一种用于评估硫丹生物毒性的方法

摘要

一种用于评估硫丹生物毒性的方法，该方法包括检测生物样品中生物标志物表达的步骤，所述生物标志物为IL-6和/或IL-8。本发明的方法简便，相关性较高，可以快速评估生物体是否被硫丹暴露并导致了细胞毒性。本发明从炎症角度探讨了硫丹的毒性与炎性因子IL-6和IL-8的表达变化有关，提示了IL-6和IL-8可以作为评价硫丹细胞毒性的生物指标，反映硫丹暴露的浓度与效应之间的关系，对判定硫丹的生物毒性尤其是炎性损伤对生物个体的影响具有重要的意义，有利于揭示环境持久性有机污染物炎性损伤的分子机制。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于环境污染物生物毒性的方法，尤 其是涉及一种评估硫丹炎性损伤的方法。

背景技术

随着科学技术的进步、工业化水平的提高、人类活动区域的拓展，各类化 学制剂正不断地进入人们的生活，其中持久性有机环境污染物(POPs)对环境 的危害和人体健康的影响已经不容忽视，包括二嗯英(PCDD/Fs)、多环芳烃 (PAHs)、多氯联苯(PCBs)、有机氯农药硫丹(endosulfan)等。

现有的化学分析方法虽然能对环境或生物体内污染物含量进行定量描述， 但仅凭含量无法反映污染物对生物体的效应，这就需要从分子水平研究在环境 污染物作用下生物体内各种指标的变化。目前，利用生物标志物(biomarker)作为 环境污染物毒性评价方法的研究受到国际上日益广泛的重视，也是当前的研究 热点一。

所谓生物标志物是通过生物介质(如人体组织、细胞或体液)能够表征对 某种污染物的暴露和或其效应的生化、细胞、生理、行为或能量等任何可测的 改变。利用生物标志物可以衡量环境污染物的暴露及效应的生物学反应，可以 作为联系污染物与生物效应之间的纽带，反映污染物暴露的时空变化，揭示污 染物浓度与效应，判定污染物引起的效应对生物个体的意义。

在环境毒理学研究中，常用效应生物标志物来指示污染物的毒性效应和解 释分子反应机制，如指示DNA损伤的DNA加合物、细胞色素P450、苯并芘单氧 酶、乳酸脱氢酶等，可用于检测环境持久性有机污染物如PCDD/Fs、PAHs、PCBs 和硫丹等的毒性评价。

生物标志物的测定方法包括：1)³²P-后标记法，需要进行DNA的提取、酶 解、使用放射性³²P元素标记和层析等，DNA需要量少，灵敏度较高，但测定步 骤复杂；2)免疫学法，如酶联免疫吸附法(ELISA)和超敏感酶放射免疫法 (USERIA)，灵敏度更高，但制备抗体困难并且抗体与加合物容易发生交叉反应 引起假阳性。3)色谱或质谱法，灵敏度最高，但需要特殊仪器，样品处理复杂； 4)荧光法，利用一些污染物可以诱导生物体内某种酶活性的改变，该酶可能会 促使其特异性反应发生而产生荧光性物质，通过测定其荧光强度就可以定量检 测这些污染物质的种类和浓度(表1)。

表1.生物标志物用于多环芳烃、多氯联苯、有机氯、二噁英类化合物 含量测定及毒性评价

AchE：乙酰胆碱酯酶；CbE：羧酸酯酶；UV-Vis：紫外-可见分光光度法； ELISA：酶联免疫吸附法；RIA：放射免疫学方法；EROD：7-乙氧基-3-异吩噁 酮-脱乙基酶生物测试法。

环境污染物暴露与人类多种疾病的发生密切相关，例如心脑血管疾病和癌 症。血管内皮细胞具有多种生理功能，可产生和分泌多种生物活性物质，参与 机体的正常调节，在维持血管的稳定性方面起重要的作用，一旦内皮细胞功能 失调，将有可能引起心脑血管疾病并与癌症的发生有关。当环境污染物暴露造 成周围环境改变时内皮细胞功能紊乱就会发生炎症反应，许多炎性因子和粘附 分子表达异常，例如白细胞介素(IL-6,IL-8)，血管细胞粘附分子(VCAM-1)， 和血管内皮生长因子(VEGF)等，见表2。其中炎性因子IL-6和IL-8的功能广泛， IL-6可以调节多种细胞功能包括细胞增殖、细胞分化、免疫防御机制等，并可以 调节IL-8；而IL-8可以诱导细胞的迁移，介导肿瘤组织的血管增生而促进肿瘤的 发生。

硫丹作为一种持久性有机污染物，具有高生物毒性，可以引起细胞毒性， 它对血管内皮细胞影响如何，是否会引起内皮细胞功能失调，与哪种炎性因子 的调控有关，至今仍未阐明。

表2.环境污染物引起炎性因子的变化及相关功能分析

本研究主要针对持久性有机污染物硫丹，它是一种有机氯农药，作为杀虫 剂广泛用于农业生产中，具有高生物毒性、潜在的致癌性和环境雌激素效应等 特点，它对环境的污染和对生物的毒性作用近几年来引起了广泛的关注。针对 硫丹农药残留的问题，可以利用液相色谱、薄层色谱和气质联用一系列分析方 法得以实现，而目前已经可以基于ELISA方法利用硫丹检测试剂盒对样品中的硫 丹含量进行检测。但是，这些都是对硫丹的含量进行定量描述，仅凭含量是无 法反映硫丹对生物体的效应的。

一直以来，乳酸脱氢酶LDH作为一种易感性效应标志物被用来检测硫丹的 细胞毒性，原理是LDH的释放可以看作是细胞膜完整性的重要指标，当硫丹暴 露致细胞凋亡或坏死造成细胞膜结构的破坏，就会引起LDH的释放，然而这种 方法存在很多问题。首先，LDH酶本身对温度敏感，容易失活不稳定；其次， LDH的释放受细胞生长程度和密度、离心速度及培养箱内外温度差等影响，易 造成假阳性；还有当硫丹的浓度过低不足以破坏细胞膜时，将无法检测到LDH 的释放；此外采用比色法检测LDH存在背景高问题，LDH的释放仅仅是细胞膜 受到破坏的指标，并不能从分子水平解释硫丹暴露引起细胞毒性的基因调控机 制。

发明内容

鉴于上述作为持久性有机污染物硫丹的生物毒性检测的现有技术的不足， 本发明提供一种用于评估环境污染物硫丹生物毒性的方法，尤其是提供检测硫 丹生物毒性的生物标志物。

持久性有机污染物硫丹，它是一种有机氯农药，作为杀虫剂广泛用于农业 生产中，具有高生物毒性。发明人在研究中发现，硫丹暴露的人脐静脉内皮细 胞IL-6的分泌增加，IL-6和IL-8的mRNA表达升高，这种升高与硫丹暴露浓度呈 剂量依赖性特点，考虑这种变化与硫丹暴露引起人脐静脉内皮细胞的细胞毒性 效应相关，检测在生物样品中的IL-6和IL-8的表达可以作为评估生物体被硫丹暴 露后是否产生生物毒性的方法来应用。

本发明的技术方案如下：

一种用于评估硫丹生物毒性的方法，包括检测生物样品中生物标志物表达 的步骤，所述生物标志物为IL-6和/或IL-8。

进一步，所述生物标志物为所述生物标志物为IL-6蛋白、IL-6mRNA、IL-8 mRNA中的一种或两种以上。

进一步，所述检测基于IL-6和/或IL-8的过表达。

进一步，所述IL-6和/或IL-8的过表达为IL-6蛋白、IL-6mRNA、IL-8mRNA 中的一种的过表达或两种以上的过表达。在具体实施方式中，在生物样品中IL-6 蛋白的细胞外分泌量、IL-6mRNA表达量、IL-8mRNA表达量中的一种高于正 常对照生物样品的2倍以上，或两种以上均高于正常对照生物样品的2倍以上 时，可以认为对象的生物体被硫丹暴露，并该暴露引起了生物体内的生物毒性， 该生物毒性优选为炎性损伤所致的生物毒性。

进一步，本发明所述生物样品为培养的细胞、细胞裂解产物，组织、组织 裂解产物、全血、血浆、血清，优选血管内皮细胞。血管内皮细胞形成血管的 内壁，是血液和血管壁之间天然的生理屏障，可以直接地接受血液中各种物质 的刺激而发生反应，而许多环境污染物对机体的损伤是从外周血管开始的，特 别是血管内皮细胞的损伤,所以血管内皮细胞可以作为本发明优选的生物样品。

本发明还提供所述的生物标志物IL-6和/或IL-8在评估硫丹生物毒性中的应 用。

硫丹是一种持久性有机污染物，已有研究发现许多污染物对机体的毒性损 伤机制都与炎症的发生密不可分，因此炎症因子的参与十分重要，但是究竟哪 种炎症因子发挥作用还不甚清楚。本发明以硫丹为研究对象，发现硫丹暴露可 以引起细胞生长抑制、周期阻滞，并引起炎症反应，通过筛选了包括IL-6，IL-8 在内的几种细胞因子，确定了硫丹与IL-6分泌水平的时间效应和剂量效应关系密 切，即IL-6的分泌水平随硫丹暴露浓度的增加而增加，同时，IL-6和IL-8的mRNA 水平在硫丹暴露48h时明显升高，高于正常对照组2倍以上，呈剂量依赖性关系， 这些证明IL-6和IL-8可以作为硫丹生物毒性的生物标志物，尤其是硫丹对生物体 的炎性损伤的生物标志物。目前还没有相关报道。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种用于评估环境污染物硫丹生物毒性的方法，提供检测硫 丹生物毒性的生物标志物IL-6和IL-8。本发明的方法简便，相关性较高，可以快 速评估生物体是否被硫丹暴露并导致了细胞毒性。

本发明从炎症角度探讨了硫丹的毒性与炎性因子IL-6和IL-8的表达变化有 关，提示了IL-6和IL-8可以作为评价硫丹生物毒性的指标，反映硫丹暴露的浓度 与效应之间的关系，对判定硫丹的生物毒性尤其是炎性损伤对生物个体的影响 具有重要的意义，有利于揭示环境持久性有机污染物炎性损伤的分子机制。

附图说明

图1为硫丹对HUVEC-C的细胞增殖的影响；

图2为硫丹对HUVEC-C细胞周期的影响；

图3为硫丹暴露引起细胞对IL-6分泌水平的变化；

图4为硫丹暴露引起IL-6mRNA和IL-8mRNA表达水平的变化。

具体实施方式

以下的实施例便于更好的理解本发明，但并不限定本发明。另外，下述实 施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等 均可从生物或化学试剂公司购买。

实施例1硫丹对HUVEC-C的细胞增殖的影响

对HUVEC-C(人脐静脉内皮细胞)细胞进行硫丹暴露处理，实验分为3大 组：正常细胞组(C)，DMSO对照组(二甲基亚砜,D)，硫丹实验组(endosulfan, ES)。对照组DMSO1％浓度，硫丹暴露浓度为(20,40,60μM)，暴露时间为48 小时，收集细胞进行细胞计数，如图1结果显示硫丹暴露引起细胞增殖抑制， 呈剂量依赖性关系，在低浓度20μM时相对于对照组显著抑制细胞生长 (P*<0.05)，在较高浓度(40-60μM)极显著引起细胞增殖抑制(P**<0.01)。

实施例2硫丹对HUVEC-C细胞周期的影响

对HUVEC-C细胞进行硫丹暴露处理48小时，分别收集正常细胞组，DMSO 组，硫丹实验组(20,40,60μM)三组的细胞，用70％冷乙醇固定过夜后，进行PI 染色和RNase处理，利用流式细胞仪(BD FACSCalibur)进行细胞周期测定，如 图2的结果显示硫丹在高浓度60μM时相对于对照组，出现G1/S期阻滞，具有显 著性意义(P**<0.01)。

实施例3硫丹暴露引起细胞对IL-6分泌水平的变化

HUVEC-C细胞具有自分泌IL-6的特点，首先，在剂量效应上，对HUVEC-C 细胞进行硫丹暴露处理12小时，分别收集正常细胞组，DMSO组，硫丹实验组(20, 40,60μM)三组的细胞培养上清液，采用IL-6human ELISA Kit试剂盒(Abcam) 测定细胞分泌IL-6的水平。图3A为利用ELISA方法进行IL-6测定的标准曲线，图 3B为不同浓度硫丹对IL-6分泌水平的影响。图3A、3B的结果显示硫丹暴露可以 引起IL-6表达升高，呈剂量依赖性关系，具有统计学意义。其次，在时间效应上， 对HUVEC-C细胞进行不同暴露时间处理(4,6,8,12,24,48h)，分别收集DMSO 组和硫丹实验组(40μM)细胞培养上清液，采用IL-6human ELISA Kit试剂盒 (Abcam)测定细胞分泌IL-6的水平。图3C的结果显示硫丹暴露4h即可以引起 IL-6表达升高，6-12h升高超过2倍水平，具有统计学意义。

实施例4硫丹暴露引起IL-6和IL-8mRNA表达水平的变化

对HUVEC-C细胞进行硫丹暴露处理48小时，分别收集正常细胞组，DMSO 组，硫丹实验组(20,40,60μM)三组的细胞，用miRNeasy Mini Kit(Qiagen)提取 总RNA，测定RNA浓度并进行RNA质检。采用SYBR green(Applied Biosystems, ABI)方法进行qRT-PCR反应，设计引物(IL-6，IL-8和GAPDH，见表3)，以GAPDH 作为内参，使用2-ΔΔCt方法将mRNA表达差异通过处理样本相对于未处理样本的 倍数来表示。

表3.引物序列及相关信息

结果如图4所示，硫丹暴露可以引起IL-6和IL-8的mRNA表达升高，呈剂量 依赖性关系，具有统计学意义(P**<0.01vs D)，提示硫丹可以诱导IL-6和IL-8 的转录水平升高。

实施例1-4的结果显示，硫丹能够引起HUVEC-C的细胞毒性，表现为细胞 增殖抑制、细胞周期阻滞，并可以引起HUVEC-C细胞分泌IL-6水平升高，诱 导IL-6和IL-8的转录水平升高，有明显的剂量依赖性关系，提示炎性因子IL-6 和IL-8参与了硫丹的炎性损伤，这对于硫丹的生物毒性损伤提供了重要的参考。

本发明证明了硫丹暴露与生物标志物IL-6和IL-8细胞外的分泌水平和细胞内 的转录水平具有密切的关系，IL-6细胞外的分泌水平和IL-8在细胞内的转录水平 随着硫丹暴露浓度的增加而增加，有明显的剂量依赖性关系。在20-60μM的硫丹 暴露下，相对于对照组HUVEC-C的IL-6分泌量增加2～4倍(图3B)，IL-6mRNA 表达量增加2～8倍，IL-8mRNA表达量增加2～13倍，具有显著性差异。在临床应 用中，在所采用的生物样品中IL-6和/或IL-8的表达量(可以为分泌的相应蛋白， 也可以为mRNA)升高2倍以上，可以认为硫丹对生物体产生细胞毒性，进一步 可以认为硫丹对生物体产生炎性细胞损伤。所述生物样品优选为生物体中分离培 养的HUVEC-C，外周血血清。

在下述几种情况下，可以评估生物体曾被硫丹暴露并引起了生物毒性：

①生物样品中IL-6分泌量和IL-6mRNA表达量，或IL-6mRNA表达量相比 于对照组提高了2倍以上。

②生物样品中IL-6mRNA和/或IL-8mRNA表达量相比于对照组提高了2倍 以上。

③IL-6分泌量、IL-6mRNA表达量和IL-8mRNA表达量相比于对照组均提高 了2倍以上。

上述①～③中所述的对照组是指未暴露的正常细胞或血清等生物样本。

另一方面，在临床上采用本发明的方法评估生物体是否暴露于硫丹并导致生 物毒性(主要为炎性细胞损伤)，可以结合病史做出诊断。因此，首先，通过是 否有硫丹接触史来判断是否有硫丹的暴露情况，其次，通过生物体内是否可以检 测到硫丹的水平来进行综合判断，目前硫丹检测试剂盒已经在商业化应用，通过 气相色谱-质谱联用(GC-MS)也可以进行硫丹浓度检测，这些对帮助评估硫丹 暴露的毒性损伤将十分有利。

本发明中，硫丹对细胞毒性的影响，在其暴露浓度20-60μM下进行检测，这 一浓度范围在于世界卫生组织规定的最低急性毒性浓度之上，考虑会在人体内引 起生物毒性，而且又明显低于最低致死量的范围。具体为：

世界卫生组织规定，硫丹对人的日允许摄入量为0.006mg/kg，急性参考剂量 为0.02mg/kg，成人口服最低致死量为50mg/kg～500mg/kg。

硫丹的分子量是406.9，即1M＝406.9g/l，20μM＝8.138μg/ml.

如果利用体外试验药物浓度公式(参考文献)进行推算：

药物浓度μg/ml＝(50×D)÷5000÷50％×10³

D用药剂量mg·kg^-1/day，按每毫升含细胞培养液加50μl体外试验药物浓度 计算，20μM的硫丹D值为0.4mg·kg^-1/day；40μM的硫丹D值为0.8mg·kg^-1/day； 60μM的硫丹D值为1.2mg·kg^-1/day。这就提示硫丹浓度20-60μM在最低急性毒性 浓度之上，考虑会在人体内引起生物毒性，而且又明显低于最低致死量的范围。