体-药物缀合物的接头(L)(参见US>

其它例示性的实施方案包括在五肽auristatin药物模块的C末端具有苯丙氨酸羧基修饰的单甲基缬氨酸化合物(WO 2007/008848)和在五肽auristatin药物模块的C末端具有苯丙氨酸侧链修饰的单甲基缬氨酸化合物(WO2007/008603)。

其它药物模块包括以下MMAF衍生物，其中波形线指示共价附着至抗体-药物缀合物的接头(L)：

一方面，可以将亲水性基团在R¹¹处附着于药物模块，所述亲水性基团包括但不限于三乙二醇酯(triethylene>

包含auristatin/多拉司他汀或其衍生物的通式I ADC的例示性实施方案记载于US 7498298及Doronina et al.(2006)Bioconjugate Chem.17:114-124，明确收入本文作为参考。包含MMAE或MMAF及各种接头构件的通式I ADC的例示性实施方案具有如下结构和缩写(其中“Ab”是抗体；p是1到约8；“Val-Cit”是缬氨酸-瓜氨酸二肽；而“S”是硫原子)。

包含MMAF及各种接头构件的通式I ADC的例示性实施方案进一步包括Ab-MC-PAB-MMAF和Ab-PAB-MMAF。有趣的是，包含经不可蛋白水解切割的接头附着于抗体的MMAF的免疫缀合物显示出具有与包含经可蛋白水解切割的接头附着于抗体的MMAF的免疫缀合物相当的活性。参见Doroninaet al.(2006)Bioconjugate Chem.17:114-124。在这种情况中，认为药物释放是由细胞中的抗体降解来实现的。同上。

典型的是，基于肽的药物模块可通过在两个或多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备。此类肽键可依照例如肽化学领域众所周知的液相合成法来制备(参见E. and K.Lübke,“The Peptides”,volume1,pp 76-136,1965,Academic Press)。auristatin/多拉司他汀药物模块可依照以下文献中的方法来制备：US 2005-0238649 A1；美国专利No.5635483；美国专利No.5780588；Pettit et al(1989)J.Am.Chem.Soc.111:5463-5465；Pettit et al(1998)Anti-Cancer Drug Design13:243-277；Pettit,G.R.,et al.Synthesis,1996,719-725；Pettit et al(1996)J.Chem.Soc.Perkin Trans.1 5:859-863；及Doronina(2003)Nat.Biotechnol.21(7):778-784。

具体而言，通式D_F诸如MMAF及其衍生物的auristatin/多拉司他汀药物模块可以使用US>E诸如MMAE及其衍生物的auristatin/多拉司他汀药物模块可以使用Doronina>

加利车霉素

在其它实施方案中，免疫缀合物包含缀合有一个或多个加利车霉素分子的抗体。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度生成双链DNA断裂。关于加利车霉素家族缀合物的制备参见美国专利No.5,712,374；5,714,586；5,739,116；5,767,285；5,770,701；5,770,710；5,773,001；5,877,296(都授予美国Cyanamid公司)。可用的加利车霉素结构类似物包括但不限于γ₁^I、α₂^I、α₃^I、N-乙酰基-γ₁^I、PSAG和θ^I₁(Hinman>

其它细胞毒剂

可与抗体缀合的其它抗肿瘤剂包括蒽环类抗生素(Kratz et al(2006)Current Med.Chem.13:477-523；Jeffrey et al(2006)Bioorganic&Med.Chem.Letters 16:358-362；Torgov et al(2005)Bioconj.Chem.16:717-721；Nagy et al(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.97:829-834；Dubowchik et al(2002)Bioorg.&Med.Chem.Letters 12:1529-1532；King et al(2002)J.Med.Chem.45:4336-4343；US 6630579)、BCNU、链佐星(streptozoicin)、长春新碱(vincristine)、5-氟尿嘧啶、美国专利No.5,053,394、5,770,710中记载的统称为LL-E33288复合物的试剂家族、及埃斯波霉素类(esperamicins)(美国专利No.5,877,296)。

可用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordicacharantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(tricothecenes,trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公布的WO93/21232。

本发明还设想了抗体和具有核酸降解活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶，诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间形成的免疫缀合物。

在某些实施方案中，免疫缀合物可包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于生成放射缀合抗体。实例包括At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²、Zr⁸⁹和Lu的放射性同位素。在将免疫缀合物用于检测时，可包含放射性原子用于闪烁照相研究，例如Tc^99m或I¹²³，或是包含自旋标记物用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)，诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。

可以已知方式将放射性或其它标记物掺入免疫缀合物。例如，可生物合成肽，或是通过化学氨基酸合成法合成肽，其中使用涉及例如氟-19代替氢的合适氨基酸前体。可经肽中的半胱氨酸残基来附着标记物，诸如Tc^99m或I¹²³、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Zr⁸⁹和In¹¹¹。可以经赖氨酸残基来附着钇-90。IODOGEN法(Fraker>

在某些实施方案中，免疫缀合物可以包含缀合至前体药物活化酶的抗体，所述前体药物活化酶能将前体药物(例如肽基化疗剂，参见WO 81/01145)转变成活性药物，诸如抗癌药。此类免疫缀合物可用于抗体依赖性酶介导的前体药物疗法(“ADEPT”)。可以缀合至抗体的酶包括但不限于可将含磷酸盐/酯的前体药物转变为游离药物的碱性磷酸酶；可将含硫酸盐/酯的前体药物转变为游离药物的芳基硫酸酯酶；可将无毒5-氟胞嘧啶转变为抗癌药物5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；可将含肽的前体药物转变为游离药物的蛋白酶，诸如沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(诸如组织蛋白酶B和L)；可转化含D-氨基酸替代的前体药物的D-丙氨酰羧肽酶；可将糖基化前体药物转变为游离药物的碳水化合物切割酶类，诸如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；可将β-内酰胺衍生的药物转变为游离药物的β-内酰胺酶；及可将在其胺氮处分别用苯氧乙酰基或苯乙酰基衍生的药物转变成游离药物的青霉素酰胺酶，诸如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。可以通过本领域众所周知的重组DNA技术将酶共价结合至抗体。参见例如Neubergeret al.,Nature312:604-608(1984)。

药物载荷

药物载荷(loading)由p表示，即通式I的分子中每个抗体的平均药物模块数。药物载荷的范围可以为每个抗体1-20个药物模块(D)。通式I的ADC包括缀合有一定范围(1-20个)药物模块的抗体的集合。来自缀合反应的ADC制备物中每个抗体的平均药物模块数可以通过常规手段来表征，诸如质谱、ELISA测定法和HPLC。还可以测定ADC在p方面的定量分布。在有些情况中，将p为某数值时的同质ADC从具有其它药物载荷的ADC中分离、纯化和表征可以通过诸如反相HPLC或电泳的手段来实现。

对于有些抗体-药物缀合物，p可能受到抗体上附着位点数目的限制。例如，若附着是半胱氨酸硫醇，正如上文例示性实施方案中的那样，则抗体可能只有一个或数个半胱氨酸硫醇基，或者可能只有一个或数个有足够反应性的硫醇基，可附着接头。在某些实施方案中，较高的药物载荷，例如p>5，可引起某些抗体-药物缀合物的聚集、不溶性、毒性或丧失细胞通透性。在某些实施方案中，本发明ADC的药物载荷的范围为1到约8；约2到约6；或约3到约5。事实上，对于某些ADC已经显示了每个抗体的药物模块的最佳比率可以为小于8，可以为约2到约5。参见US 2005-0238649 A1。

在某些实施方案中，在缀合反应中少于理论最大值的药物模块缀合至抗体。抗体可包含例如赖氨酸残基，其不与药物-接头中间物或接头试剂起反应，如下文所讨论的。一般而言，抗体不包含许多游离的和反应性的半胱氨酸硫醇基，其可连接药物模块；事实上，抗体中的大多数半胱氨酸硫醇基以二硫桥形式存在。在某些实施方案中，可以在部分或完全还原性条件下用还原剂诸如二硫苏糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)还原抗体以产生反应性半胱氨酸硫醇基。在某些实施方案中，将抗体置于变性条件以暴露反应性亲核基团，诸如赖氨酸或半胱氨酸。

ADC的载荷(药物/抗体比率)可以以不同方式来控制，例如通过：(i)限制药物-接头中间物或接头试剂相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制缀合反应的时间或温度，和(iii)半胱氨酸硫醇修饰的部分或限制还原性条件。

应当理解，若超过一个亲核基团与药物-接头中间物或者与接头试剂和接下来的药物模块试剂起反应，则所得产物是具有一个或多个药物模块附着于抗体之分布的ADC化合物混合物。可以通过对抗体特异性的和对药物特异性的双重ELISA抗体测定法自混合物计算每个抗体的平均药物数。混合物中的各种ADC分子可以通过质谱来鉴定，并通过HPLC来分离，例如疏水相互作用层析(参见例如McDonagh et al(2006)Prot.Engr.Design&Selection19(7):299-307；Hamblett et al(2004)Clin.Cancer Res.10:7063-7070；Hamblett,K.J.等,“Effect of drug loading on the pharmacology,pharmacokinetics,andtoxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate,”摘要号624,AmericanAssociation for Cancer Research,2004 Annual Meeting,2004年3月27-31日,Proceedings of the AACR,卷45,March 2004；Alley,S.C.等,“Controlling thelocation of drug attachment in antibody-drug conjugates,”摘要号627,AmericanAssociation for Cancer Research,2004 Annual Meeting,2004年3月27-31日,Proceedings of the AACR,卷45,March 2004)。在某些实施方案中，可以通过电泳或层析从缀合混合物中分离具有均一载荷值的同质ADC。

制备免疫缀合物的某些方法

可以采用本领域技术人员知道的有机化学反应、条件和试剂通过数种路径来制备通式I的ADC，包括：(1)抗体的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应形成Ab-L，接着与药物模块D反应；和(2)药物模块的亲核基团与二价接头试剂反应，经共价键形成D-L，接着与抗体的亲核基团反应。经后一种路径制备通式I的ADC的例示性方法记载于US 2005-0238649 A1，明确收入本文作为参考。

抗体的亲核基团包括但不限于：(i)N末端胺基；(ii)侧链胺基，例如赖氨酸；(iii)侧链硫醇基，例如半胱氨酸；和(iv)糖基化抗体中糖的羟基或氨基。胺、硫醇和羟基是亲核的，能够与接头模块上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯和酸性卤化物；(ii)烷基和苄基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫键，即半胱氨酸桥。可通过还原剂诸如DTT(二硫苏糖醇)或三羰基乙基膦(TCEP)处理使抗体完全或部分还原，从而使抗体具有与接头试剂缀合的反应活性。每个半胱氨酸桥理论上将形成两个反应性硫醇亲核体。可经由赖氨酸残基的修饰将额外亲核基团引入抗体，例如通过使赖氨酸残基与2-亚氨基硫杂环戊烷(Traut氏试剂)起反应，导致胺转变为硫醇。可以通过导入一个、两个、三个、四个或更多个半胱氨酸残基(例如通过制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的变体抗体)而将反应性硫醇基导入抗体。

还可通过抗体上的亲电子基团(诸如醛或酮羰基)与接头试剂或药物上的亲核基团之间的反应来生成本发明的抗体-药物缀合物。接头试剂上的有用亲核基团包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼。在一个实施方案中，修饰抗体以导入能够与接头试剂或药物上的亲核取代基起反应的亲电子模块。在另一个实施方案中，可以用例如高碘酸盐氧化剂氧化糖基化抗体的糖，从而形成可与接头试剂或药物模块的胺基团反应的醛或酮基团。所得亚胺Schiff碱基可形成稳定的连接，或者可以用例如硼氢化物试剂还原而形成稳定的胺连接。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可以在抗体中生成羰基(醛基和酮基)，它可与药物上的适宜基团反应(Hermanson,BioconjugateTechniques)。在另一个实施方案中，包含N-末端丝氨酸或苏氨酸残基的抗体可以与偏高碘酸钠反应，导致在第一个氨基酸处生成醛(Geoghegan&Stroh,(1992)Bioconjugate Chem.3:138-146；US 5362852)。这样的醛可与药物模块或接头亲核体反应。

药物模块上的亲核基团包括但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼基团，它们能够与接头模块上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯和酸性卤化物；(ii)烷基和苯甲基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基和马来酰亚胺基团。

本发明的化合物明确涵盖但不限于用如下交联试剂制备的ADC：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB、及SVSB(琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，它们可通过商业途径获得(例如Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)。

还可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备包含抗体和细胞毒剂的免疫缀合物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta et al.,Science 238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的例示性螯合剂。参见WO94/11026。

或者，可通过例如重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒剂的融合蛋白。重组DNA分子可以包含各自编码缀合物的抗体和细胞毒部分的区域，彼此或是毗邻或是由编码接头肽的区域分开，该接头肽不破坏缀合物的期望特性。

在又一个实施方案中，可以将抗体与“受体”(诸如链霉亲合素)缀合从而用于肿瘤预先靶向，其中对患者施用抗体-受体缀合物，接着使用清除剂由循环中清除未结合的缀合物，然后施用与细胞毒剂(如放射性核苷酸)缀合的“配体”(如亲合素)。

药物配制剂

一方面，本发明还提供了包含至少一种本发明抗体和/或至少一种其免疫缀合物的药物配制剂。在有些实施方案中，药物配制剂包含：1)本发明的抗体和/或其免疫缀合物，和2)药学可接受载体。在有些实施方案中，药物配制剂包含：1)本发明的抗体和/或其免疫缀合物，和任选的2)至少一种别的治疗剂。别的治疗剂包括但不限于下文描述的那些。

包含本发明抗体或免疫缀合物的药物配制剂通过将具有期望纯度的抗体或免疫缀合物与任选的生理学可接受载体、赋形剂或稳定剂(《Remington'sPharmaceutical Sciences》，第16版，Osol,A.编，1980)混合来制备成水溶液或冻干剂型或其它干燥剂型的形式供贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，并且包括：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、组氨酸和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯己双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。用于体内施用的药物配制剂一般是无菌的。这易于通过无菌滤膜过滤来实现。

活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于Remington's PharmaceuticalSciences,第16版,Osol,A.编(1980)。

可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有本发明抗体或免疫缀合物的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸的聚合物能够释放分子达100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当所封装的抗体或免疫缀合物在体内长时间维持时，它们可能由于暴露于37℃的潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性损失和免疫原性可能改变。可以根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如，如果发现聚集机制是经由硫-二硫化物互换的分子间S-S键形成，那么可通过修饰巯基、自酸性溶液冻干、控制含水量、使用适宜添加剂和开发特定聚合物基质组合物来实现稳定化。

可以以任何合适形式配制抗体以投递至靶细胞/组织。例如，抗体可以配制成免疫脂质体。“脂质体”指由各种类型脂质、磷脂和/或表面活性剂构成的，可用于对哺乳动物递送药物的小囊泡。与生物膜的脂质排列相似，脂质体的成分通常排列成双层形式。含有抗体的脂质体可通过本领域已知方法来制备，诸如Epstein et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688(1985)；Hwang etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030(1980)；美国专利4,485,045和4,544,545；及WO 97/38731，公开于1997年10月23日中所述。循环时间延长的脂质体披露于美国专利5,013,556。

可用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂类组合物通过反相蒸发法生成特别有用的脂质体。将脂质体挤过具有设定孔径的滤器，产生具有期望直径的脂质体。可如Martin et al.,J.Biol.Chem.257:286-288(1982)中所述，将本发明抗体的Fab’片段经二硫化物交换反应与脂质体缀合。任选在脂质体中包含化疗剂。参见Gabizon et al.,J.National CancerInst.81(19):1484(1989)。

在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的如本文中所描述的抗体，所述酶活性毒素包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(tricothecenes,trichothecenes)。

在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与放射性原子缀合以形成放射性缀合物的如本文中所描述的抗体。多种放射性同位素可用于生成放射性缀合物。例子包括Zr⁸⁹、At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²和Lu的放射性同位素。在使用放射性缀合物进行检测时，它可以包含供闪烁法研究用的放射性原子，例如tc99m或I123，或供核磁共振(NMR)成像(又称为磁共振成像，mri)用的自旋标记物，诸如再一次的碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。

可以使用多种双功能蛋白质偶联剂来生成抗体和细胞毒剂的缀合物，诸如N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可以如Vitetta等,Science 238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感性接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫化物接头(Chari等,Cancer Res 52:127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。

本文中的免疫缀合物或ADC明确涵盖，但不限于用交联试剂制备的此类缀合物，所述交联试剂包括但不限于BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC、和sulfo-SMPB，及SVSB(琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，它们是商品化的(例如，来自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)。

药物配制剂

通过混合具有期望纯度的此类抗体与一种或多种任选的药学可接受载体(Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980))混合以冻干配制剂或水性溶液形式制备如本文中所描述的抗ETBR抗体的药物配制剂。一般地，药学可接受载体在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括但不限于缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文中的例示性的药学可接受载体进一步包含间质药物分散剂诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(,Baxter International,Inc.)。某些例示性的sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20记载于美国专利公开文本No.2005/0260186和2006/0104968。在一方面，将sHASEGP与一种或多种别的糖胺聚糖酶诸如软骨素酶组合。

例示性的冻干抗体配制剂记载于美国专利No.6,267,958。水性抗体配制剂包括那些记载于美国专利No.6,171,586和WO2006/044908的，后一种配制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲液。

本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性组分，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的组分。例如，可能期望进一步提供BRAF抑制剂，MEK抑制剂或抗CTLA-4抗体，ipilimumab。此类活性组分适于以有效用于所需目的的量而组合存在。

活性成分可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)，在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)，或在粗滴乳状液中。此类技术披露于例如Remington'sPharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.编(1980)。

可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适的例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形商品形式，例如膜，或微胶囊。

用于体内施用的配制剂一般是无菌的。无菌性可容易地实现，例如通过穿过无菌滤膜过滤。

治疗性方法和组合物

可以在治疗性方法中使用本文中提供的任何抗ETBR抗体。

一方面，提供了抗ETBR抗体，作为药物使用。另一方面，所述方法提供与BRAF抑制剂组合的抗ETBR抗体，作为药物有用。又一方面，此类组合可用于治疗黑素瘤和/或转移性黑素瘤。在某些实施方案中，提供与BRAF抑制剂组合的抗ETBR抗体，在治疗方法中使用。在某些实施方案中，本发明提供抗ETBR抗体，在治疗具有黑素瘤和/或转移性黑素瘤的个体的方法中使用，包括对该个体施用有效量的该抗ETBR抗体和有效量的BRAF抑制剂。在一个此类实施方案中，该方法进一步包括对该个体施用有效量的至少一种别的治疗剂，例如下文描述的，添加至描述的组合。在又一些实施方案中，本发明提供与BRAF抑制剂组合的抗ETBR抗体，在肿瘤生长抑制(TGI)中使用。在某些实施方案中，本发明提供与BRAF抑制剂组合的抗ETBR抗体，在受试者中抑制肿瘤生长的方法中使用，包括对该受试者施用有效量的与BRAF抑制剂组合的抗ETBR抗体以抑制肿瘤生长。依照任何上述实施方案的“受试者”优选为人。

又一方面，本发明提供与BRAF抑制剂组合的抗ETBR抗体在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于治疗黑素瘤和/或转移性黑素瘤。在又一个实施方案中，该药物用于治疗黑素瘤和/或转移性黑素瘤的方法，包括对具有黑素瘤和/或转移性黑素瘤的个体施用有效量的该药物。在一个此类实施方案中，该方法进一步包括对该个体施用有效量的至少一种别的治疗剂，例如下文描述的。在又一个实施方案中，该药物用于肿瘤生长抑制。在又一个实施方案中，该药物用于个体中肿瘤生长抑制的方法，包括对该个体施用有效量的该药物以抑制肿瘤生长。依照任何上述实施方案的“个体”可以为人。

在又一方面，本发明提供了药物配制剂，其包含本文中提供的任何抗ETBR抗体，例如与BRAF抑制剂组合在任何上述治疗性方法中使用。在一个实施方案中，药物配制剂包含与BRAF抑制剂组合的本文中提供的任何抗ETBR抗体和药学可接受载体。在另一个实施方案中，药物配制剂包含与BRAF抑制剂组合的本文中提供的任何抗ETBR抗体和至少一种别的治疗剂，例如如下文所描述的。

可以单独或与疗法中的其它药剂组合使用本发明的抗体。例如，可以与至少一种别的治疗剂共施用本发明的抗体。在某些非限制性实施方案中，别的治疗剂为BRAF抑制剂，MEK抑制剂，或抗CTLA-4抗体，诸如例如ipilimumab。

上文记录的此类联合疗法涵盖联合施用(其中两种或更多种治疗剂包含在相同或不同配制剂中)，和分开施用，在该情况中，可以在施用别的治疗剂和/或辅助剂之前、同时和/或之后施用本发明的抗体。也可以与放射疗法组合使用本发明的抗体。

可以通过任何合适的手段，包括胃肠外、肺内、和鼻内，及若期望用于局部治疗的话，损伤内施用来施用本发明的抗体(和任何别的治疗剂，诸如例如BRAF抑制剂)。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内、或皮下施用。部分根据施用是短暂的还是长期的，剂量给药可以通过任何合适的路径，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射进行。本文中涵盖各种剂量给药日程表，包括但不限于单次施用或在多个时间点里的多次施用、推注施用、和脉冲输注。或者，可以口服施用BRAF抑制剂，以片剂或胶囊剂或液态形式。

本发明的抗体会以一种符合良好的医学实践的方式配制、确定剂量及给药。关于这一点考虑的因素包括在治疗的特定病症、在治疗的特定哺乳动物、患者个体的临床状态、病症的起因、药物递送部位、给药方法、给药日程以及其它为开业医生所知的因素。抗体无需但可任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所述病症的药物一起配制。上述其它药物的有效量取决于制剂中所存在的抗体的量、病症或治疗的类型、以及其它上述讨论的因素。这些药物通常以与本文所述相同的剂量和给药途径使用，或以约1-99％的本文所述剂量使用，或以任何剂量并通过任何途径使用，所述剂量和途径是凭经验/临床确定为合适的。

为了预防或治疗疾病，本发明的抗体(当单独或与一种或多种其它别的治疗剂联合使用时)的合适剂量会取决于所要治疗的疾病的类型、抗体的种类、疾病的严重性和病程、所给予抗体的预防或治疗目的、之前的治疗、患者的临床史和对抗体的应答、以及主治医师的斟酌决定。一次或在一系列治疗里对患者适当施用抗体。根据疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)抗体可以是对患者施用的初始候选剂量，无论例如通过一次或多次分开施用，或者通过连续输注进行。根据上文所提及的因素，一种典型的每日剂量的范围可以是约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于几天或更长里的重复施用，根据状况，一般会持续治疗，直至发生对疾病症状的期望抑制。抗体的一种例示性剂量会在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围中。如此，可以对患者施用一或多剂的约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)。可以例如每周或每三周间歇施用此类剂量(例如使得患者接受约2至约20，或例如约6剂抗体)。可以施用初始的较高加载剂量，接着是较低的一或多剂。然而，其它剂量给药方案可能是有用的。通过常规的技术和测定法容易监测此疗法的进展。

制品

在本发明的另一方面，提供了一种制品，其含有可用于治疗、预防和/或诊断上文所描述的病症的材料。制品包含容器和容器上或与容器联合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、管形瓶、注射器、IV溶液袋、等等。容器可以由多种材料诸如玻璃或塑料形成。容器容纳单独或与另一种组合物组合有效治疗、预防和/或诊断状况的组合物，并且可以具有无菌存取口(例如，容器可以是具有由皮下注射针可穿过的塞子的管形瓶或静脉内溶液袋)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装插页指示使用组合物来治疗选择的状况。此外，制品可以包含(a)其中装有组合物的第一容器，其中组合物包含本发明的抗体；和(b)其中装有组合物的第二容器，其中组合物包含别的细胞毒性或其它方面治疗性的药剂。在本发明的此实施方案中的制品可以进一步包含包装插页，其指示可以使用组合物来治疗特定的状况。或者/另外，制品可以进一步包含第二(或第三)容器，其包含药学可接受缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、Ringer氏溶液和右旋糖溶液。它可以进一步包含从商业和用户观点看期望的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针、和注射器。

表2：序列

实施例

下面是本发明的方法和组合物的实施例。要理解，鉴于上文提供的一般描述，可实施各种其它实施方案。

实施例1：抗ETBR>

在表达相对较低ETBR拷贝数(在细胞系A2058(得自美国典型培养物保藏中心)的情况中)或较高ETBR拷贝数(在细胞系UACC-257X2.2的情况中)的黑素瘤细胞系上体外评估抗ETBR抗体-ADC候选物Hu5E9v1-ADC。UACC-257X2.2细胞系是亲本UACC-257细胞系(NCI-Frederick癌症DCT肿瘤储存库)的一种衍生物，为体内生长进行了优化。在雌性NCr裸鼠的右体侧中皮下注射亲本UACC-257细胞，收获并解离一个肿瘤，体外培养产生UACC-257X1.2细胞系。再次在雌性NCr裸鼠的右体侧中皮下注射UACC-257X1.2系，试图改善细胞系的生长。自这项研究收集一个肿瘤，并再次适应体外生长以产生UACC-257X2.2细胞系。此细胞系表达高水平的ET_BR，如通过流式细胞术测定的。如下评估这些细胞系中受体水平与Hu5E9v1-vc-MMAE细胞杀伤的关系。

在适宜的培养基中于37℃和5％ CO₂培养黑素瘤细胞系A2058和UACC-257X2.2。为了评估Hu5E9v1-ADC对细胞存活力的影响，在96孔透明底黑色板中在50μL普通生长培养基中以1,500每孔分配细胞。24小时后，将另外50μL含有Hu5E9v1-ADC浓缩液的连续稀释液的培养基添加至一式三份孔。5天后，使用CellTiter-Glo发光细胞存活力试剂(G7572；PromegaCorporation)及EnVision>

实施每个细胞的抗体结合位点的测定(Scatchard分析)：通过将黑素瘤细胞与固定浓度的¹²⁵I标记的Hu5E9v1-ADC和渐增浓度的未标记的Hu5E9v1-ADC的组合一起在冰上温育4小时，评估亲和常数和每个抗体的细胞表面结合位点数。使用分析程序方法通过非线性曲线拟合分析数据。

如图2A和2B所示，通过Scatchard分析，A2058和UACC-257X2.2上Hu5E9v1-ADC结合位点的数目分别估算为每个细胞1,582个和33,939个位点。相对于对照ADC，用抗ETBR ADC候选物滴定这些细胞系显示出特异性细胞杀伤，大体与ETBR表达水平成比例。

实施例2：抗ETBR>

基于上文实施例1中描述的研究，选择黑素瘤细胞系A2058和UACC-257X2.2作为代表广泛ETBR表达的体内抗肿瘤活性研究的合适模型。UACC-257X2.2黑素瘤细胞系是亲本UACC-257黑素瘤细胞系(国家癌症研究所(NCI))的一种衍生物，为体内生长进行了优化。具体而言，在雌性NCr裸鼠的右体侧中皮下注射亲本UACC-257细胞，收获一个肿瘤并在体外培养，产生UACC-257X1.2细胞系。再次在雌性NCr裸鼠的右体侧中皮下注射UACC-257X1.2系，试图改善细胞系的生长。自这项研究收集一个肿瘤，并再次适应体外生长以产生UACC-257X2.2细胞系。此细胞系及自此系衍生的肿瘤表达与亲本细胞系UACC-257相当的ETBR(数据未显示)。

接着，在上文描述的异种移植物小鼠模型中使用黑素瘤细胞系实施功效研究。所有研究依照实验室动物护理和使用指南(Ref:Institute of LaboratoryAnimal Resources(NIH publication no.85-23)，Washington，DC:NationalAcademies Press；1996)进行。给来自Charles River Laboratories的10至14周龄雌性CRL Nu/Nu或NCr裸鼠在右背体侧中皮下接种在HBSS及Matrigel中的5X 10⁶个UACC-257X2.2细胞或在HBSS及Matrigel中的5>6个A2058细胞。当肿瘤体积达到大约200mm³时(第0天)，将动物随机化入各组，每组10只。

对于单药功效研究，在第0天作为单一静脉内(IV)注射以1mpk，3mpk，或6mpk(mg/kg)施用抗ETBR ADC候选物Hu5E9v1-ADC。还施用对照ADC抗体和媒介对照。自每组10只动物测定平均肿瘤体积及标准偏差。每周两次测量肿瘤体积直至研究终点。

结果显示于图3A(高ETBR拷贝数UACC-257X2.2细胞系)和3B(低ETBR拷贝数细胞系A2058)。与实施例1中描述的体外细胞杀伤实验一致，UACC-257X2.2异种移植物肿瘤对Hu5E9v1-ADC的响应更大。虽然以1mg/kg剂量给药的组功效不明显，但是观察到响应单剂3和6mg/kg Hu5E9v1-ADC的持久肿瘤消退(图3A)。

将3和6mg/kg剂量的Hu5E9v1-ADC，6mg/kg剂量的对照ADC或媒介对照施用于携带低ETBR拷贝数A2058肿瘤的动物。相对于匹配剂量的对照ADC或媒介，在高剂量6mpk的Hu5E9v1-ADC观察到肿瘤负荷的部分缩小。以3mg/kg Hu5E9v1-ADC剂量给药的组功效不明显。如此，代表人黑素瘤中ETBR表达谱低端的A2058异种移植物模型(Asundi et al，2011)中肿瘤负荷的缩小提示作为单药用候选物Hu5E9v1-ADC在对应于人黑素瘤中遭遇的ETBR全表达范围的肿瘤中能实现功效。

实施例3：BRAF抑制剂药物对ETBR表达水平的影响

在代表黑素瘤的各种遗传背景(诸如BRAF突变型(V600E)，BRAF野生型和RAS突变型(Q61L))的多种黑素瘤细胞中评估BRAF抑制剂药物对ETBR转录物和蛋白质(总蛋白和细胞表面蛋白)表达水平的影响。

通过在4孔盘上将适宜药物体积添加至培养中的细胞达24小时，用不同浓度的BRAF抑制剂药物(“BRAFi”)(具体是RG7204)处理黑素瘤细胞系UACC-257X2.2，A2058，COLO 829，IPC-298(ATCC)。

为了测定BRAFi对ETBR和对照核糖体蛋白L19(RPL19)转录物水平的影响，实施下述实验。通过刮擦自板收获用RG7204处理24小时的细胞，并使用Qiashredder和RNeasy迷你试剂盒(79654,74104,Qiagen,Valencia,CA)为总RNA进行加工。使用来自Applied Biosystems(ABI,Foster City,CA)的试剂设立Taqman测定法，并使用来自ABI的7500实时PCR仪和软件进行测定。引物-探针集设计成用报告染料FAM和淬灭染料TAMRA双重标记的发荧光探针侧翼为引物。

用于RPL19的引物-探针集如下：

正向引物-5’AGC GGA TTC TCA TGG AAC A(SEQ ID NO:11)；反向引物-5’CTG GTC AGC CAG GAG CTT(SEQ ID NO:12)和探针-5’TCC ACAAGC TGA AGG CAG ACA AGG(SEQ ID NO:13)。

用于ETBR的引物-探针集如下：

正向引物-5’TCA CTG AAT TCC TGC ATT AAC C(SEQ ID NO:14)，反向引物-5’GCA TAA GCA TGA CTT AAA GCA GTT(SEQ ID NO:15)和探针-5’AAT TGC TCT GTA TTT GGT GAG CAA AAG ATT CAA(SEQ IDNO:16)。

UACC-257X2.2的结果显示于图4A，A2058的结果显示于图8A，而COLO829的结果显示于图6A。这些结果证明与未添加BRAFi RG7204的对照细胞相比，用BRAFi RG7204处理24小时看来在测试的所有细胞系中提高ETBR转录物。

为了测试BRAFi处理所致ETBR转录物升高是否还导致ETBR总蛋白水平的任何变化，对如上所述用BRAFi RG7204处理的相同细胞系实施Western印迹实验。对于Western印迹，使用下述试剂：用于检测蛋白质：内部生成的抗ETBR单克隆抗体1H1.8.5，抗磷酸-p44/42MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)抗体(9101,Cell Signaling Technology)，抗p44/42MAPK(Erk1/2)抗体(9102,Cell Signaling Technology)和作为对照的家兔多克隆抗GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)抗体(PA1-987；Affinity Bioreagents)和小鼠单克隆抗β-微管蛋白抗体(556321,BD Pharmingen)。UACC-257X2.2的结果显示于图4B，A2058的结果显示于图8B，COLO 829的结果显示于图6B，而IPC-298的结果显示于图10。这些结果证明与未添加BRAFi的对照细胞相比，用BRAFi RG7204处理24小时看来在测试的UACC-257X2.2，A2058，和COLO 829细胞系中提高ETBR总蛋白水平。然而，对于BRAF为野生型且RAS为突变型(Q61L)的细胞系IPC-298，在各种BRAFi剂量水平上比较时，BRAFi看来没有提高ETBR水平，而是它看来刺激磷酸-ERK水平，如图10所示。

为了确定观察到的BRAFi处理所致总ET_BR蛋白水平升高是否还导致ET_BR表面蛋白水平升高，实施荧光活化细胞分选(FACS)分析。在含2.5mmol/L>BR抗体Hu5E9v1一起温育1小时，接着是抗人IgG荧光检测试剂(A11013；Invitrogen)。然后用FACS>BR蛋白的表面水平。然而，对于细胞系IPC-298，BRAFi>

实施例4：BRAF抑制剂药物对抗ETBR>

鉴于上文实施例3中展现的结果，测试BRAF抑制剂药物对抗ET_BR>3，此时将动物随机化入各组，每组10只。每天一次口服施用适宜媒介对照(Klucel>

自每组10只动物测定平均肿瘤体积。每周两次测量肿瘤体积，直至研究终点。使用UltraCal IV测径器(Model 54 10 111,Fred V.Fowler Company；Newton,MA)在两个维度(长度和宽度)上测量肿瘤体积。用12.2.8版Excel(Microsoft；Redmond,WA)使用下式计算肿瘤体积：

肿瘤体积(mm³)＝(长x宽²)x0.5。

为了分析随时间来自相同动物的肿瘤体积的重复测量，使用混合建模线性混合效应(LME)办法(Pinheiro et al.2009)。这种办法能解决重复测量和研究终点之前非处理相关动物终止所致中等退出率二者。在每个剂量水平使用三次回归样条将非线性概况拟合至log2肿瘤体积的时间过程。然后在混合模型内将这些非线性概况与剂量关联起来。使用下式，以相对于媒介的百分比拟合曲线下面积(AUC)/天，计算作为媒介百分比的肿瘤生长抑制(TGI)：

使用此式，TGI值100％指示肿瘤停滞，>1％但<100％指示肿瘤生长延迟，而>100％指示肿瘤消退。为了得到％TGI的不确定性区间(UI)，使用拟合曲线和拟合协方差矩阵生成随机样本，作为％TGI分布的的近似。该随机样本由拟合-混合模型的1000次模拟实现构成，其中对于每次实现重新计算％TGI。在这里，报告的UI中是％TGI的重新计算值根据该拟合模型有95％的机会会落在此区域中的数值。使用模拟分布的2.5和97.5百分位作为上和下UI。

结果显示于5A，5B，5C，5D和5E。Hu5E9v1-ADC和BRAFi-945的所有组合展示比单独作为单药的任一药物更好的功效。两种药物在测试的最低水平组合时给出的组合功效与在测试的最高剂量水平实现的组合功效几乎无法区分。

实施例5：抗ETBR>的剂量测试

上述实施例中描述的研究容许改进Hu5E9v1-ADC与BRAF抑制剂药物RG7204的体内组合功效的评估。预期药物之间没有拮抗作用，因此在更低的剂量测试药物的组合功效。选择COLO 829异种移植物模型作为中等水平的ET_BR表达的代表，进一步提高组合研究的严格性。使肿瘤生长至平均尺寸大约200mm³，此时将动物随机化入各组，每组9只。每天两次口服施用适宜媒介对照(Klucel>

中间范围剂量的两种药物(30mg/kg RG7204和3mg/kg Hu5E9v1-ADC)较好地组合在一起，给出比单独的任一药物更多的组合功效。两种药物在更低剂量的其它组合趋于相似，唯一的例外是测试的最低剂量的组合。

实施例6：抗ETBR>量测试

测试Hu5E9v1-ADC和RG7204在A2058异种移植物模型中的功效。由于代表高水平的严格性，对此模型特别感兴趣。A2058异种移植物模型代表在黑素瘤患者中找到的ETBR表达谱的低端，由此使之成为实现抗ETBR ADC功效有挑战性的模型。而且，尽管处于BRAF V600E突变状态，此模型已证明不响应RG7204，体外杀伤功效>20μM(数据未显示)。

使肿瘤生长至平均尺寸大约200mm³，此时将动物随机化入各组，每组10只。每天两次口服施用适宜媒介对照(Klucel>

结果显示在测试的所有情况中，Hu5E9v1-ADC和RG7204的组合展现比单独的任何单药更大的功效。单独的10mg/kg剂量的RG7204针对A2058模型没有显示单药功效(见图9A和9C)。然而，在与6mg/kg剂量的Hu5E9v1-ADC组合时，实现比单独的任一药剂更好的功效(见图9A和9C)。10mg/kgRG7204与6mg/kg Hu5E9v1-ADC的组合(图9A)展现的组合功效与在测试的最高剂量水平(即30mpk RG7204和6mpk Hu5E9v1-ADC)实现的组合功效几乎无法区分，如图9B所示。

表3汇总如上所述在不同剂量测试的三种黑素瘤异种移植物模型以展现组合效果，表述为组合使用抗ETBR ADC与BRAF抑制剂与作为单药的抗ETBR ADC的％TGI或作为单药的BRAF抑制剂的％TGI相比的％Δ(最后一栏)。如上所述使用线性混合效应(LME)建模办法计算％TGI。

实施例7：MEK抑制剂药物对ETBR表达水平的影响

在BRAF野生型或突变型和/或RAS野生型或突变型的多种黑素瘤细胞中评估MEK抑制剂药物对ETBR转录物和蛋白质(总蛋白和细胞表面蛋白)表达水平的影响：COLO829(BRAF^V600E)，A2058(BRAF^V600E)，SK23-MEL(BRAF^WT/RAS^WT)，或IPC-298(BRAF^WT/RAS^C61L)。

通过在4孔盘中将适宜药物体积添加至培养中的细胞达24小时，用不同浓度(0μM，0.01μM，0.1μM或1μM)的MEK抑制剂药物(“MEKi-973”或“MEKi-623”)处理黑素瘤细胞系A2058，COLO 829，SK23-MEL和IPC-298(ATCC)。

为了测定MEKi对ETBR转录物水平的影响，如上文实施例3所述实施下述实验。通过刮擦自板收获用MEKi-973处理24小时的细胞，并使用Qiashredder和RNeasy迷你试剂盒(79654,74104,Qiagen,Valencia,CA)为总RNA进行加工。使用来自Applied Biosystems(ABI,Foster City,CA)的试剂设立Taqman测定法，并使用来自ABI的7500实时PCR仪和软件进行测定。引物-探针集设计成用报告染料FAM和淬灭染料TAMRA双重标记的发荧光探针侧翼为引物。

用于RPL19的引物-探针集如下：

正向引物-5’AGC GGA TTC TCA TGG AAC A(SEQ ID NO:11)；反向引物-5’CTG GTC AGC CAG GAG CTT(SEQ ID NO:12)和探针-5’TCC ACAAGC TGA AGG CAG ACA AGG(SEQ ID NO:13)。

用于ETBR的引物-探针集如下：

正向引物-5’TCA CTG AAT TCC TGC ATT AAC C(SEQ ID NO:14)，反向引物-5’GCA TAA GCA TGA CTT AAA GCA GTT(SEQ ID NO:15)和探针-5’AAT TGC TCT GTA TTT GGT GAG CAA AAG ATT CAA(SEQ IDNO:16)。

A2058的结果显示于图14A(用所示剂量的MEKi-623处理)和14B(用所示剂量的MEKi-973处理)。这些结果证明与未添加MEK抑制剂的对照细胞相比，用MEK抑制剂处理24小时看来提高ETBR转录物。

为了测试MEKi处理所致ETBR转录物升高是否还导致ETBR总蛋白水平的任何变化，对如上所述用MEKi-973处理的细胞系COLO829(BRAF^V600E)，A2058(BRAF^V600E)，SK23-MEL(BRAF^WT/RAS^WT)，或IPC-298(BRAF^WT/RAS^C61L)实施Western印迹实验。对于Western印迹，使用下述试剂：用于检测蛋白质：内部生成的抗ETBR单克隆抗体1H1.8.5，抗磷酸-p44/42MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)抗体(9101,Cell>

为了确定观察到的MEKi处理所致总ET_BR蛋白水平升高是否还导致ET_BR表面蛋白水平升高，如上所述实施荧光活化细胞分选(FACS)分析。在含2.5mmol/L>BR抗体Hu5E9v1一起温育1小时，接着是抗人IgG荧光检测试剂(A11013；Invitrogen)。然后用FACSCalibur流式细胞仪(BD>BR蛋白的表面水平。

实施例8：MEK抑制剂药物对抗ETBR>

鉴于上文实施例7中展现的结果，测试本文中描述的MEK抑制剂对抗ET_BR>

结果显示于图17A-B，图21，图24和图25。令人惊讶的是，测试的Hu5E9v1-ADC和MEK抑制剂的所有组合展现比单独作为单药的任一药物的叠加功效更多的功效。

实施例9：A2058和COLO>

在图7所示研究终点收集的肿瘤(COLO 829对组合抗ETBR-ADC和BRAFi RG7204)没有显示ETBR升高。这可能是由于肿瘤收集的时机(第34天)大大超出施用的BRAFi药物的排除期这一事实。为了评估BRAFi/MEKi对细胞系的体外影响(即ETBR升高和Perk降低)是否也发生于体内并因此容许抗ETBR ADC和BRAFi/MEKi组合的更大功效，实施下述实验。

使A2058或COLO 829肿瘤生长至平均尺寸大约200mm³，此时将动物随机化入各组，每组5-6只。对于BRAFi>

用于参照基因Hprt1(次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1)的引物-探针集如下：

正向引物-5’CAC ATC AAA GAC AGC ATC TAA GAA(SEQ ID NO:17)；反向引物-5’CAA GTT GGA AAA TAC AGT CAA CAT T(SEQ ID NO:18)和探针-5’TTT TGT TCT GTC CTG GAA TTA TTT TAG TAG TGT TTC A(SEQID NO:19)。

用于ETBR的引物-探针集如下：

正向引物-5’TCA CTG AAT TCC TGC ATT AAC C(SEQ ID NO:14)，反向引物-5’GCA TAA GCA TGA CTT AAA GCA GTT(SEQ ID NO:15)和探针-5’AAT TGC TCT GTA TTT GGT GAG CAA AAG ATT CAA(SEQ IDNO:16)。

用于参照基因GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)的引物-探针集如下：

正向引物-5’GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC(SEQ ID NO:20)，反向引物-5’GAA GGT GAA GGT CGG AGT C(SEQ ID NO:21)，和探针-5’CAAGCT TCC CGT TCT CAG CC(SEQ ID NO:22)。

图27A显示与对照媒介相比，BRAFi在体内诱导ETBR mRNA。图27B显示与对照媒介相比，MEKi-973同样在体内诱导ETBR mRNA。

使用下述试剂通过Western印迹评估肿瘤中的磷酸化erk和总erk蛋白水平：用于检测蛋白质：抗磷酸-p44/42 MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)抗体(9101,Cell Signaling Technology)，抗p44/42 MAPK(Erk1/2)抗体(9102,CellSignaling Technology)和作为对照的小鼠单克隆抗β-微管蛋白抗体(556321,BD Pharmingen)(图26)。这里，与对照相比，BRAFi看来在体内抑制Perk。

虽然出于清楚理解的目的，前述发明已经通过例示和例子较为详细地进行了描述，但是说明书和实施例不应解释为限制本发明的范围。通过述及明确地完整收录本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容。

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