HBV聚合酶突变体

摘要

本发明涉及聚合酶HBV突变体多肽，其包含聚合酶活性被功能性破坏的突变的聚合酶结构域，以及涉及包含此种聚合酶突变体多肽的融合蛋白。本发明还涉及用于表达所述聚合酶突变体多肽的核酸分子和表达载体，以及涉及组合物，所述组合物可用于提高对HBV的免疫应答且目标在于提供针对HBV感染的保护性或治疗性作用。

说明书

发明领域

本发明涉及聚合酶HBV突变体多肽，其包含聚合酶活性被功能性破坏 的突变的聚合酶结构域，以及涉及包含此种聚合酶突变体多肽的融合蛋白。 本发明还涉及用于表达所述聚合酶突变体多肽的核酸分子和表达载体，以 及涉及组合物，所述组合物可用于提高对HBV的免疫应答且目标在于提供 针对HBV感染的保护性或治疗性作用。本发明很特别的兴趣在于免疫治疗 领域,更特别是用于治疗感染了HBV的患者，尤其是慢性感染的那些。

发明背景

乙型肝炎是重要的公众健康问题，全世界有超过3亿5千万人慢性感 染,其中的20-40%有发展为慢性肝疾病、肝硬化和肝细胞癌的风险。尽管 存在有效的保护性疫苗,但是乙肝病毒(HBV)感染在许多国家(甚至是一些 发达国家)依然泛滥,据估计全世界每年有四百五十万的新感染病例。与 WHO所建议的进行全面疫苗接种不同的是,全疗程疫苗接种的覆盖为亚洲 的25%至欧洲的75-90%不等。目前乙型肝炎是第十位的致死原因(每年大约 一百万例死亡)，而HBV相关的肝癌则排名第五位最常见的癌症。HBV感 染的地理分布并不平衡，在西方国家的患病率低于1%，而在东南国家、非 洲大部及赤道以南的美洲超过10%。

乙肝病毒是嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)成员并主要感染肝,在肝 细胞中复制。感染性颗粒是所谓的42-45nm的“丹氏粒(Dane particle)”，由 外部的脂蛋白包膜(具有三个不同的表面蛋白(HB))和内部的核壳体组成, 其主要结构蛋白是核心蛋白(HBcAg)。在核壳体内是连至病毒聚合酶蛋白(P) 的单拷贝的HBV基因组。除42–45nm的病毒粒体外,HBV感染患者的血液 还含有由HBsAg和宿主衍生的脂质所构成的20-nm的球体，其由感染的细 胞释放。这些球体在数目上以10⁴–10⁶的量级超过病毒粒体。

在病毒粒体进入肝细胞之后,通过目前仍未知的受体,核壳体将基因 组HBV DNA转运至核,在此松弛环状DNA转变为共价闭合环状DNA (cccDNA)。所述cccDNA作为模板用于四个病毒RNA的转录,所述四个病 毒RNA被输出至细胞质并被用作mRNA以用于HBV蛋白的翻译。最长的 (前基因组)RNA也作为模板用于HBV复制,这在细胞质中于核壳体内发 生。一些含有HBV DNA和聚合酶的壳体继而被转运回核,其在此释放新生 成的松弛环状DNA以形成另外的cccDNA。cccDNA具有比肝细胞长的半 衰期，其负责HBV的存续。其它壳体通过出芽至内质网内而被包膜并在穿 过高尔基复合体之后被分泌。

HBV基因组的结构和功能组织已经被研究了超过30年。HBV基因组 是松弛环状部分双链的DNA(大约3,200个核苷酸)，其由全长的负链和较短 的正链组成。其含有4个重叠的开放阅读框(ORF),C、S、P和X。C ORF 编码核心蛋白(或HBcAg,构成核壳体的183个氨基酸长的蛋白)和病毒复制 期间在患者血清中发现的第二种蛋白(已知为HBeAg，含有前核N-端延伸 和部分的HBcAg)。核心蛋白的C-端很具碱性并且含有4个据推测结合核酸 的Arg富集结构域以及许多磷酸化位点。S ORF编码三个表面蛋白，其全 都具有相同的C端但在其N端由于存在三个符合读框的ATG启动子而有差 异，所述三个符合读框的ATG启动子将S ORF分为三个区域,分别为S(226 个氨基酸)、前-S2(55个氨基酸)和前-S1(108个氨基酸)。大表面抗原蛋白(L) 在第一个ATG启动子处起始翻译之后产生，并且包含389个氨基酸残基 (preS1-preS2-S)。中等表面抗原蛋白(M)得自S区域和pre-S2区域的翻译(在 第二个启动子ATG处起始)，而226个氨基酸的小表面抗原蛋白(S,也命名 为HBsAg)得自S区域的翻译(在第三个启动子ATG处起始)。HBV表面蛋 白是糖蛋白，具有通过N-糖苷键附着的糖侧链。P ORF编码病毒聚合酶以 及X ORF编码已知为X蛋白(其被认为是转录激活剂)的蛋白。

病毒聚合酶根据HBV的基因型其长度约为832-845个氨基酸残基，并 且其在长的开放阅读框(“P”)中编码，所述开放阅读框与核心基因和所有表 面蛋白基因的3’端重叠。病毒聚合酶是由四个结构域组成的多功能蛋白,包 括三个功能性结构域,分别是催化HBV复制中主要步骤(引发、DNA合成 和RNA模板的去除)的末端蛋白、聚合酶和RNase H结构域，以及存在于 末端蛋白和聚合酶结构域之间的非必要间隔结构域(参见例如Radziwill等, 1990,J.Virol.64:613;Bartenschlager等,1990,J.Virol.64,5324)。负责酶活 性的催化位点已经过表征。对于此点,形成保守的YMDD基序的四个残基 (基于832个残基长的聚合酶编号的残基538-541)已经被显示为对DNA-和 RNA-依赖性DNA聚合酶活性是必要的；而RNase H活性是基于DEDD基 序，其涉及四个非保守氨基酸残基,分别为位置689处的Asp(D)、位置718 处的Glu(E)、位置737处的Asp(D)和位置777处的Asp(D)，以及其它几 个氨基酸残基包括位置769处的Val(V)和位置776处的Thr(T)。现有技术 中已描述了消除RT聚合酶和RNase H活性的不同突变(Chang等,1990,J. Virol.64:5553;Bartenschlager等,1990,J.Virol.64,5324,Radziwill等, 1990,J.Virol.64:613和Chen等,1996,J.Virol.70:6151)。若干组已经成功地 在各种宿主系统中表达了HBV聚合酶蛋白,但是已有报道其表达对表达细 胞是毒性的,需要使用可诱导启动子(Choi等,2002,Antiviral Res.55:279; Karimi等,2002,J.Virol.76:8609)。

许多临床前和临床研究着眼于CD4+和CD8+T细胞免疫应答对于有效 抗病毒应答的重要性。确实观察到了已自然从乙型肝炎恢复的患者携有多 特异性的和持续的由T辅助(T_H)和细胞毒T(CTL)淋巴细胞介导的应答，其 可容易地在外周血液中监测到。抗-HBe和抗-HBs抗体的出现表明感染的良 好结果。HBsAg-特异性抗体是中和性的，介导保护性免疫并且在临床恢复 后终生保持。

然而，慢性HBV感染很少由免疫系统解决。绝大多数慢性感染患者显 示出弱的且短暂的CD4和CD8T细胞免疫应答，其在抗原方面受限并且对 于病毒感染的清除无效。慢性乙型肝炎中细胞免疫应答作用功能的此种改 变的原因目前还不是很清楚，虽然已经观察到其中涉及在HBV慢性感染患 者中上调的不同的抑制性分子,如PD-1、CTLA4等。因此,需要能够诱导 有效T-细胞应答的免疫调节策略。

慢性乙型肝炎的常规治疗包括聚乙二醇化的干扰素-α(IFNa)和核苷/核 苷酸类似物(NUC)如拉米夫定(lamivudine),以及最近的恩替卡韦 (entecavir)、替比夫定(telbivudine)、阿德福韦(adefovir)和替诺福韦(tenofovir)。 IFNa是有力的抗病毒分子,由此抑制病毒复制,然而，其在仅仅25-30%的 患者中引起严重的副作用。NUC作用为HBV聚合酶的竞争性抑制剂，旨 在抑制前基因组RNA逆转录成负DNA链及继而的双链病毒DNA。它们 限制新病毒粒体的形成,但对于消除隐藏在感染的肝细胞的核中的超螺旋 cccDNA无效，这构成了新的后代病毒的来源。这可以解释为何NUC的效 力是短暂的并且在治疗停止之后立刻发生病毒反弹,需要患者终生接受治 疗。另外,由于抗性HBV突变体的出现，长期效力也是有限的(据一些报道， 拉米夫定治疗超过24%在一年后以及大约66%在四年后，虽然更新的NUC 显示少得多的药物抗性HBV突变体的出现)。现在已经分离出对抗病毒剂 展现出降低的敏感性的许多HBV毒株，并且基因组测序反映出在聚合酶结 构域中取代突变的显著性,包括在YMDD基序中(US2008-0233557;Zoulim  and Locarnini,2009,Gastroenterology,137:1593)。

在抗病毒治疗之外，目前还在努力尝试开发旨在改善宿主免疫应答的 补充疗法,具体而言是那些由细胞毒T-和辅助T-淋巴细胞所介导的免疫应 答。一些有前景的疫苗策略专注于HBV表面蛋白preS1和/或preS2(Zanetti 等,2008,Vaccine26:6266;Mancini-Bourguine等,2006,Vaccine24:4482)以 及专注于旨在同时靶向多个HBV抗原的多价免疫治疗方法。例如，用编码 多个包膜、核心和聚合酶表位的多表位DNA疫苗免疫已显示出在临床前小 鼠模型中激发CTL和T_H应答(Depla等,2008,J.Virol.82:435)。一种基于编 码HBsAg、HBcAg和HBV聚合酶的DNA质粒的混合物的方法 (WO2005/056051;WO2008/020656)在慢性乙型肝炎的转基因小鼠模型中证 明了特异性抗-HBV细胞和体液应答(Chae Young Kim等,2008,Exp.Mol. Medicine40:669)。在韩国在HBV携带者中组合拉米夫定治疗开始了I期临 床试验(Yang等,2006,Gene Ther.13:1110)。近来研究的另一方法涉及使用 编码HBc和HBV聚合酶及Hbs免疫原性结构域的组合的载体化的治疗性 疫苗(WO2011/01565)。用Ad-载体化的疫苗免疫的小鼠显示了针对所有表达 的HBV抗原的T细胞应答，特别是针对聚合酶。

由于感染的慢性和持续特性、其高发病率、HBV的连续传播以及相关 疾病的显著死亡率，可能会预期HBV会持续许多年成为严重的全球健康威 胁。因此,非常需要开发更有效的方法用以改善对HBV感染或HBV-相关 疾病或病症的预防和治疗。特别是,还需要调和针对靶向的HBV抗原(特别 是针对核心)的T细胞-介导的免疫的方法,且是低潜在毒性。此类方法对于 治疗慢性感染HBV的对象尤其有用。

此技术问题通过权利要求中所定义的实施方案而得到解决。

通过如下对本发明目前优选的技术方案的描述，本发明的其它和另外 的方面、特征及进展将会是显见的。提供这些技术方案是用于公开的目的。

发明概述

在一方面，本发明涉及突变体聚合酶多肽，其包含天然HBV聚合酶的 至少500个氨基酸残基，其中所述突变体聚合酶多肽包含具有内部缺失的 聚合酶结构域，所述内部缺失功能性地破坏聚合酶活性并且其中所述内部 缺失包含至少YMDD基序，所述YMDD基序天然存在于天然HBV聚合酶 的聚合酶结构域中。

本发明还涉及编码所述突变体聚合酶多肽的核酸分子,包含所述核酸 分子的载体,或者包含或编码所述突变体聚合酶多肽的组合物。

本发明还涉及此突变体聚合酶多肽、核酸分子、载体或组合物的用途, 特别是与另外的多肽组合(例如与一个或多个HBV多肽组合)，以用于治疗、 预防或抑制HBV感染或者改善与HBV感染相关的病况。

本发明的另一方面包括用于在有需要的对象中治疗、预防或抑制HBV 感染或者改善与HBV感染相关病况的方法,包括提供或施用此突变体聚合 酶多肽、核酸分子、载体或组合物,最终与另外的多肽组合(例如与一个或 多个HBV多肽组合)和/或与标准护理组合。

本发明的另一方面涉及在有需要的对象中激发免疫应答的方法,包括 提供或施用此突变体聚合酶多肽、核酸分子、载体或组合物,最终与另外的 多肽组合(例如与一个或多个HBV多肽组合)和/或与标准护理组合,以用 于在此对象中诱导或刺激免疫应答用以治疗HBV感染或者改善与HBV感 染相关的病况或症状。

本发明的另一方面提供试剂盒，其包含多个容器和说明，以用于根据 本文所述的组合物和方法向对象提供或施用此突变体聚合酶多肽、核酸分 子、载体或组合物,最终与另外的多肽组合(例如与一个或多个HBV多肽组 合)。

发明详述

本发明提供突变体聚合酶多肽，包含具有内部缺失的聚合酶结构域， 所述内部缺失功能性地破坏聚合酶活性并且其中所述内部缺失包含至少 YMDD基序，所述YMDD基序天然存在于天然HBV聚合酶的聚合酶结构 域中。此种突变体聚合酶多肽或编码其的载体可以在用于治疗或预防HBV 感染或与HBV感染相关的病况的组合物和方法中使用,最终与其它HBV 多肽和/或护理标准组合。由于相关酶活性的破坏，本发明涉及在各种载体 系统中表达和产生所述突变体聚合酶多肽。本发明也特别适于人类应用并 且可以用于加强标准疗法(例如SOC)。用编码与HBc和Hbs免疫原性结构 域融合的此突变体聚合酶多肽的载体免疫动物模型,激发了HBV特异性T 细胞应答,并令人吃惊的观察到针对HBc和聚合酶二者的强免疫性。

如下部分提供了本文所用的一些术语的更详细的解释。

定义

如本文遍及整个申请中所用,术语"a"和"an"所使用的含义在于"至少 一个"、"至少第一个"、"一个或多个"或"多个"所提及的化合物或步骤,除非 上下文另有说明。

无论在本文中何处使用术语“和/或”，都包括“和”、“或”以及“所述术 语所连接的元素的所有或任意的其它组合”的含义。

术语“约”或“大约”如本文所用是指给定值或范围的上下10%之内,优 选8%之内,更优选5%之内。

术语“氨基酸”、“残基”和“氨基酸残基”是同义词并且涵盖了天然氨基 酸以及氨基酸类似物(例如非天然的、合成的和修饰的氨基酸,包括D或L 光学异构体)。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”是指氨基酸残基的多聚体其包含至少9个 或更多个经肽键连接的氨基酸。所述多聚体可以是线性的、分枝的或环状 的，并且可以包含天然发生的氨基酸和/或氨基酸类似物，而且其可以被非 氨基酸中断。作为一般表示,如果氨基酸多聚体超过50个氨基酸残基,其 优选称作多肽或蛋白，而如果其长度为50个氨基酸或更短,则称作“肽”。

如本文所用，当用于定义产品、组合物和方法时,术语“包含”(以及任 何形式的包含,如"comprise"和"comprises")、“具有”(以及任何形式的具有如 "have"和"has"),“包括”(以及任何形式的包括如"includes"和"include")或“含 有”(以及任何形式的刚含有如"contains"和"contain")是开放式的且不排除另 外的、未提及的元素或方法步骤。因而,多肽“包含”氨基酸序列则该氨基 酸序列可以是该多肽最终氨基酸序列的一部分。此种多肽可具有达数百个 另外的氨基酸残基。“基本由……组成”是指排除任何有重要意义的其它组 分或步骤。因而,基本由所提到组分组成的组合物将不会排除痕量的污染物 和药学可接受的载体。多肽“基本由氨基酸序列组成”则此氨基酸序列最终 仅存在几个另外的氨基酸残基。“由……组成”是指排除其它组分或步骤的 痕量元素。例如，多肽“由氨基酸序列组成”则该多肽除了所提到的氨基酸 序列之外不含有任何氨基酸。

如本文所用，"HBV"和“乙肝病毒”可互换使用并且是指嗜肝DNA 病毒科的任何成员(参见例如Ganem and Schneider在Hepadnaviridae(2001) 中“The viruses and their replication”,pp2923-2969,Knipe DM等,eds.Fields  Virology,4th ed.Philadelphia,Lippincott Williams&Wilkins或随后的版本)。 氨基酸序列各种HBV多肽的和编码核苷酸序列可在专门的数据库找到(例 如上文所述的那些)以及在文献中找到(参见例如Valenzuela等,1980,The  amino acid sequences of the hepatitis B viral genome and the identification of  the major viral genes(pp57-70)in"Animal Virus Genetics";eds B.Fields,等; Academic Press Inc.,New York and Vaudin等,1988,J.Gen.Virol.69:1383)。

如本文所用，术语“HBV聚合酶”是指保留至少500个天然HBV聚合 酶蛋白中所包好的氨基酸残基的多肽。期望的是，此至少500个氨基酸残 基分布于三个功能性结构域并优选分布于天然HBV聚合酶中天然存在的 四个结构域。此术语涵盖可发现自、分离自、得自自然界中HBV来源的任 意HBV毒株、分离物(isolate)或基因型的天然的(即自然发生的)聚合酶多 肽，如上文与术语“HBV”相关联而提到的那些以及修饰的聚合酶(即突变体 聚合酶多肽)及其片段。作为说明目的，本文所述的HBV聚合酶的氨基酸 残基参照832个氨基酸长的聚合酶进行编号,其中基序Tyr Met Asp Asp (YMDD)中的残基Tyr是残基编号538。将氨基酸残基的编号依照其它聚合 酶(例如843个或845个氨基酸长的)调整是本领域技术人员能够做到的。

如本文所用，术语“天然”或“自然发生”在用于氨基酸序列(例如肽、多 肽、蛋白等)或核苷酸序列(例如基因、核酸分子、多核苷酸等)时是指可发 现自、分离自、得自自然界来源的氨基酸序列或核苷酸序列，其区别于实 验室中人工修饰或由人所突变(即突变体)的那些。此种自然界来源包括从感 染了或曾暴露于HBV的生物体收集的生物学样品(例如血液、血浆、血清、 精液、唾液、组织切片、组织活检样本等)、培养的细胞(如HepG2.2.15、 HuH6-C15(Sureau等,1986,Cell47:37;Sells等,1987,Proc.Natl.Acad.Sci. 84(4):1005);HuH7.TA61或HuH7.TA62(Sun等,2006,J Hepatol.45(5):636), 组织培养物以及重组材料。重组材料包括但不限于HBV分离物(例如可得 自保藏机构的)、HBV基因组、研究组RNA或cDNA文库、含HBV基因 组的载体或其片段或者已知包括此元素的任何现有技术载体)。

作为说明目的，“天然HBV聚合酶”是指由任何现有技术中所述的自 然发生的HBV基因型、毒株或分离物的ORF P所编码的HBV聚合酶(例 如根据基因型832-845个氨基酸的多肽)或其片段。术语“天然”还涵盖代表 具体基因型的HBV聚合酶多肽/肽,并因而包含对应于共有或接近共有序 列的氨基酸序列(通常在各种特定基因型的HBV聚合酶的序列比对之后确 定)。

术语“突变体”如本文所用是指相对于天然对应物展现出一个或多个 突变的多肽。作为说明目的，“突变体聚合酶多肽”是指如本文所述人工突 变或实验室中由人改变之后源自天然聚合酶的聚合酶多肽。可涵盖任意突 变,包括一个或多个核苷酸/氨基酸残基的取代、插入和/或缺失，非天然排 列(例如与外援多肽/肽融合)以及这些可能性的任意组合。当虑及若干突变 时,其可涉及连续的残基和/或非连续残基。可通过本领域技术人员已知的 许多方法来产生突变,如定点诱变(例如使用Amersham的Sculptor^TM体外 诱变系统,Les Ullis,France)、PCR诱变、DNA改组和通过化学合成技术(例 如导致合成的核酸分子)。根据优选的实施方案，本发明虑及的突变涵盖一 个或多个氨基酸残基(连续或非连续)的缺失和/或取代，所述一个或多个氨 基酸残基直接或间接参与天然HBV聚合酶所展现的至少一种酶活性,以旨 在破坏所述至少一种酶活性如聚合酶活性和/或RNaseH活性。在本发明的 上下文中，所得的突变体聚合酶多肽整体上保持与非突变部分中相应天然 HBV聚合酶的高度相同性(例如至少80%)。

如本文所用，术语“破坏”或其衍生词在与给定酶活性相关联时，是指 “消除”(完全无残留活性)或者“显著降低”(残余活性低于天然聚合酶所展现 活性的20%)。

术语“相同性”是指在两个多肽或核苷酸序列之间确切的氨基酸对氨 基酸或核苷酸对核苷酸的对应性。两个序列之间相同性的百分比是序列共 有的相同位置数目的函数,其中将最佳比对所需要引入的缺口的数目以及 每个缺口的长度纳入考量。现有技术中有各种计算机程序和数学算法用于 确定氨基酸序列间相同性的百分比,例如NCBI的Blast程序或Atlas of  Protein Sequence and Structure中的ALIGN(Dayhoffed.,1981,Suppl.,3 482-489)。在专美的数据库中也有用于确定核苷酸序列间同源性的程序(例 如Genbank、Wisconsin Sequence Analysis Package,BESTFIT,FASTA和GAP 程序)。作为说明目的，“至少80%序列相同性”如本文所用是指80%、81%、 82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。

如本文所用，术语“分离的”是指蛋白、多肽、肽、多核苷酸,、质粒载 体、病毒载体、或宿主细胞从其天然环境移开(即，与其天然相关联的至少 一种其它成分分开)。

HBV序列

许多HBV序列适宜用于本文所述的实施方案，包括本领域研究人员 轻易可得的此类序列,包括但不限于,在Genbank和PubMed中所述的HBV 序列。作为说明目的，深入的系统进化分析已经将乙肝病毒分类为8种主 要的基因型(A-H)，它们显示出有区别的地理分布和临床结果，但是却展 现出高度的序列保守性。各种HBV也可基于HBsAg-相关的血清学而分类 为9种不同的亚型(ayw1、ayw2、ayw3、ayw4、ayr、adw2、adw4、adrq+ 和adqr-)(参见Mamum-Al Mahtab等的综述,2008,Hepatobiliary Pancrease  Dis Int5:457;Schaeffer,2007,World Gastroenterol.7:14)。每种基因型和血 清型涵盖不同的HBV毒株和分离物。分离物对应于分离自特定来源HBV 的具体病毒(例如，患者样品或其它生物学HBV库存)，而毒株涵盖各种在 基因组序列方面彼此很接近的分离物。

基因型A的示例性HBV包括但不限于分离物HB-JI444A和毒株 HB-JI444A(登录号AP007263)。基因型B的示例性HBV包括但不限于克 隆pJDW233(登录号D00329),分离物HBV/14611(登录号AF121243), HBV-B1(GenBank登录号AF282917.1),HBV毒株Whutj-37(GenBank登录 号AY2933309.1),中国HBV毒株GDH1(GenBank登录号AY766463.1)和 HBV分离物57-1亚型adw(GenBank登录号AY518556.1)。基因型C的示 例性HBV包括但不限于分离物AH-1-ON980424(登录号AB113879),毒株 HCC-3-TT(登录号AB113877),HBV分离物SWT3.3(GenBank登录号 EU916241.1),HBV分离物H85(GenBank登录号AY306136.1),HBV毒株 C1248(GenBank登录号DQ975272.1),HBV分离物CHN-H155(GenBank登 录号DQ478901.1)和HBV分离物GZ28-1(GenBank登录号EF688062)。基 因型D的示例性HBV包括但不限于分离物KAMCHATKA27(登录号 AB188243),ALTAY136(登录号AB188245)和Y07587(Genbank登录号 Y07587及Stoll-Becker等,1997,J.Virol.71:5399)以及登录号AB267090所 述的HBV分离物。基因型E的示例性HBV包括但不限于分离物HB-JI411F 和毒株HB-JI411(登录号AP007262)。基因型F的示例性HBV包括但不限 于分离物HBV-BL597(登录号AB214516)和HBV-BL592(登录号 AB166850)。基因型G的示例性HBV包括但不限于分离物HB-JI444GF和 毒株HB-JI444G(登录号AP007264)。基因型H的示例性HBV包括但不限 于分离物HBV ST0404(登录号AB298362)和分离物HB-JI260F和毒株 HB-JI260(登录号AP007261)。

本发明的并不是要局限于这些示例性HBV序列。实际上，根据本发 明所使用的任何或所有HBV多肽/肽的核苷酸和氨基酸序列可以在不同 HBV分离物和基因型之间变换，并且此天然遗传变异包括在本发明的范围 之内。另外，本发明中所使用的HBV多肽/肽可代表具体的基因型,并因而 包含对应于共有或近共有序列的氨基酸序列。

另外，每种HBV多肽/肽可独立源自任何目前已鉴别的HBV基因型、 毒株或分离物,如上文所述的与术语“HBV”相关联的那些。此种设定可以允 许提供针对更广泛的HBV基因型的保护，或者提供对具体地理区域(通过 使用在此区域中风行的HBV基因型)或具体患者群体的适应。对于此点,基 因型A和C是美国最流行的,基因型A和D是西欧国家最流行的，以及基 因型D是地中海区域最流行的，而基因型B和C在中国最常见。来自印度 的有限数据表明，基因型A和D在印度最流行。本领域技术人员能够依据 要治疗的群体和/或地理区域来选择适宜的HBV基因型、血清型、毒株和/ 或分离物。

根据优选的实施方案，本发明中所使用的HBV多肽/肽源自基因型D 病毒,特别优选HBV分离物Y07587。

突变体HBV聚合酶

本发明的突变体聚合酶多肽包含具有内部缺失的突变的聚合酶结构 域，所述内部缺失功能性地破坏聚合酶活性并且包含至少天然存在于天然 聚合酶的聚合酶结构域中的YMDD基序。由所得的突变体聚合酶多肽所展 现的对聚合酶活性的破坏，可以使用本领域已知的测定来进行评估(例如 Radziwill等,1990,J Virol.64:613中所述的内源聚合酶测定)。

SEQ ID NO:1中提供了涵盖基因型B、C和D的天然HBV聚合酶的 聚合酶结构域的通式氨基酸序列,其中位置7的Xaa是Thr(T)或Ala(A); 位置13的Xaa是Asn(N),Arg(R)或His(H);位置16的Xaa是Ile(I)或Thr (T);位置38的Xaa是Thr(T)或Ala(A);位置53的Xaa是Ser(S)或Asn(N); 位置54的Xaa是Thr(T)或Tyr(Y);位置55的Xaa是His(H)或Arg(R);位 置91的Xaa是Ile(I)或Leu(L);位置109的Xaa是Pro(P)或Ser(S);位置 118的Xaa是Thr(T)或Asn(N);位置121的Xaa是Asn(N)或Ile(I);位置 122的Xaa是Ile(I)或Phe(F);位置124的Xaa是Tyr(Y)或Asn(N);位置 127的Xaa是Gly(G)或Arg(R);位置131的Xaa是Asp(D)或Asn(N);位 置134的Xaa是Asp(D)或Asn(N);位置145的Xaa是Leu(L)或Met(M); 位置149的Xaa是Lys(K)或Gln(Q);位置151的Xaa是Phe(F)或Tyr(Y); 位置221的Xaa是Phe(F)或Tyr(Y);位置222的Xaa是Thr(T)或Ala(A); 位置223的Xaa是Ser(S)或Ala(A);位置224的Xaa是Ile(I)或Val(V); 位置238的Xaa是Asn(N)或His(H);位置248的Xaa是Asn(N)或His(H); 位置256的Xaa是Ser(S)或Cys(C);位置257的Xaa是Trp(W)或Tyr(Y); 位置259的Xaa是Thr(T)或Ser(S);位置263的Xaa是Glu(E)或Asp(D); 位置266的Xaa是Val(V)或Ile(I);位置267的Xaa是Leu(L)或Gln(Q);位 置271的Xaa是Gln(Q),Met(M)或Glu(E);位置317的Xaa是Ser(S)或Ala (A);和位置332的Xaa是Cys(T)或Ser(S)。

根据本发明，本发明的突变体聚合酶多肽中所包含的突变的聚合酶结 构域缺少至少YMDD基序(存在于SEQ ID NO:1的此通式聚合酶结构域的 位置203至位置206)。

本发明还涵盖最少4个氨基酸残基和最多30个氨基酸残基的任意其 它内部缺失(其包含至少此YMDD基序)。

代表性的本发明的突变体聚合酶多肽包含突变的聚合酶结构域，所述 突变的聚合酶结构域包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列但缺少至少位置 203处的Tyr残基,位置204处的Met残基、位置205处的Asp残基和位置 206处的Asp残基。

在YMDD基序之外,优选所述内部缺失还包含所有的或部分的相邻 VVL基序,所述VVL基序在天然HBV聚合酶结构域中存在于所述YMDD 基序的C端(对应于SEQ ID NO:1的位置207-209处的残基和对应于832 个氨基酸的天然聚合酶的位置542-544的残基)。此种VVL基序实际上能够 有助于形成“连接(junctional)”表位(例如共线合成的新表位)，其有降低宿主 的免疫应答(一个或多个HBV聚合酶-相关的表位)或使该免疫应答沉默的 风险。

优选地，本发明的突变体聚合酶多肽包含突变的聚合酶结构域，所述 突变的聚合酶结构域具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列但缺少至少位置 203处的Tyr残基、位置204处的Met残基、位置205处的Asp残基、位 置206处的Asp残基、位置207处的Val残基、位置208处的Val残基和 位置209处的Leu残基。

更优选地，本发明的突变体聚合酶多肽包含聚合酶结构域，所述聚合 酶结构域包含这样的氨基酸序列、或者基本由该氨基酸序列组成、或者由 该氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列展 现出至少80%的相同性,有利的是至少85%的相同性,优选至少90%的相 同性,更优选至少95%的相同性,以及更优选至少100%相同性。更优选地， 所述突变的聚合酶结构域包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

作为选择或者作为组合,本发明的突变体聚合酶多肽还包含突变的 RNaseH结构域，所述突变的RNaseH结构域包含一个或多个氨基酸残基的 突变，所述突变功能性地破坏天然HBV聚合酶中正常展现的RNaseH活性。

如上文所述，RNase H活性中所涉及的功能性结构域已经在C-端部分 内作图(map),更特别是天然的832个氨基酸长的HBV聚合酶的位置680 至C-端(或者从天然的845个氨基酸长的HBV聚合酶的位置693至C-端)， 并且本发明涵盖了此结构域中与RNase H活性的破坏相关的任意突变(即最 终导致低于天然RNaseH活性的20%的弱残留活性)。可以使用本领域已知 的测定来评估由突变体聚合酶多肽所展现的RNase H活性的破坏(例如体外 RNaseH活性测定或DNA-RNA串联分子分析，Radziwill等,1990,J Virol. 64:613或Lee等,1997,Biochem.Bioph.Res.Commun。233(2):401中所述)。

SEQ ID NO:3中提供了涵盖基因型B、C和D的天然HBV聚合酶的 RNaseH结构域的通式氨基酸序列,其中位置2的Xaa是Ser(S)或Pro(P); 位置19的Xaa是Ala(A)或Val(V);位置20的Xaa是Ile(I)或Met(M);位 置30的Xaa是Val(V)或Leu(L);位置31的Xaa是Ala(A)或Ser(S);位置 53的Xaa是Lys(K)或Asn(N);位置54的Xaa是Leu(L)或Ile(I);位置55 的Xaa是Leu(L)或Ile(I);位置97的Xaa是Ala(A)或Thr(T);位置108的 Xaa是Tyr(Y)或Ser(S);位置115的Xaa是Pro(P)或Leu(L);位置116的 Xaa是Phe(F)或Tyr(Y);位置128的Xaa是Val(V)或Asp(D)。

有利的是，本发明的突变体聚合酶多肽的RNaseH结构域中所包含的 一个或多个突变选自:

·最少8个氨基酸和最多60个氨基酸的缺失，包括至少SEQ ID NO: 3从大约位置39处的Glu(E)残基延伸至大约位置46处的Ala(A)残基的部 分(del ELLAACFA);

·用D之外的氨基酸残基取代SEQ ID NO:3的位置10处的Asp(D) 残基;

·用V之外的氨基酸残基取代SEQ ID NO:3的位置90处的Val(V) 残基;

·用T或A之外的氨基酸残基取代SEQ ID NO:3的位置97处的Thr (T)或Ala(A)残基;

·用D之外的氨基酸残基取代SEQ ID NO:3的位置98处的Asp(D) 残基;和

·其任意组合。

适宜组合的代表性例子包括但不限于(a)位置10、90、97和98处的氨 基酸残基的取代;(b)包括GLLAACFA基序的8-60个氨基酸残基的缺失和 任何所提到的位置处的氨基酸残基的取代;或(c)所有所列突变的组合。

适宜的是,SEQ ID NO:3的位置10、90、97或98处的被取代的残基 单独被置换为His(H)残基或Tyr(Y)残基,特别是优选用His(H)残基取代 SEQ ID NO:3的位置10处的残基(D689H),用Tyr(Y)残基取代SEQ ID NO: 3的位置90处的残基(V769Y),用Tyr(Y)残基取代SEQ ID NO:3的位置97 处的残基(T776Y或A776Y)和/或用His(H)残基取代SEQ ID NO:3的位置 98处的残基(D777H)。

适宜的是，在突变的RNase H结构域中所包含的缺失，包括SEQ ID  NO:3中从大约位置39处的Glu(E)残基延伸至大约位置57处的Thr(T)残 基的至少19个氨基酸残基的部分、优选SEQ ID NO:3中从大约位置39处 的Glu(E)残基延伸至大约位置63处的Leu(L)残基的至少25个氨基酸残基 的部分、更优选SEQ ID NO:3中从大约位置31处的残基Xaa(A或S)延伸 至大约位置63处的Leu(L)残基的至少33个氨基酸残基的部分。

优选地，本发明的突变体聚合酶多肽包含突变的RNaseH结构域，所 述突变的RNaseH结构域包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列，但却(a) 缺少从位置31处的残基Xaa(X)延伸至大约位置63处的Leu(L)残基的33 个氨基酸残基的部分并且包含(b)用His(H)残基取代位置10处的Asp(D) 残基残基(D689H);(c)用Tyr(Y)残基取代位置90处的Val(V)残基(V769Y); (d)用Tyr(Y)残基取代位置97处的残基(T/A776Y)和(e)用His(H)残基取代 位置98处的Asp(D)残基(D777H)。

更优选地，本发明的突变体聚合酶多肽包含突变的RNaseH结构域， 所述突变的RNaseH结构域包含这样的氨基酸序列、或者基本由该氨基酸 序列组成、或者由该氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4所 示的氨基酸序列展现出至少80%的相同性,有利的是至少85%的相同性, 优选至少90%的相同性,更优选至少95%的相同性,以及更优选100%相同 性。

在更优选的实施方案中,本发明的突变体聚合酶多肽包含这样的氨基 酸序列、或者基本由该氨基酸序列组成、或者由该氨基酸序列组成，所述 氨基酸序列与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列展现出至少80%的相同性, 有利的是至少85%的相同性,优选至少90%的相同性,更优选至少95%的 相同性,以及更优选至少100%相同性。更优选的是包含SEQ ID NO:5所示 氨基酸序列的突变体聚合酶多肽。

在本发明的上下文中，本发明的突变体聚合酶多肽可包含另外的突 变。然而，优选避免可对免疫原活性有害的修饰,尤其是在富含B、CTL 和/或T_H表位的部分。

示例性的另外的修饰包括N-端截短。特别适宜的是正常存在于天然 HBV聚合酶或SEQ ID NO:5的N-端的最少20个氨基酸残基和最多100个 氨基酸残基的截短,特别优选从SEQ ID NO:5的位置1(Met起始区)或2延 伸至大约位置47的截短。此修饰特别适宜于与天然HBV核心多肽组合使 用的突变体聚合酶多肽，这是由于此种N-端截短有助于减少或者删除这两 种多肽之间重叠的部分。然而，这也可以通过使用与C-端截短的HBV核 心多肽组合的非截短的突变体聚合酶多肽来实现，如下文所述。

期望的是，所得的突变体聚合酶多肽保留免疫原性质特别是刺激细胞 介导的免疫应答的能力(在相同的范围内或者比天然聚合酶更高)。

与其它多肽组合/融合

在另一实施方案中，本发明的突变体聚合酶多肽可以与一个或多个另 外的多肽或肽组合使用。

术语“组合”及变体如“组合使用”是指在相同宿主生物体中施用两个或 更多个实体的行为,所述实体之一是本发明的物体。通常，该至少两种实体 可以通过不同的途径以及根据不同的时间方案来施用。适宜的组合包括但 不限于the combination of the本文所述的突变体聚合酶多肽(或编码其的载 体)与抗病毒剂(SOC)的组合和/或与另外的多肽或编码此类另外的多肽的载 体的组合。此种组合可以是(a)混合物的形式(例如两种或更多种多肽或载体 的混合物),(b)该两种或更多种实体的融合物的形式或者(c)通过具体的表达 设计(例如双顺反子或独立飙到)。例如，该两个或更多个实体可以使用不同 的调节元件在相同载体内独立表达(例如用不同的启动子和终止序列)。独立 表达设计特别适宜于for expression from质粒或麻疹载体。或者,所述两个 或更多个实体可以双顺反子的方式表达，其在相同启动子和终止序列的控 制下但需要使用另外的调节元件如IRES(代表内部核糖体进入位点)以允许 两个或更多个顺反子从相同的mRNA翻译。本领域中有大量的IRES可选 择，如源自脊髓灰质炎病毒、丙肝病毒和脑心脊炎病毒(EMCV)的那些(例 如，参见WO95/24485)。双顺反子设计特别适宜于从具有更有限的克隆能 力的载体表达，如腺病毒载体。

术语“融合”或“融合蛋白”如本文所用是指在单一多肽链中的两个或更 多个多肽/肽的组合。优选地，通过遗传手段来进行融合,即通过符合读框 地融合编码每个所述多肽/肽的核苷酸序列。对于“符合读框地融合”,其是 指所融合的编码序列的表达导致单一的蛋白，在每个所融合的多肽/肽之间 没有任何翻译终止子。融合可以是直接的(即之间没有任何另外的氨基酸残 基)或通过接头(例如3-30个氨基酸长的肽，由重复的氨基酸残基组成如甘 氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、丙氨酸和/或脯氨酸)。

用于与本发明的突变体聚合酶多肽组合使用的另外的多肽或肽优选 是HBV基因组所编码的多肽或肽,如任何天然HBV多肽、其修饰的衍生 物和/或片段。此类HBV多肽或肽的代表性例子包括但不限于HBc(核心)、 HBs、X蛋白以及其任意免疫原性片段。

根据本发明，如上文所述，本发明中所使用的任何另外的HBV多肽 或肽可源自与本发明的突变体聚合酶多肽所源自的HBV基因型、毒株或 分离物不同或相同的HBV基因型、毒株或分离物。优选地，此类另外的 HBV多肽源自基因型D HBV,且特别是源自Y07587分离物。

优选的组合是本文所述突变体聚合酶多肽与另外的多肽之间融合蛋 白的形式。此种融合优选是直接的，在融合的实体之间没有任何接头。

与核心组合

如本文所用，术语“核心多肽”是指这样的多肽，其保留天然HBV核 心(HBc)蛋白中所包含的至少100个氨基酸残基。此术语涵盖了从自然界中 HBV来源所发现、分离、获得的任何HBV毒株、分离物或基因型(如上文 与术语“HBV”相关联的那些)的天然(即自然发生的)核心多肽，以及修饰的 核心及其片段。

本发明中所使用的HBV核心多肽可源自这样的HBV病毒，该HBV 病毒与所述突变体聚合酶多肽所源自的HBV病毒具有相同的或不同的基 因型。优选地，它们都源自源自基因型D病毒，更特别是源自Y07587分 离物。核心多肽及其编码序列可以通过本领域技术人员已知的方式来产生, 如通过编码序列的化学合成(例如导致合成的核酸分子)或者通过重组手段 (例如相应核苷酸序列的定点诱变,PCR诱变,DNA改组)。

可以涉及任何修饰,只要所得的核心在与本文所述的突变体聚合酶多 肽组合或融合时保留显著的免疫原活性(优选在同样的范围或者比天然核 心对应物更高)。

适宜的修饰包括正常存在于天然核心多肽的C-端或在其C-端部分内 的最少10个氨基酸残基和最多41个氨基酸残基的截短,特别优选从天然核 心多肽的残基143、144、145、146、147、148或残基149延伸至C-端(残 基183)的截短。其它适宜的修饰包括一个或多个氨基酸残基的内部缺失,特 别是在表明暴露区域中，如位于残基80附近的区域，据推测其形成外部环 (Argos等1988,EMBO J.7:819;Borisova等,1993,J.Virol.67:3696; Schodel等,1992,J.Virol.66:106;Yon等,1992,J.Gen Virol.73:2569;和 Pumpens等,1995,Intervirology38:63)。

在优选的实施方案中，所述组合是融合的形式。因此,本发明涉及融 合蛋白，其包含本文所述的突变体聚合酶多肽和融合配偶体。优选地，所 述融合配偶体是HBV核心多肽,特别优选C-端截短的核心多肽，尤其是在 残基148处截短的。

优选地，所述HBV核心多肽被符合读框地融合至本文所述的突变体 聚合酶多肽的N-端,导致融合蛋白(始自起始区Met、无任何终止密码子的 核心多肽(修饰的或天然的)、突变体聚合酶多肽(没有任何Met起始区)和终 止密码子)。

优选的融合蛋白包含这样的氨基酸序列、或者基本由该氨基酸序列组 成、或者由该氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:6所示的氨 基酸序列展现出至少80%的相同性,有利的是至少85%的相同性,优选至 少90%的相同性,更优选至少95%的相同性,以及更优选100%相同性。更 优选地，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。

与免疫原性HbsAg结构域组合

作为选择或者与前文所述实施方案(与核心多肽组合)组合,本发明的 突变体聚合酶多肽可以与HbsAg或其免疫原性片段/结构域组合使用。

如本文所用，术语“免疫原性结构域”是指具有大约15至大约100个 氨基酸残基、优选最少20个和最多60个连续的氨基酸的多肽，其包含至 少一个正常存在于天然HBsAg蛋白中的特异于T辅助(TH)细胞和/或细胞 毒T(CTL)细胞的B和/或T细胞表位。另外此类表位可以被局限为各种MHC I类和/或II类抗原(例如A2,A24,DR,DP等)。优选地，本发明中所使用的 一个或多个HBsAg免疫原性结构域不包括HBV preS1和preS2多肽的任何 部分。

每个所述一个或多个免疫原性结构域可独立地源自相同的或不同的 HBV病毒，该HBV病毒可以与本文所述的突变体聚合酶多肽(及最终的核 心多肽)所源自的HBV病毒相同或不同。优选地，所述一个或多个免疫原 性结构域源自基因型D HBV,特别是源自Y07587分离物。

可用于本发明的示例性免疫原性结构域在现有技术中有描述(例如 WO93/03764;WO94/19011;Desombere等,2000,Clin.Exp.Immunol122: 390;Loirat等,2000,J.Immunol.165:4748;Schirmbeck等,2002,J. Immunol168:6253;Depla等,2008,J.Virol.82:435和WO2011/015656)。特 别优选的免疫原性结构域包括WO2011/015656中所述的env1和env2结构 域。“Env1”对应于天然HBsAg从大约位置14至大约位置51的部分，而env2 对应于HBsAg从大约位置165至大约位置194的部分。

在优选的实施方案中，组合是以融合的形式，并且本发明涉及包含本 文所述的突变体聚合酶多肽和一个或多个HBsAg免疫原性结构域的融合蛋 白或者涉及还包含一个或多个HBsAg免疫原性结构域的上文所述的融合蛋 白(包含至少本文所述的突变体聚合酶多肽和Hbc多肽)。所述一个或多个 免疫原性结构域可以位于融合蛋白的N-端、C-端和/或内部,例如在突变体 聚合酶多肽内(例如位于突变的聚合酶和/或RNaseH结构域中所缺少的部分 处)，或者位于核心和突变体聚合酶多肽之间。本领域技术人员能够根据需 要确定翻译介导的调节元件的位置(例如起始区Met和密码子STOP位于该 融合蛋白的N-和C-端)。

特别感兴趣的融合蛋白包含本文所述的突变体聚合酶多肽、核心多肽 和两个HBsAg免疫原性结构域,特别优选的融合是在其N-包含核心多肽 (例如天然的183个残基或截短的148个残基，具有起始区Met)融合至突 变体聚合酶多肽(无起始区Met)，所述突变体聚合酶多肽包含融合于突变 的聚合酶结构域中的内部缺失处(例如env1)和/或融合于突变的RNaseH结 构域的缺失处(例如env2)的1个或2个HbsAg免疫原性结构域。

在此实施方案的优选方面,本发明的融合蛋白包含这样的氨基酸序 列、或者基本由该氨基酸序列组成、或者由该氨基酸序列组成，所述氨基 酸序列与SEQ ID NO:7-9所示的任意氨基酸序列展现出至少80%的相同性, 有利的是至少85%的相同性,优选至少90%的相同性,更优选至少95%的 相同性,以及更优选100%相同性。更优选的实施方案是，包含SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列的融合蛋白。

在本发明的上下文中，本发明的突变体聚合酶多肽或本发明的融合蛋 白可以还包含另外的结构特征。

在一个实施方案中，其可包含旨在提高其于宿主生物体中免疫原活性 另外的化合物(例如肽或多肽)。此类能够增强免疫原性的化合物在文献中已 有描述，包括但不限于,钙网织蛋白(calreticulin)(Cheng等,2001,J.Clin. Invest.108:669),结核分枝杆菌热休克蛋白70(HSP70)(Chen等,2000, Cancer Res.60:1035),泛素(Rodriguez等,1997,J.Virol.71:8497),细菌毒 素如绿脓假单胞菌外毒素A的移位结构域(ETA(dIII))(Hung等,2001 Cancer Res.61:3698)以及T辅助表位如Pan-Dr肽(Sidney等,1994, Immunity1:751),pstS1GCG表位(Vordermeier等,1992,Eur.J.Immunol.22: 2631),破伤风类毒素肽P2TT(Panina-Bordignon等,1989,Eur.J.Immunol. 19:2237)和P30TT(Demotz等,1993,Eur.J.Immunol.23:425),流感表位 (Lamb等,1982,Nature300:66)和血球凝集素表位(Rothbard等,1989,Int. Immunol.1:479)。

其它适宜的结构特征是有益于本发明的突变体聚合酶多肽或融合蛋 白的合成、加工、稳定性和可溶性的那些(例如旨在修饰潜在切割位点、潜 在糖基化位点和/或膜锚点以改善呈递至细胞膜)。

通过使用适宜的本领域熟知序列(如信号和/或跨膜肽)而将本文所述 的突变体聚合酶多肽或融合蛋白的合成引至细胞表面对于免疫应答是有益 的。简言之，信号肽通常存在于膜呈递或分泌多肽的N-端并且将其引至内 质网(ER)。它们通常包含15-35个基本上疏水的氨基酸，其继而由特异性 的位于ER的内肽酶去除以产生成熟多肽。跨膜肽在自然界中也是高度疏 水的并且勇于将多肽锚定于细胞膜。可用于本发明背景中的跨膜和/或信号 肽的选择很多。其可得自任何膜锚定的和/或分泌的多肽(例如细胞或病毒多 肽)，如免疫球蛋白、组织纤维蛋白溶酶原激活剂、胰岛素、狂犬病毒糖蛋 白、HIV病毒包膜糖蛋白或麻疹病毒F蛋白或者可以是合成的。

在一个实施方案中，本发明的突变体聚合酶多肽或融合蛋白符合读框 地融合至信号肽(其插入至N-端翻译起始密码子的下游)。在另一实施方案 中，本发明的突变体聚合酶多肽或融合蛋白符合读框地融合至信号肽(例如 插入在其N-端)和融合至跨膜肽(例如插入在C-端,例如紧接在终止密码子 的上游)。优选地，本发明中所使用的信号和跨膜肽源自狂犬病毒糖蛋白(参 见例如WO99/03885或WO2008/138649)。优选的实施方案是这样的HBV 聚合酶突变体多肽和融合蛋白，其包含这样的氨基酸序列、或者基本由该 氨基酸序列组成、或者由该氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列展现出至少80%的 相同性,有利的是至少85%的相同性,优选至少90%的相同性,更优选至少 95%的相同性,以及更优选100%相同性。

核酸分子

在另一方面，本发明提供编码本文所述的突变体聚合酶多肽和融合蛋 白的分离的核酸分子。

在本发明的背景中，术语“核酸”,“核酸分子”,“多核苷酸"和"核苷酸序 列”可互换使用并且定义了任何长度的多聚脱氧核糖核苷酸(DNA)(例如, cDNA,基因组DNA,质粒,载体,病毒基因组,分离的DNA,探针,引物 及其任意混合物)或多聚核糖核苷酸(RNA)(例如,mRNA,反义RNA)或混 合的多聚核糖-多聚脱氧核糖核苷酸。其涵盖了单链或双链、线性或环状、 天然的或合成的多核苷酸。另外，多核苷酸可包含非自然发生的核苷酸并 且可以被非核苷酸成分所中断。

本发明的核酸分子可使用本领域可得的序列数据和本文所提供的序 列信息而产生自任何来源。例如，编码HBV聚合酶(及有需要时的核心多 肽和HBsAg免疫原性结构域)的DNA序列可独立分离自含HBV的细胞、 cDNA和基因组文库、病毒基因组或任何现有技术已知含有其的载体,并继 而通过常规分子生物学或PCR技术而适宜地连接。或者，本发明的核酸分 子还可产生自自动化过程中的化学合成(例如从重叠合成寡核苷酸合成基 因组装)。可通过本领域技术人员已知的许多方式来产生修饰,如化学合成、 定点诱变、PCR诱变、DNA改组等。

特别感兴趣的核酸分子选自:

·编码突变体聚合酶多肽的核酸分子，所述突变体聚合酶多肽包含具 有SEQ ID NO:1或2所示氨基酸序列的聚合酶结构域

·编码突变体聚合酶多肽的核酸分子，所述突变体聚合酶多肽包含具 有SEQ ID NO:3或4所示氨基酸序列的RNaseH结构域;

·编码突变体聚合酶多肽的核酸分子，所述突变体聚合酶多肽包含与 SEQ ID NO:5所示氨基酸序列展现出至少80%的相同性(例如80%,85%, 90%,95%,97%,100%)的氨基酸序列;或

·编码融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:6-12 所示的任意氨基酸序列展现出至少80%的相同性(例如80%,85%,90%,95%, 97%,100%)的氨基酸序列。

本发明并不局限于这些示例性的核苷酸序列，并包含任意旨在改善本 发明中所使用的核酸分子的克隆、表达、稳定性的修饰(例如引入适宜的限 制性酶切位点、将核苷酸序列简并化和/或优化以使宿主细胞中的翻译优化 和/或抑制潜在的使核酸分子或其转录物不稳定的负面元素)。在虑及多个修 饰时,它们可涉及连续残基和/或非连续残基。本发明所涉及的修饰涵盖了 不改变所编码的多肽和融合蛋白的氨基酸序列的沉默修饰,以及翻译到所 编码的多肽和融合蛋白中的修饰。

在一个实施方案中，本发明的核酸分子可以在其全长核苷酸序列或其 部分进行简并，从而降低本发明或宿主细胞中所使用的核酸分子之间的序 列同源性。实际上可以对显示出高度的核苷酸序列相同性的核酸序列部分 进行简并，并且本领域技术人员能够通过序列比对鉴别出这样的部分。例 如如果载体携带编码本文所述突变体聚合酶多肽的核酸分子和编码另外的 HBV多肽(由HBV基因组中重叠序列编码)的核酸分子，有利的是将所述核 酸分子其中之一或者二者一起在重叠部分进行简并，从而避免在生产过程 中的同源重组问题。

作为选择或作为组合，可将本发明的核酸分子优化以提供在特定宿主 细胞或生物体中的高水平表达。实际上已观察到,当多于一个密码子可用于 编码给定氨基酸时,生物体的密码子使用模式是高度非随机的并且密码子 使用在不同宿主间是有显著差异的。由于本发明所涵盖的核苷酸序列大部 分是病毒来源(HBV),它们可能会具有不适宜于在宿主细胞(如细菌、低等 或高等真核细胞)中有效表达的密码子使用模式。通常，可以通过如下方式 进行密码子优化：将一个或多个“天然”(例如HBV)密码子(在感兴趣宿主 细胞/生物体中不常使用的密码子)置换为一个或多个在感兴趣宿主细胞/生 物体中更常使用的密码子。并不是必需要将所有的天然密码子(不常使用的 密码子)置换，因为即便是部分置换也可实现提高的表达。另外，从严格遵 循至优化的密码子使用的变化也可用于在所得的核酸分子中引入限制性酶 切位点。

另外，可以通过核苷酸序列的另外的修饰来改善在宿主细胞或生物体 中的表达，所述修饰旨在防止罕见、非优化密码子的簇集和/或防止或修饰 至少部分负面序列元件(其预期会对表达水平产生负面影响,例如富含AT 或富含GC的序列区段;不稳定的直接的或插入的重复序列;RNA二级结构; 和/或内部隐含调节元件如内部TATA-盒、chi-位点、核糖体进入位点、和/ 或剪接供体/受体位点)。

本发明特别优选的实施方案是这样的核酸分子，其包含这样的核苷酸 序列、或者基本由该核苷酸序列组成、或者由核苷酸序列组成，所述核苷 酸序列与SEQ ID NO:13-17所示的任意氨基酸序列展现出至少80%的相同 性,有利的是至少85%的相同性,优选至少90%的相同性,更优选至少95% 的相同性,以及更优选100%相同性。

本发明的另一实施方案涉及本发明的核酸分子的片段,例如限制性内 切酶和PCR-生成的片段。此类片段可用作探针、引物或编码所编码免疫原 性多肽的免疫原性部分的片段。

载体

在另一方面，本发明提供包含本发明核酸分子的载体。

术语“载体”如本文所用是指载剂(vehicle),优选含有允许一个或多个 核酸分子在宿主细胞或生物体内递送、传代和/或表达所需的元件的核酸分 子或病毒颗粒。此术语涵盖了用于维持的载体(克隆载体)或用于在各种宿主 细胞或生物体中表达的载体(表达载体),额外的染色体载体(例如多拷贝质 粒)或整合载体(例如设计为用于整合至宿主细胞基因组并在宿主细胞复制 时产生另外的拷贝的核酸分子)以及穿梭载体(例如在原核和/或真核宿主中 都发挥作用)和转移载体(例如用于将核酸分子转移至病毒基因组内)。对于 本发明的目的，所述载体可以是自然发生的遗传来源、合成的或人工的、 或者是天然和人工元件的一些组合。

在本发明的上下文中，术语“载体”需要广泛理解为包括质粒和病毒载 体。“质粒载体”如本文所用是指可复制的DNA构建体。通常质粒载体含有 可选择标记物基因，其允许在存在相应选择药物的情况下选择或排除携带 有质粒载体的宿主细胞。各种阳性和阴性可选择标记物基因是本领域已知 的。作为说明,抗生素抗性基因可用作阳性可选择标记物基因，其允许在存 在相应选择抗生素的情况下选择宿主细胞。

术语“病毒载体”如本文所用是指包括至少一个病毒基因组元件并且 可以包装至病毒颗粒或包装到病毒颗粒内的的核酸载体。术语“病毒”、“病 毒粒体”、“病毒颗粒”和“病毒载体颗粒”可互换使用，是指核酸载体依据适 宜的条件(允许感染性病毒颗粒的产生)转导至适宜的细胞或细胞系时所形 成的病毒颗粒。在本发明的背景中，术语“病毒载体”必需宽泛地理解为包 括诱导核酸载体(例如DNA病毒载体)以及其产生的病毒颗粒。术语“感染 性”是指病毒载体感染并进入宿主细胞或生物体的能力。病毒载体可以是复 制-活性的或-选择性的(例如被改造为在特定的宿主细胞中更好地或选择性 的复制),或者可以是无遗传能力的从而是复制-缺陷的或复制-受损的。

适宜于本发明的背景的载体包括但不限于,用于在原核宿主细胞如细 菌中表达(例如大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或李斯特氏 菌(Listeria))的噬菌体、质粒或粘粒载体;用于在酵母(例如酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Saccharomyces pombe)、毕赤氏酵母 (Pichia pastoris))中表达的载体;用于在昆虫细胞系统(例如Sf9细胞)中表 达的杆状病毒载体;用于在植物细胞系统(例如Ti质粒,花椰菜花叶病毒 CaMV;烟草花叶病毒TMV)中表达的病毒和质粒载体;以及用于在高等真 核细胞或生物体中表达的病毒和质粒载体。

通常，此类载体是商业可购买的(例如Invitrogen、Stratagene、Amersham  Biosciences、Promega等)或者可得自保藏机构的如American Type Culture  Collection(ATCC,Rockville,Md.)或者在许多出版物中有描述其序列、组织 和生产方法从而使得技术人员能够应用。

适宜的质粒载体的代表性例子包括但不限于,pREP4、pCEP4 (Invitrogen)、pCI(Promega)、pVAX(Invitrogen)和pgWiz(Gene Therapy  System Inc)。

适宜的病毒载体的代表性例子可产生至各种不同的病毒(例如反转录 病毒、腺病毒、腺病毒-相关病毒(AAV)、痘病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、 泡沫病毒、α病毒,水疱性口炎病毒等)。如上文所述，术语“病毒载体” 涵盖载体DNA、基因组DNA以及其所产生的病毒颗粒。

本发明还涵盖与脂质或多聚物复合以形成颗粒结构如脂质体、脂复合 物或纳米颗粒的载体(例如质粒DNA)。

在一个实施方案中，本发明的载体是腺病毒载体。其可衍生自各种人 类或动物(例如犬、羊、猿等)腺病毒。可使用任何血清型。期望的是，所述 腺病毒载体是复制缺陷的并源自人类Ad,特别是源自稀有血清型的人类 Ad,或源自黑猩猩Ad。人类腺病毒的代表性例子包括亚属C Ad2Ad5和 Ad6,亚属B Ad11、Ad34和Ad35以及亚属D Ad19、Ad24、Ad48和Ad49。 Chimp Ad的代表性例子包括但不限于AdCh3(Peruzzi等,2009,Vaccine27: 1293)、AdCh63(Dudareva等,2009,vaccine27:3501)以及任何现有技术中 描述的那些(参见例如WO03/000283;WO03/046124;WO2005/071093; WO2009/073103;WO2009/073104;WO2009/105084;WO2009/136977和 WO2010/086189)。

复制缺陷腺病毒载体可以如现有技术中所述那样获得,例如通过缺失 病毒复制所必需的腺病毒基因组或其部分的至少一个区域,特别优选缺失 包含E1编码序列的E1区(例如参照人腺病毒5型的序列从大约位置459延 伸至3510，人腺病毒5型在GeneBank以登录号M73260、以及在Chroboczek 等,1992,Virol.186:280中有公开)。本发明还涵盖在腺病毒基因组内具有另 外的缺失/修饰(非必需的E3区的全部或部分或者其它必需的E2、E4区的 全部或部分，如WO94/28152;Lusky等,1998,J.Virol72:2022中所述)的载 体。

本发明的核酸分子可插入到腺病毒基因组的任何位置,并且可位于相 对于所涉及区域自然转录方向而言的有义或反义朝向。优选地，本发明的 核酸分子被插入至取代腺病毒E1区并置于CMV启动子的控制下。

适宜于本发明背景的其它病毒载体有痘病毒载体，其可得自痘病毒属 的任何成员，特别优选源自金丝雀痘、鸡痘或牛痘(痘苗vaccinia)病毒的痘 病毒载体,优选后者。适宜的痘苗病毒包括但不限于Copenhagen毒株 (Goebel等,1990,Virol.179:247;Johnson等,1993,Virol.196:381),Wyeth 毒株以及特别是修饰的Ankara(MVA)毒株(Antoine等,1998,Virol.244: 365)。构建重组痘病毒的一般条件是本领域熟知的。本发明的核酸分子优 选被插入至痘病毒基因组内的非必需基因座中。胸苷激酶基因特别适宜用 于插入到Copenhagen痘苗载体中，以及缺失II(deletion II)或缺失III (deletion III)适宜用于插入到MVA载体中。优选地，本发明的核酸分子被 插入到MVA载体的缺失III并置于痘苗7.5K或pH5R启动子的控制下。

适宜于本发明背景的病毒载体有麻疹病毒属，其可得自副粘液病毒科, 特别优选麻疹病毒。现有技术中有各种减毒的毒株(Brandler et al,2008, CIMID,31:271;Singh等,1999,J.Virol.73(6):4823),例如但不限于, Edmonston A和B毒株(Griffin等,2001,Field’s in Virology,1401-1441)、 Schwartz毒株(Schwarz A,1962,Am J Dis Child,103:216)、S-191或C-47毒 株(Zhang等,2009,J Med Virol.81(8):1477)。特别适宜在P和M基因之间 插入。

根据本发明，本发明的载体中所包含的核酸分子是适宜于在宿主细胞 或生物体中表达的形式,这意味着该核酸分子被置于适宜的调节序列的控 制下。如本文所用，术语“调节元件”是指允许、有助于或调节核酸分子在 给定宿主细胞或生物体中的表达的任何元件,包括核酸或其衍生物(即 mRNA)的复制(replication)、重复(duplication)、转录、剪接、翻译、稳定性 和/或转移。

本领域技术人员会理解，调节序列的选择可取决于这样的因素，如载 体本身、宿主细胞、所期望的表达水平等。启动子特别重要。在本发明的 上下文中，其对于引导核酸分子在许多类型的宿主细胞中的表达可以是组 成型的(constitutive)或者特异于特定的宿主细胞(例如肝特异性调节序列)或 者应对特定事件或外源因素而进行调节(例如通过温度、营养添加物、激素 等)或者根据病毒循环的阶段调节(例如晚期或早期)。为了优化载体的生产 并设法防止所表达的多肽的毒性，也可以使用在生产步骤期间应对特定事 件或外源因素而受阻抑的启动子。

适宜于哺乳动物细胞中组成型表达(constitutive expression)的启动子包 括但不限于巨细胞病毒(CMV)即时早期启动子(Boshart等,1985,Cell41: 521)、RSV启动子、腺病毒主要晚期启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子 (Adra等,1987,Gene60:65)、单纯疱疹病毒(HSV)-1的胸苷激酶(TK)启动 子和T7聚合酶启动子。痘苗病毒启动子特别适宜于痘病毒载体的表达。代 表性例子包括但不限于痘苗7.5K、H5R、11K7.5(Erbs等,2008,Cancer Gene Ther.15:18)、TK、p28、p11和K1L启动子,以及合成启动子如Chakrabarti 等(1997,Biotechniques23:1094)、Hammond等(1997,J.Virological  Methods66:135)和Kumar and Boyle(1990,Virology179:151)中所述的那些 以及早期/晚期嵌合启动子。适宜于麻疹介导的表达的启动子包括但不限于 引导麻疹转录单元表达的任何启动子(Brandler and Tangy,2008,CIMID31: 271)。肝特异性启动子包括但不限于以下的那些启动:HMG-CoA还原酶 (Luskey,1987,Mol.Cell.Biol.7:1881);固醇调节元件1(SRE-1;Smith等, 1990,J.Biol.Chem.265:2306);白蛋白(Pinkert等,1987,Genes Dev.1:268); 磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶(PEPCK)(Eisenberger等,1992,Mol.Cell Biol.12: 1396);α-1抗胰蛋白酶(Ciliberto等,1985,Cell41:531);人转铁蛋白 (Mendelzon等,1990,Nucleic Acids Res.18:5717);和FIX(US5,814,716)基 因。

本领域技术人员会理解，本发明的核酸分子表达的调节元件还可以包 含另外的元件，以用于：转录的适宜起始、调节和/或终止(例如polyA转录 终止序列),mRNA的转移(例如核定位信号序列)、加工(例如剪接信号)、和 稳定性(例如内含子和非编码5'和3'序列),翻译(例如起始区Met、三联前导 序列、IRES核糖体结合位点,Shine-Dalgarno序列等)至宿主细胞或生物体 内，以及纯化步骤(例如标签)。

本发明特别优选的实施方案涉及选自如下的载体(或病毒颗粒):

·缺陷Ad载体，其包含插入至E1区位置的置于启动子(如CMV启 动子)控制之下的核酸分子,并且编码突变体聚合酶多肽或融合蛋白，其中 所述突变体聚合酶多肽包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列，所述融合蛋白 包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所示氨基酸序列;

·缺陷Ad载体，其包含插入至E1区位置的置于启动子(如CMV启 动子)控制之下的核酸分子,并且包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或 SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列;

·复制缺陷Ad载体特别是缺陷AdCh3，其包含插入至E1区位置的 置于启动子(如CMV启动子)控制之下的核酸分子,并且包含SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列;

·MVA载体，其包含置于痘苗启动子(如7.5K或pH5R启动子)控制 之下的核酸分子,并且编码突变体聚合酶多肽或融合蛋白，其中所述突变体 聚合酶多肽包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:10所示氨基酸序列，所述融 合蛋白包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:12所示氨基酸序 列;和

·MVA载体，其包含置于痘苗启动子(如7.5K或pH5R启动子)控制 之下的核酸分子,并且包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO: 15所示的核苷酸序列。优选地，所述核酸分子被插入至MVA基因组的缺 失III。

如果需要，本发明的载体可以还包含一个或多个转基因,例如与本发 明的核酸分子一起在宿主细胞或生物体中表达的感兴趣的基，以旨在改善 对HBV感染或者任何由HBV感染引起的或与其相关的疾病或病况的治疗 或保护活性。适宜的转基因包括但不限于免疫调节剂如细胞因子和源自潜 在共感染生物体的任何其它抗原(例如HIV、结核分枝杆菌(Tuberculosis  mycobacterium)等)。如果使用转基因,其可由本发明的载体表达或者由组合 使用的独立载体(其可与本发明咋载体相同或不同)表达。例如，可以设想组 合使用表达聚合酶多肽或本发明的融合蛋白的腺病毒以及表达免疫调节剂 的腺病毒。

根据优选的实施方案，本发明的载体是感染性病毒颗粒的形式。通常， 通过包括如下步骤的方法来产生此类病毒颗粒:(a)将本发明的病毒载体引 入到适宜的细胞系中,(b)在适宜的条件下培养所述细胞系从而使所述感染 性病毒颗粒能够产生,(c)从所述细胞系的培养物回收所产生的病毒颗粒, 和(d)任选纯化所述回收的病毒颗粒。

当病毒载体是缺陷型时,所述颗粒通常在补充细胞系中产生或者经使 用辅助病毒产生,其反式(in trans)提供非功能性病毒基因。例如，用于补充 E1-缺失的腺病毒载体的适宜细胞系包括293细胞(Graham等,1997,J.Gen. Virol.36:59-72)以及HER-96和PER-C6细胞(例如Fallaux等,1998,Human  Gene Ther.9:1909-1917;WO97/00326)或这些细胞系的任意衍生物。但是本 领域中所描述的任何细胞系也都可用于本发明的背景中，特别是产生用于 人类用途产物的任何细胞系，如Vero细胞、HeLa细胞核禽类细胞特别适 宜于传代痘病毒载体。适宜的禽类细胞包括但不限于从得自孵化的卵的鸡 胚胎制备的原代鸡胚胎成纤维细胞(CEF),和鸭细胞系(例如WO03/076601, WO2009/004016,WO2010/130756和US2011-008872中所述的)。

感染性病毒颗粒可回收自细胞上清和/或裂解后的细胞。可以根据标准 技术将其进一步纯化(层析、在氯化铯梯度中超离心，如例如WO96/27677, WO98/00524,WO98/22588,WO98/26048,WO00/40702,EP1016700和 WO00/50573中所述)。

本发明还涵盖已经过修饰以允许优先靶向特定宿主细胞的载体或病 毒颗粒。靶向的载体的特征是在其表面存在配体，所述配体能够识别并结 合至细胞和表面暴露的成分如细胞特异性标记物(例如HBV-感染的细胞)、 组织特异性标记物(例如肝特异性标记物)、以及病毒(例如HBV)抗原。适宜 配体的例子包括针对HBV抗原结构域的抗体或其片段。可以通过将配体遗 传插入至病毒表面上存在的多肽(例如腺病毒纤维、五位体(penton)、pIX或 痘苗p14基因产物)来实现靶向。

宿主细胞

在另一方面，本发明还涉及包含本发明的核酸分子或载体(或病毒颗粒) 的宿主细胞。

如本文所用，术语“宿主细胞”应宽泛地理解，而不应受到涉及组织、 器官或分离的细胞中特定组成的任何局限。此类细胞可以是单一类型的细 胞或者不同类型细胞的组，如培养的细胞系、原代细胞和增殖细胞。在本 发明的上下文中，术语“宿主细胞”包括原核细胞、低等真核细胞如酵母、 和其它真核细胞如昆虫细胞、植物和哺乳动物(例如人或非人)细胞以及能够 产生本发明载体的细胞(例如293、HER96、PERC.6细胞、Vero、HeLa、 CEF、鸭细胞系等)。此术语包括可以或者已经接受了本文所述载体的细胞， 以及此类细胞的后代。可以在常规发酵生物反应器、烧瓶、和培养皿中培 养宿主细胞。可以在适宜于给定宿主细胞的温度、pH和氧气含量下进行培 养。本文不会详细描述各种原核和真核宿主细胞以及已知用于产生本发明 所使用的多肽和载体的方法。

根据本发明具体的实施方案，宿主细胞可进一步被包囊。细胞包囊技 术是本领域熟知的。

本发明的另一方面是用于重组产生本发明的突变体聚合酶多肽或融 合蛋白的方法,其中使用本发明的载体(或感染性病毒颗粒)和/或宿主细胞。 通常，所述方法包括(a)将载体引入适宜的宿主细胞以产生转染的或感染的 宿主细胞,(b)在适宜于所述宿主细胞生长非人条件下体外培养所述转染的 或感染的宿主细胞,(c)回收细胞培养物,和(d)任选地,从所回收的细胞和/ 或培养物上清纯化所述突变体聚合酶多肽或融合蛋白。

本领域技术人员应能够知晓本领域中可用的许多表达系统以用于在 适宜的宿主细胞(如上文所述的那些)中表达突变体聚合酶多肽或融合蛋白， 以及知晓用于将载体引入宿主细胞的方法。此类方法不包括但不限于，显 微注射、CaPO₄-介导的转染、DEAE-葡聚糖-介导的转染、电穿孔、脂染/ 脂质融合、基因枪、转导、病毒感染以及通过各种手段直接施用至宿主生 物体内。本发明的载体可与转染试剂组合使用以便促进引入宿主细胞,如多 阳离子聚合物(例如壳聚糖、聚甲基丙烯酸酯、PEI等)和阳离子脂质(例如 DC-Chol/DOPE、目前可得自Promega的转染阳离子脂质体(transfectam  lipofectin))。

可以在常规发酵生物反应器、烧瓶、和培养皿中培养宿主细胞。可以 在适宜于给定宿主细胞的温度、pH和氧气含量下进行培养。继而可以通过 熟知的纯化方法来纯化所述突变体聚合酶多肽或所述融合蛋白，包括硫酸 铵沉淀、酸萃取、凝胶电泳;过滤和层析方法(例如反相、大小排阻、离子 交换、亲和性、疏水相互作用、羟基磷灰石、高效液相层析等)。要使用的 条件和技术取决于如下因素：例如净电荷、分子量、疏水性、亲水性，并 且对于本领域技术人员而言是显见的。另外，纯化的水平将取决于用途。

组合物

在另一方面，本发明提供了组合物，其包含至少本文所述的突变体聚 合酶多肽或融合蛋白、核酸分子、载体(例如感染性病毒颗粒)、或宿主细胞 (本文也称作“活性物质”)或其任意组合(例如本文所述的不同多肽或载体/ 病毒颗粒的组合或者不同基因型的组合)。优选地，所述组合物是药物组合 物，其在治疗有效量的活性物质之外还包含药学可接受的载剂。

如本文所用，“药学可接受的载剂”包括任何和所有的载体(carrier)、 溶剂、稀释剂、赋形剂、佐剂、分散介质、包被、抗细菌和抗真菌剂、和 吸收减缓剂,及类似的等,其适宜于施用至宿主生物体以及特别是人类。

如本文所用，“治疗有效量”是足以减缓一种或多种通常与HBV感染 相关的症状的剂量或者足以减缓由HBV感染引起的或与其相关的任何疾 病或病况的剂量。当涉及预防应用时,此术语是指足以防止或延缓HBV感 染的建立的剂量。“治疗性”组合物被设计和施用于已经感染HBV的宿主 生物体，目的在于缓解或改善至少一种由所述HBV感染引起或与其相关的 疾病或病况,最终与一个或多个本文所述的常规治疗手段组合(例如用核 苷、核苷酸类似物和/或基于IFN的疗法治疗)。例如，诱导免疫应答的治疗 有效量可以是引起免疫系统激活所需的量(例如导致发展出抗-HBV应答)。

术语“宿主生物体”一般是指需要或者可得益自本发明的任意产品和 方法的脊椎动物,特别是许多哺乳动物物种以及尤其是家养动物、农牧动 物、体育动物、和灵长类包括人类，如已经诊断为感染HBV或有感染HBV 风险的生物体(其因而疑似患有或者有风险会患有由HBV感染引起的或与 其相关的疾病或病况)。在优选的实施方案中,所述宿主生物体是慢性感染 了HBV病毒或者共感染了HBV病毒和其它病毒(例如人类免疫缺陷病毒 HIV)的人类患者。感染性HBV可以来自与所述突变体聚合酶多肽或本发明 使用的任何其它HBV多肽/肽所源自的HBV(例如基因型D)相同的基因 型、毒株或分离物，或者其可以来自不同的基因型(例如基因型B或C)。 本发明人最近研究了基于基因型D的疫苗组合物的交叉反应潜力(参见美 国申请13/423,193)。大规模的计算机研究显示出，HBV聚合酶、核心和 Env蛋白的氨基酸序列在基因型B、C和D之间于蛋白整体水平高度保守， 而在T细胞表位水平也是如此。在适宜动物模型中的体内免疫支持了诱导 交叉反应T细胞应答(识别基因型B和C表位)的能力。即使将此研究局限 于HLA-A2表位,其也证明了基于基因型D抗原的疫苗组合物能够诱导与 其它HBV基因型交叉反应的T细胞应答。

本发明的组合物适宜被缓冲，以便适宜以生理或微碱性的pH来用于 人类用途(例如大约pH7至大约pH9)。适宜的缓冲剂包括但不限于磷酸 盐缓冲剂(例如PBS)、碳酸氢盐缓冲剂和/或Tris缓冲剂。

本发明的组合物还可包含适用于人类或动物用途的稀释剂。其优选是 等渗的、低渗的或微弱高渗的，并具有相对低的离子强度。代表性的例子 包括蒸馏水、生理盐水(例如氯化钠)、Ringer’s溶液、葡萄糖、海藻糖或蔗 糖溶液、Hank’s溶液、以及其它水成的生理平衡盐溶液(参见例如最新版的 Remington:The Science and Practice of Pharmacy,A.Gennaro,Lippincott, Williams&Wilkins)。

本发明的组合物中所包括的药学可接受的载剂必须也允许在生产和 长期储存的条件下于冷冻(例如-70℃,-20℃)、冷藏(例如4℃)或室温中保持 其稳定性(即至少一个月，优选至少一年)。对于这一方面,formulations which  are particularly adapted to特别适于本发明的组合物的配制物包括(a)1M蔗 糖,150mM NaCl,1mM MgCl₂,54mg/l Tween80,10mM Tris pH8.5(尤其 在活性物质是腺病毒载体时);(b)10mg/ml甘露醇,1mg/ml HSA,20mM Tris,pH7.2,和150mM NaCl;以及(c)生理盐水。

另外的药学可接受的赋形剂可用于提供所期望的药学或药代动力学 性质,包括例如修饰或保持配制物的pH、渗透性、粘度、澄清、颜色、无 菌、稳定性、溶出率(rate of dissolution),修饰或保持释放或吸收至日人或动 物生物体中，促进穿越血液屏障的转移或进入特定的器官(例如肝)。

另外，本发明的组合物可包含适宜于在人类中全身性或粘膜应用的一 种或多种佐剂。优选地，所述佐剂能够刺激对本发明组合物的免疫性,特别 是T细胞介导的免疫性，例如通过Toll样受体(TLR)如TLR-7、TLR-8和 TLR-9。可使用的佐剂的代表性例子包括但不限于铝、矿物油乳剂如弗氏完 全佐剂和弗氏不完全佐剂(IFA)、脂多糖或其衍生物(Ribi等,1986, Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins,Plenum Publ. Corp.,NY,p407-419),皂苷类如QS21(Sumino等,1998,J.Virol.72:4931; WO98/56415)、咪唑-喹啉化合物如咪喹莫特(Imiquimod)(Suader,2000,J. Am Acad Dermatol.43:S6),S-27609(Smorlesi,2005,Gene Ther.12:1324)和 相关的化合物如WO2007/147529中所述的,胞嘧啶磷酸酯鸟苷寡聚脱氧核 苷酸如CpG(Chu等,1997,J.Exp.Med.186:1623;Tritel等,2003,J. Immunol.171:2358)以及阳离子肽如IC-31(Kritsch等,2005,J.Chromatogr  Anal.Technol Biomed Life Sci822:263)。

本发明的组合物适宜于各种使用方式。

术语“施用”(以及施用的任何形式如“施用了”)如本文所用是指将治疗 剂如本文所述的突变体聚合酶多肽、融合蛋白、核酸分子、载体递送至宿 主细胞或生物体。现有技术中有许多方法和手段如直接施用至宿主生物体。

直接施用可通过全身、局部或粘膜途径进行。全身施用包括例如皮下、 皮内、肌内、静脉内(例如注射至供应肝脏的静脉如门静脉)、腹膜内、瘤内、 血管内、动脉内注射(例如通过肝动脉灌注)以及划破(scarification)。可以使 用常规针筒和针头进行注射,或使用本领域中任意其它适宜的设备(例如电 穿孔)。或者，本发明的组合物可经粘膜途径施用,如口服/消化、鼻内、气 管内、肺内、阴道内或直肠内途径。can可通过小迪的喷雾或烟雾、喷雾 剂、或干粉状的组合使用适宜的投放器来进行呼吸道中的施用。也可以使 用经皮手段来进行局部施用(例如贴片等)。

在本发明的上下文中，所述组合物优选配制为用于肌内、皮下、皮内 施用或划破。

本发明的组合物可以是各种形式,例如固态、液态或冷冻的。固态(例 如干粉化的或冻干的)组合物可以通过涉及真空干燥和冷冻干燥的方法来 获得。对于粘膜施用,可将所述组合物配制成胃抗性胶囊和颗粒以用于口服 施用,配制成栓剂以用于直肠或阴道施用,最终与有助于提高粘膜膜的孔 大小的吸收增强剂组合。此类吸收增强剂通常是这样的物质，其与粘膜膜 的磷脂结构域具有结构相似性，如脱氧胆酸钠、甘胆酸钠、二甲基-β-环糊 精、十二烷基-1-溶血磷脂胆碱)。

适宜的剂量可以作为各种参数的函数来调节,特别是施用方式;所使 用的组合物;宿主生物体的年龄、健康和体重;症状的性质和程度;同时进 行的治疗的类型;治疗的频率;和/或预防或治疗的需要。基于相关的情况， 施行者能够常规地确定所需计算的其它改善。

作为一般指引,含载体组合物的适宜剂量从10⁵至约10¹³vp(病毒颗 粒)、iu(感染性单位)或pfu(噬斑形成单位)不等,取决于所使用的载体和定 量技术。可用于评估样品中存在的vp、iu和pfu的量的技术是本领域内常 规的。例如，腺病毒颗粒(vp)的数目通常是通过测量A260光吸收或通过 HPLC来确定的,iu滴度是通过定量DBP免疫荧光确定的，而pfu则是通 过计数许可的细胞感染后的噬斑数目来确定的。根据FDA指引，优选vp/iu 比率低于100。优选的剂量含有约10⁵至约10¹²的vp,特别优选的剂量为约 5x10⁸、约10⁹、约5x10⁹、约10¹⁰、约5x10¹⁰vp或约10¹¹vp的本发明的腺 病毒载体。约5x10⁵至约10⁹pfu的剂量优选用于基于痘苗(MVA)的组合物， 特别优选对的剂量为约5x10⁶、约10⁷、约5x10⁷、约10⁸或约5x10⁸pfu。基 于载体质粒的组合物可以10μg-20mg之间的剂量施用,有利的是在100 μg-2mg之间。蛋白组合物可以10ng-20mg之间的一个或多个剂量施用,特 别优选的剂量为约0.1μg至约2mg的免疫原性多肽每kg体重。可以单次 剂量或在一定时间间隔之后的一或多次重复剂量来进行施用。

在另一具体的实施方案中，本发明的突变体聚合酶多肽、融合蛋白、 核酸分子、载体、宿主细胞或组合物，可以与另外的多肽或肽或编码该另 外的多肽或肽的载体组合使用。优选地，所述另外的多肽或肽是HBV抗原， 特别优选如本文所述的Hbc多肽和/或一个或多个HBs免疫原性结构域。所 述HBV多肽或肽可以从载体表达,特别是选自如下的载体：质粒DNA、 腺病毒(例如Ad5、AdCh3、AdCh63等)、痘病毒(例如牛痘如MVA)和麻疹 载体。因此本发明还涉及这样的组合物，其包含编码本发明的突变体聚合 酶多肽或融合蛋白的载体以及编码至少一种另外的多肽/肽(如本文所述的 HBV核心和/或HBs免疫原性结构域)的载体的混合物。

本发明的突变体聚合酶多肽、融合蛋白、核酸分子、载体、宿主细胞 或组合物可用于治疗各种疾病和病理状况的方法,特别是那些由HBV感染 引起的或与其相关的。因此，本发明还涵盖了，本发明的突变体聚合酶多 肽、融合蛋白、核酸分子、载体、宿主细胞或组合物用于根据本文所述的 疗法治疗或预防HBV感染、HBV-相关疾病和病理状况的用途,特别是慢性 HBV感染。本发明还涉及在有需要的生物体中进行治疗的方法，包括根据 本发明的疗法向所述生物体施用至少一次此类活性物质，其中所述施用是 以足以治疗或预防HBV感染(例如特别是慢性HBV感染)的量或者足以改 善一个或多个与HBV-相关疾病和病理状况相关的症状的量。在特定的实施 方案中,可以根据本文所述的疗法利用本发明的活性物质和方法来打破 HBV慢性对象中通常会遇到的HBV-特异性免疫耐受。

术语“治疗(treating)”(以及任何形式的治疗如“治疗(treatment)”)如本文 所用是指预防(例如对有感染HBV的风险的对象进行预防)和/或医疗 (therapy)(例如在诊断为感染了HBV的对象中)。其对于治疗HBV慢性感染 和/或HBV感染患者中的肝损伤(包括肝硬化和肝癌)特别有用。治疗需要向 宿主细胞或生物体外部施用或内部施用医疗剂如本文所述的突变体聚合酶 多肽,最终与其它HBV多肽组合或者与with the护理标准(SOC)(例如用核 苷或核苷酸类似物治疗)组合。

通常，在根据本文所述的疗法施用至宿主生物体内之后,本发明的突 变体聚合酶多肽、融合蛋白、核酸分子、载体、宿主细胞和/或组合物对被 治疗的宿主生物体提供医疗益处(相对于基准状态或相对于不进行治疗所 预期的状态)。所述医疗益处可以由医师或其它技术护理人员通常使用的相 关的临床测试来证实,包括例如，经治疗的生物体的血液、血浆或血清中所 定量的HBV病毒负载的降低,和/或肝酶活性水平的降低(例如丙氨酸氨基 转移酶(ALT)和/或天冬氨酸氨基转移酶(AST)),和/或疾病稳定了的(未恶化) 状态(例如通常与HBV感染相关的病况的稳定或减轻，如肝炎症/脂肪化/ 纤维化),和/或血清标记物水平的降低如HBeAg或HBsAg(例如HBe或 HBs血清转化),和/或所治疗的生物体对常规疗法反应的改善和/或和/或相 对于不治疗所预期的存活而言存活延长。

在本发明的上下文中，所述医疗益处可以是暂时的(在中断施用之后持 续f一个或两个月)或者是持续的(几个月或几年)。由于临床状态的自然进 程在不同患者之间可以有很大不同,并不需要在每个经治疗的生物体中均 观察到所述医疗益处，而只需要在显著数目的生物体中观察到即可(例如可 通过本领域已知的任何统计学检验来确定两个组之间的统计学显著差异, 例如Tukey参数检验、Kruskal-Wallis检验、根据Mann和Whitney的U检 验、Student’s t-检验、Wilcoxon检验等)。

此类测量可以在本文所述的施用之前进行(基准)以及在治疗期间的各 个时间点进行并且在治疗终止后至少进行12周。作为一般指引,可以使用 PCR测定或本领域可接受的任何其它方法来测定病毒负载(例如Roche  Ampli Prep/Cobas Taqman测定v2.0,Abbott实时乙肝病毒表现测定)。在优 选的实施方案中，施用本发明的突变体聚合酶多肽、融合蛋白、核酸分子、 载体、宿主细胞和/或组合物会导致病毒负载的降低(暂时的或持续至少一个 log₁₀、优选至少1.5个log₁₀、更优选至少2个log₁₀)，这是相较于基准时的 测量的病毒负载或者相较于对照组(未治疗对象)。施用本文所述的活性物质 可导致与基准或对照组相比至少暂时回归正常的ALT和/或AST值。肝酶 活性的水平可以常规地在医学实验室或医院进行评估。或者，施用本文所 述的活性物质会导致血清标记物HBe和/或HBs至少暂时的降低至少一个 log₁₀、优选至少1.5个log₁₀更优选至少2个log₁₀(相较于基准时测量的血 清标记物水平或者相较于对照组(未治疗对象))。HBV血清标记物的水平可 以常规地在医学实验室或医院进行评估，并且大量的试剂盒也是商业可购 买的(例如Abbott Laboratories,Organon Technika开发的免疫测定)。

优选地，使用或施用本发明的突变体聚合酶多肽、融合蛋白、核酸分 子、载体、宿主细胞和/或组合物以用于在经治疗的生物体中激发或刺激免 疫应答。因此，本发明还涵盖通过在宿主生物体中施用本发明的突变体聚 合酶多肽、融合蛋白、核酸分子、载体、宿主细胞和/或组合物，以用于激 发或刺激针对HBV的免疫应答的方法。

所激发的或刺激的免疫应答可以是特异性的(即针对HBV表位/抗原) 和/或非特异性的(先天的)、体液的和/或细胞的。在本发明的上下文中，优 选所述免疫应答是针对HBV多肽/表位的T细胞应答CD4+或CD8+-介导 的，或者是这两者。

本文所述活性物质激发免疫应答的能力可以使用各种直接或间接测 定在体外或体内进行评估,这是本领域内的标准技术。下文中的实施例部分 也对测试和验证进行了说明。

对于可用于评估免疫应答的发起和激活的技术的一般描述,参见例如 Coligan等(1992和1994,Current Protocols in Immunology;ed J Wiley&Sons  Inc,National Institute of Health或随后的版本)。刺激体液应答的能力可以通 过抗体结合和/或竞争结合来确定(参见例如Harlow,1989,Antibodies,Cold  Spring Harbor Press)。

对于非特异性免疫的评估，可以例如通过测量NK/NKT-细胞(例如激 活的代表活性和水平),以及IFN相关细胞因子和/或趋化因子产生盒,TLR 和其它先天免疫标记物的激活(Scott-Algara等,2010PLOS One5(1),e8761; Zhou等,2006,Blood107,2461-2469;Chan,2008,Eur.J.Immunol.38, 2964-2968)。

评估细胞免疫可以例如通过如下方式：使用常规生物测定对激活的T 细胞(包括那些衍生自CD4+和CD8+的T细胞)所产生的细胞因子进行定量 (例如通过ELISpot、通过多参数流式细胞术或ICS、通过使用多元技术或 ELISA进行的细胞因子谱分析等来对T细胞进行表征和定量);确定T细胞 的增殖能力(例如通过[³H]胸腺嘧啶掺入测定来进行T细胞增殖测定);测定 抗原特异性T淋巴细胞在致敏化的对象中的细胞毒性能力；或通过适宜的 动物模型的免疫。

本发明的突变体聚合酶多肽、融合蛋白、核酸分子、载体、宿主细胞 和/或组合物的免疫原性能力也可在动物模型中确认,可以用适宜的感染性 或肿瘤诱导物质来攻击所述动物模型(例如表达HBV基因产物的痘苗病毒 或单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria Monocytogenes))或者用编码全长HBV 基因组的DNA来注射所述动物模型(如Huan等,2010,Proc.Natl.Acad. Sci.107:9340中所述),以确定所述感染性或肿瘤诱导物质的中和以及最终 对相关症状的部分抗性,反映出抗-HBV免疫应答的诱导或增强。示例性的 动物模型包括但不限于实施例中所述的HLA-A2.1转基因小鼠、和Chisari 等(1996,Curr.Top.MicroBiol.Immunol.,206:149)和Halverscheid等(2008, J.Med.Virol.80:583)中所述的HBV转基因小鼠。

所述用途或方法包括一次或多次施用(1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10等)治疗有效量的所述活性物质,所述施用彼此之间由适宜的时间段所间 隔并且由相同的施用途径或不同的施用途径在相同部位或不同部位来进 行。在本发明背景中特别优选肌内和皮下途径。彼此间隔大约一周的三次 皮下施用特别适宜于基于MVA的组合物和载体，而一次或两次肌内(彼此 可间隔大约一个月或更久)或皮下施用特别适宜于基于Ad的组合物和载 体。第一系列的施用两个月或若干个月之后可接着使用相同的活性物质进 行一次或多次随后的施用，以便唤起抗-HBV免疫应答。

如果需要，本发明的方法或用途可以与一个或多个常规疗法组合进行 (例如放疗、化疗和/或手术)。优选地，本发明的方法或用途与一种或多种 药物关联，所述药物可用于治疗或预防HBV感染、HBV-相关疾病和病理 状况。它们的施用可以在本发明活性物质的施用之前、同时或之后。适宜 药物的代表性的例子包括但不限于聚合酶抑制剂、RNase H抑制剂、核苷 类似物、核苷酸类似物、TLR激动剂、IFN、N-糖基化抑制剂、siRNA、反 义寡核苷酸、抗-HBV抗体、免疫调节剂、治疗疫苗和通常用于治疗HBV 相关肝癌的抗肿瘤物质(例如阿霉素、阿霉素(adriamicin)与碘油或索拉菲尼 (sorasenib))。另外，所述活性物质可以与其它治疗性疫苗组合使用，如合 成肽、重组抗原、VLP、编码HBV蛋白(核心、preS1、PreS2、S和/或聚合 酶)的载体，其特别适宜于引发抗-HBV体液应答。本发明特别适宜的方法 或用途是，与护理标准组合，以及特别是与细胞因子治疗组合(例如IFNα， 聚乙二醇化的IFNa2a或2b如Pegasys(Roche)、Pegintron(Schering Plough) 或IntronA(Schering Plough))和/或与核苷或核苷类似物(NUC)如拉米夫定、 恩替卡韦、替比夫定、阿德福韦、阿德福韦酯(dipivoxil)或替诺福韦组合。 用NUC治疗仅仅是部分有效的(1年的治疗之后仅在3-5%的对象中观察到 感染的解决)并且需要长期医疗(可能是终生的)。预期本发明的活性物质和 方法会带来能补充NUC对病毒复制的作用的免疫维度,由此导致对此类治 疗的改善(例如降低实现医疗益处所需的NUC的剂量和缩短所需NUC治疗 的时间)或解决感染百分比的提高(超过5%)。

在具体的实施方案中,可以根据初免-加强(prime boost)疗法来进行本 发明的方法或用途，其包括顺序施用一次或多次初免组合物以及一次或多 次加强组合物。通常，初免和加强组合物使用包含或编码至少共同的抗原 结构域的不同的载体。另外，初免和加强组合物可以由相同的途径或不同 的途径施用于相同部位或不同部位。例如，基于多肽的组合物可通过粘膜 途径施用，而基于载体的组合物优选注射,例如皮下注射MVA载体、肌内 注射DNA质粒以及皮下或肌内注射腺病毒载体。

在一个实施方案中，用MVA载体进行初免以及用Ad载体进行加强, 特别优选编码本文所述突变体聚合酶蛋白或融合蛋白(例如SEQ ID NO:8 所示的融合蛋白)的MVA和/或Ad载体。将MVA载体施用至生物体一次 或多次，随后施用腺病毒载体一次或多次，特别优选至少3次皮下施用MVA 载体(以3天至3个月不等的时间段间隔)随后肌内或皮下加强腺病毒载体 (例如MVA初免之后大约1个月至1年)。

在另一实施方案中，用质粒DNA载体进行初免以及用MVA载体进 行加强,特别优选编码本文所述突变体聚合酶蛋白或融合蛋白(例如SEQ  ID NO:8所示的融合蛋白)的质粒和/或MVA载体。将DNA载体施用至生 物体一次或多次，随后施用MVA载体一次或多次，特别优选至少3次肌 内施用DNA载体(以2周至3个月不等的时间段间隔)和至少一次皮下加强 MVA载体(例如DNA初免之后大约1个月至1年)。优选地，通过电穿孔 施用所述DNA载体。

本发明还涉及试剂盒，其用于HBV感染或者HBV相关疾病或病理状 况的治疗,其中所述试剂盒包含多个选自如下的活性物质：本发明的突变体 聚合酶多肽、融合蛋白、核酸分子、载体、宿主细胞和/或组合物以及用于 将所述多个活性物质施用至有需要的生物体的说明。更优选地，所述生物 体是慢性感染了HBV的患者。

上文所引用的所有专利公开、出版物和数据库条目都具体地以其整体 援引加入本文，就如同具体且独立地指出将这些单独的专利、出版物或条 目援引加入本文。

附图描述

图1说明了本发明的突变体聚合酶多肽、融合蛋白和抗原组合。

图2说明了在用质粒pTG18188(Core-Pol-Env1-Pol-Env2-Pol)、 pTG18194(Core-Pol)或pTG13135(空)免疫HLA-A2转基因小鼠后进行的 Elispot IFNg测定。结果表示为10⁶细胞的斑点数，对应特异于每种HBV HLA-A2肽的产IFNg细胞的频率，在经免疫小鼠的10⁶脾细胞的实验中评 估。每个条代表用一种或其它质粒接种的个体小鼠并由其参考编号表示(1.1 或2.3……等)，并且用相同质粒免疫的所有小鼠的平均也在每组中标出(图 中标为“平均”的条)。对于个体小鼠和平均,将特异于不同测试肽的产IFNg 细胞的频率堆叠。条由不同的符号填充,每种符号代表针对一种具体HBV 肽的应答，如图中标注所示。

图3A-F说明了在用质粒pTG18188(Core-P-E1-P-E2-P或 Core-Pol-Env1-Pol-Env2-Pol)、pTG18194(Core-Pol)或pTG13135(空)免疫 HLA-A2转基因小鼠后进行的ICS测定。结果表示为产IFNg(单独或与TNFa 组合)的CD8(图3A、3B、3D继而3F)、或CD4(图3C和3E)T细胞的百分 比，特异于每种HBV HLA-A2肽(图3A)或涵盖HBV核心的肽汇集(图3B 和3C)、聚合酶(图3D和3E)和env(图3F)抗原。每个条代表用一种或其它 质粒接种的个体小鼠并由其参考编号表示(1.1或2.3……等)，并且用相同质 粒免疫的所有小鼠的平均也在每组中标出(图中标为“平均”的条)。对于个 体小鼠和平均,将特异于不同测试肽的CD8或CD4T细胞的频率堆叠。条 由不同的符号填充,每种符号代表针对一种具体HBV肽的应答，如图中标 注所示。

图4说明了在用腺病毒AdTG18201(Core-Pol-Env Ad)、 AdTG18202(Core-Pol Ad)、AdTG18203(Pol Ad)和AdTG15149(空Ad)免疫 HLA-A2转基因小鼠后进行的Elispot IFNg测定。结果表示为10⁶细胞的斑 点数，对应特异于每种涵盖感兴趣抗原的肽汇集的产IFNg细胞的频率，在 经免疫小鼠的10⁶脾细胞的实验中评估。每个条代表用一种或其它质粒接种 的个体小鼠并由其参考编号表示(1.1或2.3……等)，并且用相同质粒免疫的 所有小鼠的平均也在每组中标出(图中标为“平均”的条)。对于个体小鼠和 平均,将特异于不同测试肽的产IFNg细胞的频率堆叠。条由不同的符号填 充,每种符号代表针对一种具体HBV肽的应答，如图中标注所示。

图5说明了在用AdTG18201(Core-Pol-Env Ad)免疫HLA-A2转基因 小鼠后进行的Elispots IFNg测定。结果表示为10⁶细胞的斑点数，对应特异 于每种HBV HLA-A2表位、或不相关肽的产IFNg细胞的频率，在经免疫 小鼠的10⁶脾细胞的实验中评估。每个条代表用AdTG18201接种的个体小 鼠(用其参考号码表示,3.1to3.8)，并且所有这些用AdTG18201免疫的小鼠 的中位值也标出(图中标为“中位值”的条)。对于个体小鼠和中位值,将特 异于不同HBV HLA-A2表位的产IFNg细胞的频率堆叠，而在存在不相关 肽时所观测到的产IFNg细胞的频率在另外的条中标出(图中标为“Irrel”的 条)。条由不同的符号填充,每种符号代表针对一种具体HBV肽的应答，如 图中标注所示。

图6说明了在用AdTG18201(Core-Pol-Env Ad)或AdTG15149(空Ad) 免疫HLA-A2小鼠后进行的ICS测定。结果表示为单独或与TNFa组合产 IFNg的CD8T细胞的百分比,特异于两种选择的肽汇集,称作PP8和PC1, 并分别涵盖了HBV聚合酶的部分(氨基酸725-835)和HBV核心蛋白的部分 (氨基酸1-100)。每个条代表用一种或其它腺病毒接种的个体小鼠并由其参 考编号表示(1.1或3.2……等)，并且用相同腺病毒免疫的所有小鼠的中位值 也在每组中标出(图中标为“中位值”的条)。条由不同的符号填充,每种符 号代表所检测的CD8T细胞产生的细胞因子，如图中标注所示。

图7说明了在用AdTG18201(Core-Pol-Env Ad)或AdTG15149(空Ad) 免疫HLA-A2小鼠后进行的体内CTL测定。结果表示为体内特异性裂解的 百分比,也即特异于所测试的HBV HLA-A2表位的裂解。每个正方形或三 角形符号代表个体小鼠，并且用相同腺病毒免疫的所有小鼠的平均也在每 组中标出(图中以粗条符号表示)。

图8说明了在用AdTG18201(Core-Pol-Env Ad)或AdTG15149(空Ad) 免疫HBV转基因小鼠后进行的ICS测定。结果表示为产IFNg和特异于表 位的TNFa的CD8T细胞的百分比，所述表位来自HBV聚合酶(2种肽的混 合,称作VSA和N13F)或来自HBV包膜(1种肽F称作13L)，并且在经接 种的小鼠的脾和肝中发现了二者。每个条代表用一种或其它腺病毒接种的 个体小鼠并由其参考编号表示(1.1或3.2……等)，并且用相同腺病毒免疫的 所有小鼠的中位值也在每组中标出(图中标为“中位值”的条)。图中标出的 虚线对应实验的截断值,也即阈值，在其上观测到的CD8T细胞百分比被认 为是阳性免疫应答。

图9说明了在用AdTG18201(Core-Pol-Env Ad)以不同剂量(从10⁵iu至 10⁹iu)免疫HLA-A2转基因小鼠后进行的Elispots IFNg测定。结果表示为 10⁶细胞的斑点数，对应特异于每种HBV HLA-A2表位、或不相关肽、或 仅存在培养基的产IFNg细胞的频率，在经免疫小鼠的10⁶脾细胞的实验中 评估。每个实线或虚线条代表用AdTG18201接种的个体小鼠并且所有用 AdTG18201以一种具体剂量免疫的小鼠的平均也标出(阴影线的条)。不同 剂量由不同颜色或符号表示，如图中标注所示。虚线表示截断值,如材料和 方法部分中所定义,在其上所观测到的T细胞应答被认为是阳性的。

图10说明了在用AdTG18202(Core-Pol Ad)根据不同的注射日程免疫 HLA-A2转基因小鼠后进行的Elispots IFNg测定。小鼠被免疫一次(正方形) 或者以一周的间隔接受3次注射(三角形)或一周的间隔接受6次注射(圆形)。 结果表示为10⁶细胞的斑点数，对应特异于每种HBV HLA-A2表位、或腺 病毒载体、或不相关肽、或仅存在培养基的产IFNg细胞的频率，在经免疫 小鼠的10⁶脾细胞的实验中评估。每个符号(正方形,三角形或圆形)代表用 AdTG18201接种的个体小鼠并且所有用AdTG18202以一种测试的日程免 疫的小鼠的平均由粗实线表示。虚线表示截断值,如材料和方法部分中所定 义,在其上所观测到的T细胞应答被认为是阳性的。

图11说明了在用AdTG18202(Core-Pol Ad)根据不同的注射日程免疫 HLA-A2转基因小鼠后进行的Elispots IFNg测定。小鼠在监测T细胞应答 之前2周被免疫一次(组1，由正方形表示)、或在监测T细胞应答之前20 周被免疫一次(组2，由三角形表示)、或以2个月的间隔被免疫两次(组3， 由圆形表示)、或以4个月的间隔被免疫两次(组4，由叉表示)、或以2个月 的间隔被免疫三次(组5，由菱形表示)。对于除了组2之外的所有组,在最 后一次注射2周之后监测T细胞应答。结果表示为10⁶细胞的斑点数，对应 特异于每种HBV HLA-A2表位、或不相关肽、或仅存在培养基的产IFNg 细胞的频率，在经免疫小鼠的10⁶脾细胞的实验中评估。每个符号(正方形, 三角形、圆形、叉、菱形)代表用AdTG18202接种的个体小鼠并且所有用 AdTG18201以一种测试的日程免疫的小鼠的平均由粗实线表示。虚线表示 截断值,如材料和方法部分中所定义,在其上所观测到的T细胞应答被认为 是阳性的。

实施例

1.材料和方法

如下所示的构建(参见图1)是根据如Maniatis等(1989,Laboratory  Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor NY或 subsequent editions)中所述的一般遗传改造和分子克隆技术来进行的，或者 在使用商业试剂盒时是根据厂商推荐进行的。PCR扩增技术是本领域技术 人员熟知的(参见例如PCR protocols–A guide to methods and applications, 1990,由Innis,Gelfand,Sninsky andWhite,Academic Press出版)。携带有氨 苄青霉素抗性基因的重组质粒在大肠杆菌C600(Stratagene)中于补加了 100μg/ml抗生素的琼脂或液体培养基中复制。

MVA载体的构建由穿梭质粒和MVA基因组之间的同源重组来产生， 如之前所述Erbs等(2008,Cancer gene Ther.15:18)。该“基本的”穿梭质粒含 有多克隆位点、由缺失III的旁侧序列包围的痘苗病毒(VV)启动子以及在 p11K7.5痘苗启动子(Falkner and Moss,1988)控制之下的大肠杆菌黄嘌呤 鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(GPT)选择基因。简言之，用没有任何插入转基 因的基因组MVA(MVA-null)感染了CEF细胞，并继而通过CaCl₂沉淀用穿 梭质粒(携带感兴趣的基因，克隆于VV启动子的下游)转染。同源重组在 MVA-null和所述穿梭质粒之间发生，并且通过多个步骤的霉酚酸选择分离 了重组病毒。重组MVA病毒由PCR控制,在CEF中扩增，并通过噬斑测 定在CEF上对病毒储备(stock)进行滴定。

对于腺病毒载体构建,首先通过将感兴趣的核酸分子插入至所述“基 本的”穿梭质粒pTG13135中而构建了腺病毒穿梭质粒。通常，将核酸分 子插入至pTG13135的NheI和NotI限制酶且位点内(pTG13135含有CMV 驱动的表达盒，其被腺病毒序列所包围(分别是腺病毒核苷酸1454及核苷 酸35135781))以允许通过同源重组进一步产生载体基因组(Chartier等, 1996,J.Virol.70:4805)。继而通过重组穿梭载体(经Bst1107I和PacI消化) 与经ClaI消化线性化的pTG15375(编码完整的腺病毒基因组)之间的同源重 组来获得腺病毒载体。所得的腺病毒载体是E3(核苷酸2786730743)和E1 (核苷酸4553512)缺失的,其中E1区域置换为表达盒,其从5’至3’含有： CMV即时早起增强子/启动子、嵌合的人β球蛋白/IgG内含子(如可得自 Promega的pCI载体中所发现的)、感兴趣的核酸分子和SV40晚期多腺苷 酸化信号。继而通过将经PacI线性化的病毒基因组转染至E1补充细胞系 中而获得腺病毒颗粒。病毒传代、纯化和滴定如此前所述那样进行(Erbs等, 2000,Cancer Res.60:3813)。

1.1.载体构建和产生

下文说明的载体已经过改造以表达突变体聚合酶多肽(最终融合至核 心多肽和/或包膜蛋白的免疫原性结构域)。所有HBV序列源自HBV毒株 Y07587，其序列如国际数据库中(Genbank Y07587)及不同出版物中所述。 其是血清型ayw的基因型D病毒。

如下实施例说明了截短的核心多肽(aa1-148)与突变的聚合酶多肽(命 名为Pol*)的融合，所述突变的聚合酶多肽包含两个内部缺失(从位置538 至544以及从位置710至742)和4个氨基酸取代(分别为D689H、V769Y、 V776Y和D777H)，如SEQ ID NO:6中所示，以及更长的版本还包含两个 免疫原性Env结构域(分别为Env1和Env2，从HBs蛋白的氨基酸14延伸 至51，和从氨基酸165延伸至194)插入到缺失的pol区域的位置中(如SEQ  ID NO:8所示)。

1.1.1.表达截短的Core-Pol*-Env1-Env2(或Core-Pol-Env1-Pol-Env2-Pol)融合的质粒和腺病毒载体的构建和产生

编码截短的Core-Pol*-Env1-Env2融合蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示)的合成基因(3024个核苷酸，如SEQ ID NO:15中所示)由 GENEART(Regensburg,Germany)合成。将该合成的片段插入至pTG13135 穿梭质粒的NheI和NotI限制性酶切位点中,提供了pTG18188。继而通过 在经Bst1107I和PacI消化的pTG18188与经ClaI消化线性化了的pTG15375 之间的同源重组而获得了腺病毒载体。所得的腺病毒载体pTG18201是E3 和E1缺失的,其中E1区域被置换为表达盒，该表达盒含有由CMV启动子 驱动的编码截短的Core-Pol*-Env1-Env2的合成序列。通过将经PacI线性 化的病毒基因组转染至E1补充细胞系而获得腺病毒颗粒(AdTG18201)。

1.1.2.表达截短的Core-Pol*的质粒和腺病毒载体的构建和产生

编码截短的Core-Pol*融合蛋白的合成基因(2820个核苷酸，如SEQ ID  NO:14中所示)由GENEART(Regensburg,Germany)合成。将该合成的片段 插入至pTG13135穿梭质粒的NheI和NotI限制性酶切位点中,提供了 pTG18194。继而通过在经Bst1107I和PacI消化的pTG18194与经ClaI消 化线性化了的pTG15375之间的同源重组而获得了腺病毒载体。所得的腺 病毒载体pTG18202是E3和E1缺失的,其中E1区域被置换为表达盒，该 表达盒含有由CMV启动子驱动的编码截短的Core-Pol*的合成序列。通过 将经PacI线性化的病毒基因组转染至E1补充细胞系而获得腺病毒颗粒 (AdTG18202)。

1.1.3.表达Pol*的质粒和腺病毒载体的构建和产生

编码截短的Pol突变体多肽的合成基因(2379个核苷酸，如SEQ ID NO: 13中所示)由GENEART(Regensburg,Germany)合成。将该合成的片段插入 至pTG13135穿梭质粒的NheI和NotI限制性酶切位点中,提供了TG18195。 继而通过在经Bst1107I和PacI消化的pTG18195与经ClaI消化线性化了的 pTG15375之间的同源重组而获得了腺病毒载体。所得的腺病毒载体 pTG18203是E3和E1缺失的,其中E1区域被置换为表达盒，该表达盒含 有由CMV启动子驱动的编码Pol*的合成序列。通过将经PacI线性化的病 毒基因组转染至E1补充细胞系而获得腺病毒颗粒(AdTG18203)。

1.2.小鼠模型中的免疫原性评估

通过在HLA转基因小鼠的免疫之后的Elispot IFNγ测定和细胞内细胞 因子染色(ICS)而对抗原免疫原性进行了体内评估。

1.2.1.小鼠模型

研究中使用的HLA-A2.1转基因小鼠由Pascolo等描述(1997,J.Exp. Med.185:2043)。这些小鼠的H-2D^b和鼠β₂-微球蛋白基因被敲除，并且表 达转基因单链组织相容性I类分子(HHD分子)，其中人β2m的C-端共价连 接至嵌合重链的N-端(HLA-A*0201α1-α2,H-2D^bα3跨膜和胞质内结构 域)。免疫了7-10周龄的小鼠(雄性和雌性)。小鼠的平均重量约25-30g。

研究中使用的HBV转基因小鼠由Halverscheid等描述(2008,J.Med. Virol.80:583-590)并承蒙Reinhold Schirmbeck惠赠。这些小鼠有C57Bl/6J 遗传背景并且转基因了HBV基因组(1.4拷贝的HBV基因组，在位置1438 有突变(T至C)其避免了HBsAg蛋白的小形式的表达并且抑制了HBV感染 性颗粒的形成)。免疫了10-16周龄的小鼠(雄性和雌性)。小鼠的平均重量 约25-30g。

1.2.2.免疫方案

1.2.2.1DNA免疫方案

进行DNA免疫方案以便评估实施例1.1中所述质粒编码的不同融合 蛋白的免疫原性。用于免疫的DNA在无内毒素的条件下产生。以15天的 间隔用100μg/注射的每种测试质粒免疫小鼠两次，所述注射是经肌内途径 注射至胫骨前肌。在第一次DNA注射前继续拧心脏毒素注射以有利于DNA 免疫原性。在最后一次DNA注射的15天后评估了细胞免疫应答。

1.2.2.2腺病毒免疫方案

进行了腺病毒免疫方案以便比较有Ad载体(如实施例1.1中所述产生) 编码的不同融合蛋白的免疫原性。用编码不同融合蛋白的腺病毒免疫小鼠 一次(10⁸iu/小鼠/注射)，其中所述注射经皮下途径注射至尾根。在最后一次 腺病毒注射的15天后评估了细胞免疫应答。

也用AdTG18201评估了不同剂量的腺病毒。用10⁵、10⁶、10⁷、10⁸或10⁹iu的AdTG18201通过皮下途径于尾根处免疫小鼠一次。

也用AdTG18202测试了不同的免疫日程，以不同的时间间隔对小鼠 注射了一次、两次、三次或六次。每次注射均使用10⁸iu/小鼠经皮下途径 于尾根处进行。对时间间隔1周的一次、三次或六次注射一起进行了比较。 也对如下日程一起进行了比较：检测诱导的T细胞应答之前2周或20周注 射一次、2injections at以2或4个月的间隔注射2次、和以2个月的间隔 注射3次。

1.2.3肽

用于体外细胞刺激的肽是9-10个氨基酸的短肽(被描述或预测为 HLA-A2限制性表位)或15个氨基酸的长肽(包括在涵盖所有感兴趣抗原的 肽文库中)。

对应于所描述或预测为核心蛋白、Pol蛋白或Env结构域的HLA-A2限 制性表位的短肽由Eurogentec(Belgium)合成并以10mM的浓度溶于100% DMSO(sigma,D2650)。

涵盖全长核心、Pol和包膜结构域的肽文库由ProImmune(Oxford, United Kingdom)合成。该核心、Pol和Env文库由15聚体的肽(重叠11个 氨基酸)组成。将每种粗肽以50mM的浓度溶于100%DMSO(sigma, D2650)。对每个文库,将肽汇集成每种肽2mg/ml的浓度:

-HBV核心蛋白被涵盖为21和22个肽的2个汇集(汇集1(PC1):22个 肽涵盖了核心的残基1-100;汇集2(PC2):21个肽涵盖了核心的残基 89-183);

-HBV Pol蛋白被涵盖为24个肽的8个汇集(汇集1(PP1):24个肽涵盖 了aa45-151;汇集2(PP2):24个肽涵盖了aa141-251(从aa205-219的 肽被排除因为在100%DMSO或DMSO+Tris100mM pH9中不可溶; 从aa221-235的肽被溶于DMSO+Tris100mM pH9因为在100% DMSO中不可溶);汇集3(PP3):24个肽涵盖了aa241-347;汇集4 (PP4):24个肽涵盖了aa337-447(从373-387的肽被排除因为在100% DMSO或DMSO+Tris100mM pH9中不可溶);Pool5(PP5):24个肽 涵盖了aa437-543;汇集6(PP6):24个肽涵盖了aa533-639;汇集7 (PP7):24个肽涵盖了aa629-735;汇集8(PP8):24个肽涵盖了aa 725-835);

-Env结构域被涵盖为9个和10个肽的2个汇集(汇集1(PE1):10个肽 涵盖了HBs残基9-59;汇集2(PE2):9个肽涵盖了HBs残基157to 194)。

对于在具有C57BL/6J遗传背景的HBV转基因小鼠中进行的实验,文 献中描述的或此前实验中鉴别的在具有C57BL/6J遗传背景的小鼠中具有 活性的HBV肽被用于体外细胞刺激。它们是短肽(VSAAFYHLPL，聚合酶; SEQ ID NO:24)或长肽(聚合酶的NLNVSIPWTHKVGNF称作N13F(SEQ ID  NO:25)，和包膜蛋白的FLWEWASARFSWLSL称作F13L(SEQ ID NO: 26))。它们由Eurogentec(Belgium)或ProImmune(Oxford,United Kingdom) 合成。每种肽以10mM的浓度被溶于100%DMSO(sigma D2650)。ICS测 定期间以10mM的浓度使用(即便是测试两种肽的混合物的时候)。

1.2.4.IFNg Elispot测定

收集了来自经免疫小鼠的脾细胞，并裂解了红血细胞(Sigma,R7757)。 在Multiscreen平板(Millipore,MSHA S4510)中每孔2.10⁵细胞一式三份培养 40h,所述平板包被有抗-小鼠IFN单克隆抗体(BD Biosciences;10μg/ml, 551216)，培养是在MEM培养基(Gibco,22571)中进行，其中补加了10% FCS(JRH,12003-100M)、80U/mL青霉素/80μg/mL链霉素(PAN, P06-07-100)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco,25030)、1x非必需氨基酸(Gibco, 11140)、10mM Hepes(Gibco,15630)、1mM丙酮酸钠(Gibco,31350)和50 μMβ-巯基乙醇(Gibco,31350)，并且其中存在10单位/ml的重组鼠IL2 (Peprotech,212-12),单独存在则作为阴性对照,或者还有with:

-10μM的存在于HBV抗原中的选择的HLA-A2限制性肽，由SEQ ID  NO:18-23所示的质粒编码(FLP、ILC用于核心,VLQ、FLG和GLS 用于Env以及SLY用于Pol)或者不相关的肽;

-每种肽终浓度5μg/ml的肽的汇集

-5μg/ml的Concanavalin A(Sigma,C5275)作为阳性对照。

通过如前所述(Himoudi等,2002,J.Virol.76:12735)的Elispot(细胞因 子-特异性酶联免疫斑点)测定来对产IFNg的T细胞进行定量。将阴性对照 孔中斑点的数目(对应于产IFNg的T细胞)从含有HBV肽的实验孔所检测 的斑点数目中减去。结果显示为得自一式三份孔的平均值。所观测应答的 阳性的实验阈值(或截断值)是通过计算这样的阈值确定的：其对应于仅有培 养基所观测的斑点的平均值+2个标准偏差,报道为10⁶细胞。与CTL Elispot读取器关联的技术截断值也被定义为50斑点/10⁶细胞(在此值之上则 读取器的CV(差异系数)系统性地低于20%)。The highest value between the  技术截断值和每个实验计算的实验阈值之间的最高值被用于定义每个实验 的截断值。通过使用Mann-Whitney检验来进行Elispot应答的统计学分析。 P值等于或小于0.05则被认为是显著的。

1.2.5.细胞内细胞因子染色(ICS)测定

在来自每个组的每个动物的脾细胞上进行ICS。在用裂解缓冲剂 (Sigma,R7757)裂解红血细胞之后,将平底96-孔平板中的每孔2x10⁶细胞在 完全的MEM培养基(Gibco BRL,22571)中温育，其中存在10单位/ml的 鼠重组IL-2(Peprotech,212-12)，单独存在则作为阴性对照，或还有10μM 的特异性HBV肽或还有每种肽终浓度5μg/ml的肽汇集或还有10μM的不 相关肽。立即以1μl/ml的终浓度加入GolgiPlug(BD Biosciences,555029)5 h。接着,在V-底96-孔平板中收集细胞并用1%FCS-PBS洗涤。使用针对 CD3的单克隆抗体(仓鼠MAb抗-CD3e-PE,稀释1/200)、针对CD8的单克 隆抗体(大鼠MAb抗-CD8a-APC,稀释1/600)和针对CD4的单克隆抗体(大 鼠MAb抗-CD4-PerCP,稀释1/600)来进行染色(所有抗体均来自BD Biosciences,分别为553063、553035和553052)，染色是在50μl的1% FCS-PBS中于室温进行15min。在洗涤后,用Cytofix/Cytoperm将细胞固 定并渗透(permeabilize)以及用Perm/Wash溶液(BD Biosciences,554714)洗 涤。接着,早室温加入抗-小鼠IFNg-PE抗体(BD Biosciences,554412557724) 和抗-小鼠TNFa-Alexa488抗体(BD Biosciences,557719)或抗-小鼠IFNg-PE 抗体(BD Biosciences,554412557724)15min，并在用Perm/Wash洗涤后,将 细胞在1%FCS-PBS中重悬并使用FacsCalibur(Becton Dickinson)通过流式 细胞术来分析。对CD3e+、CD8a+细胞或CD3e+、CD4+细胞进行门控以确 定IFNg+CD8+或IFNg+CD4+T或TNFa+CD8+或TNFa+CD4+T或IFNg+ TNFa+CD8+或IFNg+TNFa+CD4+T细胞群体的百分比。从仅有培养基所 获得的百分比被认为是背景。

对于在HBV转基因小鼠中进行的实验,也在每个组的每只动物的肝 上进行ICS。在处死小鼠后,通过肝门静脉向肝原位灌注冷的PBS直至该 器官变苍白。收集该肝脏,将其置于PBS+FCS2%溶液中,切成小片,轻柔 地过压70μm的细胞滤网并接着悬于冷的PBS+2%FCS溶液中。离心后, 用冷的PBS+2%FCS溶液在此洗涤细胞。新的离心之后,将含细胞的沉淀 重悬于10mL的Percoll溶液,700g室温离心12分钟，并再次用PBS+2% FCS溶液洗涤。继而如前所述的脾细胞那样将红血细胞裂解，所有后续步 骤均按照前文脾细胞的部分所述的那样进行。需要注意,对于肝脏,由于所 收集的T淋巴细胞的量是有限的,每孔的细胞数目是变化的:将所获得的 所有细胞以这样的方式培养：所有孔中分派等量的细胞。

1.2.6体内CTL测定

如Fournillier等(2007,Vaccine,25:7339-53)所述在HLA-A2转基因小 鼠中进行体内CTL测定。脾细胞悬液得自同基因型的小鼠脾脏并在红血细 胞的裂解之后被调节至20x10⁶细胞/mL。将一半细胞与感兴趣的HBV肽 (SLY,FLP或ILC)以10μM的终浓度在37℃温育1h,而另一半细胞则未 处理。接着将5(6)-羧基荧光素双乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)(Molecular  Probes,C1157)加至细胞，其中10μM(CFSE-高)加至未处理的细胞而1μM (CFSE-低)被加至HBV-肽脉冲的细胞10min。在用PBS洗涤后,将所有群 体混合并将20x10⁶的总细胞经眼眶后静脉窦注射至麻醉的小鼠,小鼠之 前曾经由AdTG18201或AdTG15149免疫(2周前)。因而,CFSE-低群体代 表了特异性的靶标(其应当可通过接种而被细胞毒T细胞所裂解),而CFSE- 高群体是内部参照，使得测定能够归一化。来自受体小鼠的脾细胞在24h 后经流式细胞术分析，以检测CFSE-标记的细胞。对每只动物,计算了肽- 脉冲的靶标和未经处理的靶标之间的比例(R=CFSE-低细胞的数目/CFSE- 高细胞的数目)。每只动物的特异性裂解的百分比由下式确定：%lysis=(1-R _小鼠/R_参照)x100其中R_参照是得自2只未经其它处理的HLA-A2小鼠的 R的平均，该两只小鼠也注射了CFSE-标记靶标的相同悬液。如果特异性 裂解的百分比高于10%，则认为应答是阳性的。

1.3通过电子显微镜体外分析AdTG18201

用AdTG18201以不同的MOI(25-100)在悬液中且在降低的培养基体 积条件下感染A549细胞(人类肺腺癌上皮细胞系)，并继而在收集分析前培 养16H、24H或48H。在这些不同的时间点收集细胞并继而用戊二醛(2%稀 释在0.2M二甲胂酸钠缓冲剂中)固定。继而干燥细胞,将其包括在树脂中封 闭并继而切成超薄切片。继而用乙酸铀酰和柠檬酸铅将所获得的栅格(grid) 染色并通过电子显微镜观测。

2.结果

2.1.DNA质粒pTG18188和pTG18194表达的HBV融合蛋白的免疫 原性

在HLA-A2转基因小鼠中评估了由DNA质粒表达的HBV融合蛋白 的免疫原性。在两次肌内注射pTG18188(tCore-Pol*-Env1-Env2)或 pTG18194(tCore-Pol*)或pTG13135作为阴性对照(空质粒)之后,通过 Elispot IFNg和ICS(IFNg/TNFa)来评估特异性T细胞应答，其中使用已知 的HLA-A2表位，所述表位存在于聚合酶、核心或包膜结构域和/或涵盖感 兴趣HBV抗原的重叠肽的汇集。

2.1.1.通过Elispot测定评估HBV特异性产IFNγ细胞

如图2所示,用编码HBV融合蛋白“tCore-Pol*”的质粒pTG18194免 疫诱导了特异于HLA-A2限制性SLY表位(SEQ ID NO:23，位于HBV聚 合酶(位置816-824)内)的产IFNg细胞。用质粒pTG18194免疫还导致了诱 导高频率的产IFNg细胞，所述细胞特异于2个核心HLA-A2限制性表位 FLP(SEQ ID NO:18,位于HBV核心蛋白的位置18-27)和ILC(SEQ ID NO: 19，位于HBV核心蛋白的位置99-108)。在8只经接种小鼠中的4只观测 到阳性应答。

如图2所示,编码HBV融合蛋白“Core-Pol*-Env1-Env2”的质粒 pTG18188也诱导产IFNg细胞，所述细胞特异于pol HLA-A2表位SLY和 两个2核心HLA-A2限制性表位FLP和ILC。在8只经接种小鼠中的4只 观测到阳性应答。另外，也检测到了特异于HLA-A2GLS表位(SEQ ID NO: 22，位于HBsAg的Env2位置185-194)的产IFNg细胞，虽然是低频率且 在一只经接种小鼠中。

2.1.2.通过细胞内染色测定来评估诱导的HBV特异性产IFNg T CD8+和CD4+细胞

2.1.2.1.特异于HLA-A2限制性表位的CD8T细胞应答

通过ICS测定评估了仅产生IFNg或者组合产生IFNg与TNFa(靶向 HLA-A2限制性表位)的CD8T细胞的百分比,所述表位包括在聚合酶 (SLY)、核心(FLP和ILC)和包膜结构域(VLQ、FLG和GLS)之内。结果如 图3A所示为特异于这些表位的CD8+T细胞和产IFNg的CD8+T细胞(单 独产IFNg细胞或同时产IFNg和TNFa的细胞的总和)的百分比。用 pTG18194(表达tCore-Pol*)免疫的8只动物中的4只携有产IFNg的CD8+T 细胞，其特异于分别位于核心和Pol抗原中的FLP、ILC和SLY HLA-A2 限制性表位。类似地,用pTG18188(表达tCore-Pol*-Env1-Env2)免疫的8只 动物中的4只也携有产IFNg的T CD8+T细胞，其特异于FLP、ILC和SLY 表位。另外，如ELISPOT测定中已经观测到的那样,用质粒pTG18188免 疫的8只动物中的4只显示了由产IFNg的CD8+T细胞介导的特异于GLS HLA-A2限制性表位的应答，所述限制性表位Env2结构域内。用pTG13135 免疫并未如预期那样诱导任何特异性的应答。

2.1.2.2特异于涵盖了核心蛋白、聚合酶蛋白和Env结构域的肽的汇集 的CD8和CD4T细胞应答。

特异于涵盖了核心蛋白的肽的汇集的应答

通过ICS测定评估了能够单独产生IFNg或组合产生IFNg和TNFa(应 答于涵盖了核心蛋白(PC)的肽的汇集)的CD8和CD4T细胞的百分比。结果 表示为特异于这些肽的汇集的的CD8+或CD4+T细胞和产生IFNg的CD8+ 或CD4+T细胞(单独产IFNg细胞或同时产IFNg和TNFa的细胞的总和) 的百分比。

如图3B所示,针对涵盖核心蛋白的肽的2个汇集(PC1和PC2),检测 到了产IFNg的CD8+T细胞的阳性百分比，其中CD8+T细胞应答主要集 中于汇集核心1的肽。用pTG18194或pTG18188接种的小鼠中观测到的反 应性CD8+T细胞的百分比与用阴性对照(pTG13135)接种的小鼠中观测到 的百分比有显著差异(p<0.05,Mann Withney检验)，对于两个肽汇集(1和2) 都是如此。

如图3C所示,针对涵盖核心蛋白的肽的1个汇集，也检测到了产IFNg 的CD4+T细胞的阳性百分比，即用pTG18194或pTG18188接种的两组小 鼠中的汇集核心2。用pTG18188接种的小鼠中观测到的反应性CD4+T细 胞的百分比与用阴性对照(pTG13135)接种的小鼠中观测到的百分比有显著 差异(p<0.05,Mann Withney检验)，这是对于汇集核心2而言。

特异于涵盖了聚合酶蛋白的肽的汇集的应答

通过ICS测定评估了能够单独产生IFNg或组合产生IFNg和TNFa(应 答于涵盖了聚合酶蛋白的肽的汇集)的CD8和CD4T细胞的百分比。结果表 示为特异于这些肽的汇集的的CD8+或CD4+T细胞和产生IFNg的CD8+ 或CD4+T细胞(单独产IFNg细胞或同时产IFNg和TNFa的细胞的总和) 的百分比。

如图3D所示,主要针对肽的一个汇集PP8检测到了产IFNg的CD8+T 细胞的阳性百分比。具体到PP8而言,用pTG18194或pTG18188接种的小 鼠中观测到的反应性CD8+T细胞的百分比与用阴性对照(pTG13135)接种 的小鼠中观测到的百分比有显著差异(p<0.05,Mann Withney检验)。需要注 意的是,用pTG18188接种的组中的一只小鼠也显示了针对汇集4、汇集5 和汇集6的产IFNg的CD8+T细胞的阳性百分比。

如图3E所示,针对涵盖Pol蛋白的肽的4个汇集，检测到了产IFNg 的CD4+T细胞的弱的但却是阳性的百分比,也即在用pTG18194或 pTG18188接种的两组小鼠中的汇集Pol1、汇集Pol4、汇集Pol5和汇集 Pol6,每组8只经测试小鼠中的至少3只显示出了应答。

特异于涵盖了包膜结构域的肽的汇集的应答

通过ICS测定评估了能够单独产生IFNg或组合产生IFNg和TNFa(应 答于涵盖了包膜结构域Env1和Env2的肽的汇集)的CD8和CD4T细胞的 百分比。在此实验中未检测到特异性的CD4+T细胞应答。CD8+T细胞应 答的结果示于图3F,表示为特异于这些肽的汇集的的CD8+T细胞和产生 IFNg的CD8+T细胞(单独产IFNg细胞或同时产IFNg和TNFa的细胞的总 和)的百分比。具体而言，在用pTG18188接种的1只小鼠中针对肽的一个 汇集(汇集Env2)检测到了弱的但却是阳性的产IFNg的CD8+T细胞的百分 比。

2.2.腺病毒AdTG18201、AdTG18202和AdTG18203表达的HBV融 合蛋白的免疫原性

2.2.1.通过使用重叠肽的汇集的Elispots IFNg来对HBV特异性产IFNg的T细胞进行评估

在用AdTG18201或AdTG18202或AdTG18203或AdTG15149(空腺 病毒用作阴性对照)免疫的HLA-A2转基因小鼠中评价了由人腺病毒5表达 的HBV Pol突变体和融合蛋白的免疫原性。通过Elispot IFNg评估了在一 次皮下注射腺病毒之后诱导的特异性T细胞应答，其中使用涵盖了HBV感 兴趣抗原核心(PC1-2)、聚合酶(PP1-8)和Env(PE1-2)结构域的重叠肽的汇 集。

如图4中所示,编码HBV突变体聚合酶多肽的AdTG18203自己能够 诱导特异于聚合酶肽汇集4、5、6和8的产IFNg细胞。所有免疫的小鼠显 示出特异性T细胞应答，其中高频率的产IFNg细胞主要针对聚合酶肽汇 集4和8。

如图4所示,编码HBV融合蛋白“tCore-Pol*”的AdTG18202诱导了 特异于肽汇集PP2、PP3、PP4、PP5和PP8的产IFNg细胞,该聚合酶-特 异性应答主要集中于针对PP2、PP3和PP8。用AdTG18202免疫还导致了 诱导高频率的产IFNg细胞，所述细胞特意于2个核心肽汇集PC1和PC2， 其中靶向PC1的T细胞有更高的频率。靶向聚合酶和核心抗原的阳性应答 在5只经免疫小鼠中的5只均有观测到。

编码HBV融合蛋白“Core-Pol*-Env1-Env2”的AdTG18201也被发现 了免疫原性，如图4所示。更具体地,在所有接种的小鼠中都诱导了特异于 聚合酶肽汇集PP2、PP3和PP8的产IFNg细胞,以及针对PP4和PP5也是 如此虽然其斑点较弱且应答小鼠的频率较低。用AdTG18201免疫还导致了 诱导高频率的产IFNg细胞，所述细胞特异于2个核心肽汇集PC1和PC2,这 是在所有免疫的小鼠中(5/5)。用AdTG18201免疫还诱导了针对Env结构域 的特异性T细胞应答,虽然那些应答有些弱且零散，其中5只小鼠中的1 只显示靶向PE1的应答，以及其中5只小鼠中的2只显示靶向PE2的应答。

2.2.2.在用AdTG18201免疫后通过Elispots IFNg使用HLA-A2肽来评估HBV特异性的产IFNg T细胞

在HLA-A2转基因小鼠中评估了由AdTG18201表达的HBV融合蛋白 的免疫原性。通过一次皮下注射AdTG18201或AdTG15149(空腺病毒用作 阴性对照)免疫动物。通过Elispot IFNg评估了特异性T细胞应答，其中使 用包含在聚合酶(SLY)、核心(FLP和ILC)和包膜(VLQ和GLS)的HLA-A2 限制性表位。

如图5所示,编码HBV融合蛋白《Core-Pol*-Env1-Env2》的 AdTG18201被发现有免疫原性。更具体地,在所有AdTG18201-接种的小鼠 中，均诱导了特异于聚合酶HLA-A2表位(SLY)的产IFNg细胞。同时, AdTG18201也诱导了特异于2个核心蛋白的HLA-A2表位(FLP和ILC)的 产IFNg细胞,且具有高频率。用AdTG18201免疫还诱导了针对Env结构 域的特异性T细胞应答,虽然频率和应答小鼠的数目较低,其中8只测试小 鼠中的2只显示出针对VLQ肽的阳性T细胞应答，以及8只测试小鼠中的 5只显示出针对GLSP肽的阳性T细胞应答。

2.2.3.在由AdTG18201并使用选择的肽的汇集免疫HLA-A2小鼠之后通过细胞内染色测定评估HBV特异性产IFNg和/或TNFa的CD8+T细胞

通过ICS测定评估了能够单独产生IFNg或组合产生IFNg和TNFa的 CD8+T细胞的百分比，其中所述细胞是应对于选择肽汇集,所述汇集涵盖 了部分的聚合酶蛋白(PP8,氨基酸725-835)和部分的HBV核心蛋白(PC1,氨 基酸1-100)。结果表示为特异于这些肽汇集和单独产生IFNg及组合产生 IFNg和TNFa的CD8+T细胞的百分比。

如图6所述,AdTG18201能够特异性地诱导高百分比的单独产IFNg 的CD8+T细胞以及组合产IFNg和TNFa的CD8+T细胞(识别PP8和PC1汇 集的肽)。所有接种的小鼠显示出高百分比的单一产生(仅IFNg)和双产生 (IFNg和TNFa)的特异性CD8+T细胞。

需要注意的是,在另一种小鼠模型C57Bl6小鼠中进行的类似的实验, 显示了AdTG18201免疫原性的类似结果(未示出)。

2.2.4.在用AdTG18201免疫HLA-A2小鼠之后用体内CTL测定评估体内功能性CD8+T细胞的诱导

在用AdTG18201或AdTG15149(作为阳性对照)免疫后，通过体内细 胞溶解(或CTL)测定在HLA-A2小鼠中评估了AdTG18201诱导体内功能性 CD8T细胞(显示细胞溶解活性)的能力，并且其中使用3个已知被产IFNg 的CD8+T细胞所靶向HLA-A2的表位(SLY,FL和ILC)。

如图7所示,AdTG18201能够诱导高百分比的针对聚合酶表位(SLY) 的体内特异性裂解,其中在所有经免疫的小鼠中均检测到裂解并且百分比 范围在42%-75%(图7a)。也显示出AdTG18201能够诱导高百分比的针对 核心蛋白两个测试的HLA-A2表位FLP(图7a)和ILC(图7b)的体内特异性 裂解,其中百分比范围分别在32%-69%和3%-64%。针对env表位的应答可 以检测到但却是低水平。

这些数据清楚地证明了AdTG18201诱导体内功能性CD8+T细胞(其 显示细胞溶解活性并靶向HBV聚合酶和HBV核心蛋白)的能力。

2.2.5.在用AdTG18201免疫后并使用ICS测定来评估功能性CD8+T细胞在HBV转基因小鼠中的诱导

在HBV转基因小鼠中评估了AdTG18201在耐受小鼠模型中诱导功能 性T细胞的能力。实际上,这些小鼠对于HBV基因组是转基因的,并因此 对HBV抗原耐受，在一定程度上模拟了HBV慢性患者中遇到的耐受。通 过一次皮下注射AdTG18201(10⁸iu)或AdTG15149(作为阴性对照)免疫 HBV转基因小鼠。在接种小鼠的脾和肝中均通过ICS监测诱导的T细胞(检 测产IFNg和TNFa的CD8+T细胞)。在此特定模型中,经鉴别在C57Bl/6J 小鼠中具有反应性的肽被用于筛选诱导的T细胞应答:对于聚合酶是VSA 和N13F肽的汇集而对于包膜则是F13L肽。

如图8所述,在AdTG18201接种的小鼠的脾和肝中检测到了产IFNg 和TNFa的功能性CD8+T细胞，其中在两个器官中，5只测试小鼠中的4 只显示特异于聚合酶的功能性产IFNg/TNFa的CD8+T细胞，以及5只测 试小鼠中的2只显示特异于包膜的功能性产IFNg/TNFa的CD8+T细胞。 如预期的那样,在用空AdTG15149免疫的小鼠中或者当使用不相关肽刺激 是，没有检测到应答。

综上,这些数据证明了表达融合蛋白(其含有RNaseH缺陷和YMDD- 缺失的pol突变体、env结构域和核心)的病毒载体AdTG18201在HBV耐 受模型中诱导功能性产IFNg和TNFa的CD8+T细胞的能力。

2.3对用AdTG18201或AdTG18202进行不同剂量和日程的免疫进行 评估。

2.3.1.腺病毒剂量评估

在HLA-A2转基因小鼠以不同的剂量评价了AdTG18201所表达的 HBV融合蛋白的免疫原性。通过一次皮下注射AdTG18201(以10⁵iu或10⁶iu 或10⁷iu或10⁸iu或10⁹iu的剂量)或AdTG15149(以10⁹iu的剂量，空腺病毒 用作阴性对照)来免疫动物。were evaluated by通过Elispot IFNg使用 HLA-A2限制性表位(包含在聚合酶(SLY)、核心(FLP和ILC)和编码(VLQ 和GLS)中)来评估特异性T细胞应答。

如图9所示,编码HBV融合蛋白《Core-Pol*-Env1-Env2》的 AdTG18201在以10⁷iu、10⁸iu和10⁹iu的剂量注射时被发现具有免疫原性。 更具体地,使用10⁵和10⁶iu的剂量，未检测到特异于所测试的核心、聚合 酶或Env结构域的HLA-A2表位的产IFNg细胞。对于剂量10⁷、10⁸和10⁹iu，则检测到了特异性的产IFNg细胞，其靶向于2个所测试的核心表位以 及所测试的Pol表位。对3个表位(SLY、FLP和ILC)观测到了剂量效应。 对于Env结构域的2个表位(VLQ和GLS),产IFNg细胞的频率在剂量10⁷和10⁸低而该频率在10⁹iu的剂量明显提高。

2.3.2.评估短时间间隔的多次免疫日程

在HLA-A2转基因小鼠中根据不同的免疫日程评价由AdTG18202表 达的HBV融合蛋白的免疫原性。将AdTG18202施用一次或三次(三周期 间1注射/周)或六次(六周期间1注射/周)，并在最后一次注射2周之后通过 Elispots IFNg测定评价所诱导的免疫T细胞应答，并且其中使用HLA-A2 限制性表位,SLY(Pol)以及FLP和ILC(核心)。一些小鼠用空腺病毒免疫六 次作为阴性对照(未显示)。

如图10所示,无论使用何种测试日程，编码融合蛋白”Core-Pol*”的 AdTG18202均被发现有免疫原性。更具体地,仅使用培养基和不相关蛋白 则未检测到特异性T细胞应答，而在存在3种测试的HBV表位SLY、FLP 和ILC时，则检测到高且类似频率的产IFNg细胞。所检测到的产IFNg T 细胞的频率在以1周的间隔注射一次、三次或六次的组之间表现相当,而在 IFNg产生水平方面并未表现出T细胞耗竭，这是因为在短的时间间隔中 进行了很高数目的免疫免疫。当小鼠被注射六次时其腺病毒特异性T细胞 应答表现地高于注射一次或三次的时候。如所预期的那样,在用空腺病毒免 疫后未检测到HBV-特异性T细胞应答。

2.3.3.评估长时间间隔的多次免疫日程

在HLA-A2转基因小鼠中根据不同的免疫日程评价由AdTG18202表 达的HBV融合蛋白的免疫原性。

将AdTG18202施用一次(在监测T细胞应答之前2周(组1)或20周(组 2))或两次(以2个月(组3)或4个月(组4)的间隔注射两次,最后一次注射的 2周后监测T细胞应答)或三次(以2个月的间隔(组5),最后一次注射的2 周后监测T细胞应答)。通过Elispots IFNg测定并使用HLA-A2限制性表 位SLY(Pol)以及FLP和ILC(核心)来监测所诱导的T细胞应答。一些小鼠 用空腺病毒免疫一次或以2个月的间隔免疫3次作为阴性对照(未显示)。

如图11所示,无论使用何种测试日程，编码融合蛋白”Core-Pol*”的 AdTG18202均被发现有免疫原性，而在以AdTG18202免疫后在仅存在培 养基或使用不相关肽时则未检测到特异性T细胞应答。更具体地,组2中 所观测到的特异性T细胞应答显示，尽管其低于组1中一次免疫之后2周 所观测到的,但是一次注射AdTG18202之后的T细胞应答在注射20周之 后仍存在。在组3和4中所观测到的T细胞应答显示，第一次免疫之后2 或4个月进行的第二次免疫能够唤起特异于HBV表位的T细胞应答，且水 平至少达到组1中观测到的初次免疫应答,对于SLY表位而言甚至稍微更 高。在以2个月的间隔免疫了三次的小鼠(组5)中观测到了类似的结果，通 过第二次和第三次注射将所诱导的T细胞应答唤起至类似于组1中所观测 的水平。A如所预期的那样,在用空腺病毒免疫后未检测到HBV-特异性T 细胞应答。

2.4电子显微镜观察

用AdTG18201在MOI25、50或100体外感染A54细胞，并在感染后 16h、24h或48h收集细胞。继而处理所收集的细胞以通过电子显微镜观察。

在AdTG18201感染的细胞的核和细胞质中观察到一些病毒样颗粒 (VLP)，而在空腺病毒感染的细胞中没有观察到这些结构。这些VLP主要 位于核内。在一些细胞中观察到了蛋白团聚体(aggregate)和VLP。