LOC401296基因及其在调控细胞周期和细胞生长中的应用

摘要

本发明公开LOC401296基因及其在调控细胞周期和细胞生长中的应用，属于基因工程技术领域。本发明发现假想基因LOC401296基因在多种细胞系广泛表达。下调该基因表达后细胞生长受到明显抑制、凋亡增加、出现了明显的G2/M期阻滞，进一步研究证明LOC401296基因参与细胞有丝分裂进程和纺锤体的形成，是一种新的细胞周期调控分子。本发明成果为后续功能研究提供奠定了基础。

说明书

技术领域

本发明涉及一种LOC401296基因及相应的蛋白在调节细胞周期、控制细胞生长等方面的 应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

细胞周期是进行连续分裂的细胞完成一次分裂开始至下一次分裂完成时为止的一段时 期，被认为是细胞完整的生命过程，是维持细胞生长、增殖的基本生物学事件。细胞周期是 一个连续变化过程，根据研究的需要被人为划分为间期和分裂期，间期包括G1期、S期、 G2期，分裂期指M期，另外，停止分裂的细胞被视为处于周期静止的G0期。其中，M期 指染色体开始凝集浓缩、核膜崩解、遗传物质重新分配、一个母细胞分裂形成两个子细胞的 一段时间，是细胞的“分娩”阶段。细胞周期过程，尤其是有丝分裂期在细胞生长、凋亡发生、 肿瘤生长等生物学过程发挥重要作用，这些生物学过程受到多种基因的调控。

LOC401296是大规模基因组测序中发现的一个假想基因，该基因编码全长194个氨基酸 的假想蛋白，目前对该基因未有任何功能报道。我们研究发现，LOC401296基因在多种细胞 系中广泛表达，采用siRNA方法下调LOC401296表达可以促使细胞发生G2/M期阻滞，引 起细胞发生有丝分裂异常，诱导细胞凋亡。进一步分析发现，下调LOC401296基因表达可以 引起纺锤体形成异常，抑制HeLa、A549、MCF-7等多种细胞生长。

发明内容

本发明提供一种调控细胞周期的基因：LOC401296基因。LOC401296基因或其对应 mRNA或其编码的蛋白可用于调控细胞增殖和凋亡的速度、调节细胞周期、制备抗癌药物、 筛选鉴定抗癌药物。

本发明中的LOC401296基因对应的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。所述LOC401296 基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明中的“抑制剂”可以是蛋白、RNA或小分子化合物等。优选地，抑制剂是一种蛋 白，更优选地，抑制剂是一种抗体，该抗体能够结合LOC401296基因编码蛋白质，从而抑制 LOC401296基因和/或它对应的mRNA和/或它对应的蛋白质。优选地，抑制剂是一种RNA， 可以是干扰性RNA分子，所述干扰性RNA分子可以是双链RNA，例如 siRNA(short interfering RNA)、miRNA(microinterfering RNA)等，或者单链RNA，例如 shRNA(short hairpinRNA)，它们能通过RNA干扰作用引起LOC401296靶基因mRNA的降解 (例如siRNA或miRNA的情形)或者能够形成具有这种功能的分子(例如shRNA的情形)。更 优选地，抑制剂是一种siRNA，所述siRNA的两条链的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ  ID NO.3所示，或如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。

本发明中的癌症为包括但不限于卵巢癌、胰腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、 肺腺癌、肝癌、黑素瘤、视网膜母细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、白血病、淋巴瘤、脑瘤、子宫 颈癌、肉瘤、前列腺瘤、膀胱瘤、网状内皮组织瘤、Wilm氏瘤、星细胞瘤、成胶质细胞瘤、 成神经细胞瘤、骨肉瘤、肾癌、或头颈癌。优选地，所述癌症是子宫颈癌、乳腺癌、肺癌。

本发明提供了一种调控细胞周期的方法，是通过调控LOC401296基因的表达或其对应 mRNA的表达或其编码的蛋白的表达量和活性。

本发明还提供一种调控细胞增殖的方法，是通过调控LOC401296基因的表达或调控 LOC401296基因对应mRNA的表达或调控LOC401296编码的蛋白的表达量和活性，从而调 控细胞增殖。进一步，本发明提供了一种抑制细胞增殖的方法，其特征在于，是通过抑制剂 抑制LOC401296基因的表达或其对应mRNA的表达或其编码的蛋白的表达量和活性，从而 抑制细胞增殖。

本发明还提供一种抑制细胞凋亡的方法，是通过表达或上调LOC401296基因或其对应 mRNA或其编码的蛋白活性，从而抑制细胞凋亡。

本发明还提供了一种诱导细胞凋亡的方法，是通过抑制剂抑制LOC401296基因的表达或 抑制LOC401296基因对应mRNA的表达或抑制LOC401296编码的蛋白的表达量和活性。

本发明还提供了一种鉴定、筛选抗癌药物的方法，是利用LOC401296基因或其对应 mRNA或其编码的蛋白筛选能够抑制LOC401296基因或其对应mRNA或其编码的蛋白活性 的物质。优选地，将将待测试剂与细胞接触，进一步检测LOC401296基因或其对应mRNA 或其编码的蛋白，与对照细胞相比，LOC401296基因表达水平降低或其编码的蛋白活性降低 时，指示待测试剂为抗癌或抗肿瘤药物。

本发明还提供了一种制备抗癌药物的方法，是采用抑制剂来制备抗癌或抗肿瘤药物，该 抑制剂抑制LOC401296基因或其对应mRNA或其编码的蛋白。

本发明还提供了一种LOC401296基因和/或它对应的mRNA序列和/或它对应的蛋白质序 列在抑制细胞凋亡中的应用，优选地，通过上调LOC401296基因或其对应mRNA或其编码 的蛋白活性，从而抑制细胞凋亡。

本发明还提供了一种LOC401296基因和/或它对应的mRNA序列和/或它对应的蛋白质序 列在鉴定和/或筛选抗癌药物中的应用，是利用LOC401296基因或其对应mRNA或其编码的 蛋白筛选能够抑制LOC401296基因或其对应mRNA或其编码的蛋白活性的物质。优选地， 将将待测试剂与细胞接触，进一步检测LOC401296基因或其对应mRNA或其编码的蛋白， 与对照细胞相比，LOC401296基因表达水平降低或其编码的蛋白活性降低时，指示待测试剂 为抗癌或抗肿瘤药物。

本发明还提供了一种LOC401296基因和/或它对应的mRNA序列和/或它对应的蛋白质序 列在调节细胞周期中的应用，是通过调控LOC401296基因的表达或其对应mRNA的表达或 其编码的蛋白的表达量和活性。

本发明还提供了一种抑制剂在促进细胞凋亡中的应用，所述的抑制剂抑制LOC401296基 因的表达或其对应mRNA的表达或其编码的蛋白的表达量和活性。

本发明还提供了一种抑制剂在抑制细胞增殖中的应用，所述的抑制剂抑制LOC401296基 因的表达或其对应mRNA的表达或其编码的蛋白的表达量和活性。

本发明还提供了一种抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的抑制剂抑制LOC401296 基因的表达或其对应mRNA的表达或其编码的蛋白的表达量和活性。

本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物可以用于治疗癌症或肿瘤，该药物组合 物可以用于促进细胞凋亡，抑制细胞增殖，所述的药物组合物包含一种抑制剂，该抑制剂抑 制LOC401296基因或其对应mRNA或其编码的蛋白。该药物组合物还可以进一步包含其他 物质，优选地，可以包含药学上可接受的载体、赋形剂，可以包含其他抗肿瘤药物、具有肿 瘤靶向功能的配体等。

本发明又提供了一种预防、治疗或缓解LOC401296基因相关疾病或病症、例如肿瘤的方 法，其包括对有此需要的个体施用一种抑制剂，该抑制剂抑制LOC401296基因或其对应 mRNA或其编码的蛋白。优选地，向有此需要的个体施用本发明的一种或多种干扰性RNA、 药物组合物。

本发明对功能未知基因LOC401296进行研究。经研究发现LOC401296基因在多种细胞 系(HEK293、U937、Hela、Lo2、HepG2、K562、NB4、Molt4、A549、MCF7等细胞)广 泛表达。抑制LOC401296基因表达可引起HeLa、A549、MCF-7肿瘤细胞生长抑制，这意味 着能够抑制LOC401296基因表达的物质均有可能具有抑制肿瘤细胞生长的作用，LOC401296 基因可作为筛选抗肿瘤药物的靶点分子。下调该基因表达后细胞生长受到明显抑制、凋亡增 加、出现了明显的G2/M期阻滞，进一步研究证明LOC401296基因细胞有丝分裂进程和纺锤 体形成过程，是一种新的细胞周期调控分子。本发明成果为后续功能研究提供奠定了基础。

附图说明

图1为LOC401296mRNA在不同细胞系中的表达情况。

图2为靶向LOC401296的siRNA对LOC401296mRNA和蛋白表达的抑制作用。

图3为下调LOC401296对HEK293细胞形态影响。

图4为回转LOC401296表达挽救细胞形态改变。

图5为下调LOC401296表达对多种细胞生长的影响。(siRNA-NC代表转染siRNA-NC 对照组；siRNA-LOC401296代表转染siRNA-2#的LOC401296表达下调组)。

图6为下调LOC401296表达对细胞凋亡的影响。(A:siRNA-2#转染HEK293细胞后2天、 3天，检测细胞凋亡及统计分析；B:siRNA-2#转染Hela细胞后2天、3天，检测细胞凋亡及 统计分析)。

图7为下调LOC401296对HEK293和HeLa细胞周期分布影响。

图8为下调LOC401296对HeLa细胞有丝分裂阻滞的影响。

图9为回转LOC401296表达挽救HeLa细胞有丝分裂阻滞。

图10为下调LOC401296对HeLa细胞有丝分裂进程的影响。

图11为下调LOC401296对HeLa细胞纺锤体形成的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。如果无特殊说明， 本发明所用仪器、试剂和材料均可通过常规途径或手段获取。

实施例1LOC401296基因的获得

提取人外周血总RNA，采用逆转录试剂盒获取外周血cDNA。根据NCBI提供的 LOC401296基因(GenBank:BC132760.1)对应的cDNA全长序列设计引物(上游引物5 ‘atggactggggaggagg3’和下游引物5‘tcagaaagtgcccgattccaag3’)。采用此引物对，以外周血 cDNA为模板进行PCR扩增。将PCR产物连接到T载体，经测序后与NCBI提供的序列进行 比对，结果表明我们获取LOC401296基因的全长cDNA序列。

实施例2LOC401296基因在多种细胞中表达

采用常规方法培养HEK293、U937、Hela、Lo2、HepG2、K562、NB4、Molt4、A549、 MCF7细胞。待细胞处于指数生长期分别收集细胞，提取总RNA，经逆转录反应获取上述细 胞的cDNA。以上述cDNA为模板，采用LOC401296的引物对(上游：5‘acctgctctggggttgccat3’， 下游：5‘acgtagccttgctgggtgtg3’)进行PCR扩增，分析LOC401296基因的mRNA在上述细 胞中的表达情况。结果表明在HEK293、U937、Hela、Lo2、HepG2、K562、NB4、Molt4、 A549、MCF7细胞中均检测到LOC401296基因的mRNA表达，表明LOC401296是一个广泛 表达的基因(图1)。

实施例3LOC401296特异性siRNA抑制LOC401296的mRNA和蛋白表达

LOC401296特异性siRNA序列(siRNA-1#和siRNA-2#)和用于对照组的随机siRNA序 列(siRNA-NC)如表1所示。按照Lipofectamine2000转染试剂说明书将siRNA分别转染 HEK293细胞，siRNA终浓度为100nM。转染后48小时收集细胞，分别提取总RNA和总蛋 白质，进行RT-PCR和western检测，分析siRNA序列对LOC401296表达的抑制作用。如图 2所示，与siRNA-NC相比，siRNA-1#和siRNA-2#均能有效抑制LOC401296的mRNA和蛋 白的表达。

表1siRNA序列

实施例4LOC401296基因功能鉴定

Hela细胞用1640培养完全液(含10％FBS、青霉素、链霉素)培养，5％CO₂饱和湿度， 37℃培养箱培养，传代后细胞90％-100％融合时再次传代。HEK293、A549、MCF7细胞用 DMEM完全培养液(含10％FBS、青霉素、链霉素)培养。

1、siRNA转染细胞

接种细胞至细胞培养板(培养液含10％FBS，不含抗生素)，接种后24h转染，转染时 细胞约40％融合。(2)转染工作液配制：siRNA用DEPC水溶解为20μM溶液，按吉玛RNA oligo合成报告单使用说明每1OD siRNA加150μl DEPC水溶解，溶解后立即使用或每管20μl 分装于-80℃冻存；24孔板内转染时siRNA溶液及Lipofectamine2000试剂均用无抗生素、无 血清DMEM培养液或1640培养液稀释，siRNA溶液2.5μl稀释至25μl(工作浓度100nM)， Lipofectamine2000试剂2μl稀释至25μl，两种稀释液等体积混匀后室温孵育5min。(3)转 染。每孔取50μl转染工作液逐滴加入500ul培养液中轻轻振荡混匀，将细胞置于37℃，5％CO₂饱和湿度培养箱内培养。96孔板内转染时，试剂用量以24孔板用量为基数除以5；6孔板 内转染时，试剂用量以24孔板用量为基数乘以5，试剂工作浓度不变。

2、显微镜下分析细胞形态

按照上面siRNA转染方法，在HEK293细胞中分别转染siRNA-1#、siRNA-2#和 siRNA-NC。转染后48小时和72小时显微镜下观察HEK293细胞形态。结果发现，转染 siRNA-1#和siRNA-2#的细胞形态发生明显改变，主要表现为细胞贴壁能力下降，细胞形态变 圆，并出现死亡细胞(图3)。为了排除siRNA的非靶效应，我们采用通过 pCMV-Myc-LOC401296进行回转实验。结果发现，在转染siRNA-2#的HEK293中回转 LOC401296表达后HEK293细胞形态异常现象明显好转(图4)。这些结果表明转染siRNA-2# 导致的HEK293细胞形态改变的确为下调LOC401296表达引起的特异性生物学作用。

3、CCK-8法检测细胞增殖

按照上面siRNA转染方法，96孔板内用siRNA转染方法下调LOC401296基因表达，连 续检测转染后0、1、2、3、4天活细胞数量，设LOC401296下调组(siRNA-2#)和对照组 (siRNA-NC)，每组各5个平行样。按Dojindo公司CCK-8试剂使用说明，每100μl细胞 培养液中加入CCK-8溶液10μl，使用时可先将CCK-8试剂用新鲜细胞培养液按1:10稀释， 弃旧培养液，每孔加入110μl CCK-8稀释溶液，37℃5％CO₂饱和湿度培养箱内孵育15-30min 后观察显色情况，孵育30min-4h时间内每隔30min用酶标仪450nm波长检测吸光度值，每 次试验均设调零孔。根据各组吸光度值分析细胞增殖情况。

下调LOC401296基因表达后1、2、3、4天，采用CCK-8法检测HEK293、Hela、MCF7、 A549等细胞数量，拟合细胞生长曲线分析细胞增殖情况：发现HEK293细胞自干涉后第1天 起增殖开始受到抑制，随时间延长这种抑制作用越明显，增殖抑制率最高可达48％；此外， Hela、MCF7、A549等肿瘤细胞增殖均受到明显抑制(图5)。说明抑制LOC401296基因表 达能够显著抑制细胞生长，有效的抑制了肿瘤细胞的生长，可见该siRNA具有抗肿瘤的作用。

3、Annexin V-FITC检测凋亡

按照上面siRNA转染方法，6孔板内采用siRNA转染方法下调HEK293、Hela细胞 LOC401296基因表达，设LOC401296下调组(siRNA-2#)和对照组(siRNA-NC)，每组3 个平行样，于干涉后2、3天收集细胞经流式细胞仪分析细胞凋亡比例。凋亡检测样本制备按 试剂使用说明进行，方法如下：(1)细胞用0.25％胰酶(不含EDTA)消化，消化时间不宜 过长，待细胞变圆时轻轻吹打使其脱落，3000rpm离心5min收集(1-5)×10⁵个细胞。(2) 用PBS洗涤细胞2次，每次3000rpm离心5min。(3)加入500μl Binding Buffer悬浮细胞。 (4)加入5μl Annexin V-FITC混匀后，加入5μl PI，混匀。(5)室温避光反应5-15min后经 流式细胞仪检测。

结果显示：通过下调Hela细胞、HEK293细胞内LOC401296基因表达水平，比较干涉 组及对照组凋亡细胞比例，我们发现下调LOC401296基因表达在这两种细胞系均导致细胞凋 亡比例增加：HEK293细胞干涉后第2天干涉组凋亡7.90％，对照组凋亡2.98％；干涉后第3 天干涉组凋亡7.06％，对照组凋亡3.28％(图6A)；Hela细胞干涉后第2天干涉组凋亡9.88％， 对照组凋亡6.21％；干涉后第3天干涉组凋亡16.53％，对照组凋亡9.26％(图6B)。统计分 析表明，与相应的对照组相比，实验组凋亡细胞比例增加具有统计学意义(p<0.05)。

4、流式细胞术检测周期分布

采用流式细胞术分析HEK293、Hela细胞下调LOC401296基因表达后细胞周期改变，设 LOC401296下调组(siRNA-2#)和对照组(siRNA-NC)，每组3个平行样，于干涉后2天 收集细胞进行分析。流式细胞术检测细胞周期样本制备方法：(1)HEK293细胞用0.25％胰 酶(不含EDTA)消化，Hela细胞用0.25％胰酶(含0.02％EDTA)消化，待细胞变圆时轻轻 吹打使其脱落，用1.5ml EP管3000rpm离心5min收集细胞约(1-5)×105个。(2)加入300μl 含10％肽牛血清的PBS溶液将细胞沉淀制成单细胞悬液，减少细胞黏连。(3)再加入700μl 无水乙醇重悬细胞，置-20℃固定24h以上。(4)细胞固定后3000rpm离心5min，弃固定液， 用PBS将细胞洗涤2次，每次3000rpm离心5min。(5)RNase A用PBS溶液配制，浓度1mg/ml， 每管细胞样本加入100ul RNase A，37℃孵育30min。(6)每管样本加浓度为100μg/ml PI200μl， 室温避光染色15-20min后上机检测。

下调LOC401296基因表达后进行周期检测，结果发现：siRNA-2#转染后第2天HEK293 细胞、HeLa细胞均出现G2/M期阻滞。图7显示单次实验的数据，对三个重复样品进行统计 分析表明，与相应的对照组相比，实验组G2/M期细胞比例增加具有统计学意义(p<0.05)。

5、流式细胞术检测细胞有丝分裂阻滞

采用流式细胞术分析Hela细胞下调LOC401296基因表达后细胞周期改变，设LOC401296 下调组(siRNA-2#)和对照组(siRNA-NC)，每组3个平行样，于干涉后2天、3天收集细 胞进行分析。流式细胞术检测细胞有丝分裂比例样本制备方法：(1)细胞收集及固定与周期 样本制备方法相同。(2)细胞固定后3000rpm离心5min，弃固定液，用PBS将细胞洗涤2 次，每次3000rpm离心5min，吸尽残留液体。(3)加入100μl0.3％TritonX-100室温破膜15min。 (4)兔抗人p-H3(S10)抗体(有丝分裂期特异性标志物)用0.3％TritonX-100按1:1000稀 释，轻轻混匀后37℃孵育30min。(5)PBS将细胞洗涤1次，3000rpm离心5min，吸尽残 留液体。(6)山羊抗兔IgG/FITC标记抗体用PBS按1:100稀释，37℃孵育30min。(7)用 PBS将细胞洗涤1次，3000rpm离心5min，吸尽残留液体。加入1mg/ml RNaseA100μl悬 浮细胞，37℃孵育30min。(8)每管加100μg/ml PI200μl，室温避光染色15-20min后上机 检测。

结果表明，下调LOC401296表达后第2天，HeLa细胞中p-H3阳性细胞比例明显高于对 照组(图8)，经统计分析表明具有统计学意义，提示LOC401296表达下调可以提高HeLa细 胞细胞有丝分裂期阻滞。随后，为了证实下调LOC401296引起细胞有丝分裂期阻滞的特异性， 我们采用LOC401296回转实验验证该生物学效应。结果证明下调LOC401296后回转 LOC401296表达质粒，成功逆转了LOC401296下调表达所诱导的有丝分裂期阻滞(图9)， 证实了下调LOC401296基因表达引起细胞有丝分裂期阻滞增加是下调LOC401296表达的特 异性生物学效应。

另外，下调LOC401296表达后，采用含有终浓度为100ng/ml Nocodazole的培养液对细 胞进行培养，连续作用16h，通过振荡法收集有丝分裂期细胞，而后释放到不含有Nocodazole 的培养液。在释放后不同时间收集细胞，检测细胞周期，分析LOC401296下调对M期周期 进程的影响。结果发现，LOC401296下调组细胞M期进程受到抑制(图10)。

6、免疫荧光法观察纺锤体形态

siRNA下调Hela细胞LOC401296基因表达后，间接免疫荧光法标记β-Tubulin观察细胞 有丝分裂过程中纺锤体形态变化。设LOC401296下调组(siRNA-2#)和对照组(siRNA-NC)。 实验方法如下：(1)盖玻片用浓硫酸浸泡过夜后，流水冲洗干净，然后将盖玻片在95％乙醇 中浸泡2h，高压灭菌后烤干备用。(2)灭菌的盖玻片用100μg/ml多聚赖氨酸溶液浸泡过夜， 次日用1ml PBS漂洗3次后晾干3-4h。(3)将经多聚赖氨酸处理的盖玻片置于6孔板内， 接种Hela细胞使爬片生长。(4)接种后24h内转染，转染时细胞约50％融合，按前期实验 条件进行转染siRNA序列。(5)转染后48h移除培养液，细胞用4％多聚甲醛室温固定10min。 (6)细胞置于摇床上于最低转速(40rpm)用PBS漂洗3次，每次5min。(7)用0.3％TritonX-100 冰浴条件下破膜10min。(8)细胞用含3％牛血清白蛋白(BSA)及0.3％TritonX-100的PBS 溶液室温封闭1h。(9)标记β-Tubulin：用3％BSA稀释抗体，兔抗人β-Tubulin抗体1:25 稀释，4℃孵育过夜。(10)细胞置于摇床上于最低转速(40rpm)用PBS漂洗3次，每次5min。 (11)羊抗兔IgG/FITC标记抗体用3％BSA1:50稀释，室温避光孵育2h。(12)细胞置于摇 床上最低转速(40rpm)用PBS漂洗3次，每次5min。(13)染核。1μg/ml DAPI用PBS1： 500稀释，室温避光染色8min。(14)细胞置于摇床上最低转速(40rpm)用PBS漂洗3次， 每次5min。(15)取洁净载玻片，在盖玻片上滴加50％甘油15-20μl封片，将盖玻片反扣于 甘油上(附着细胞的一面朝下)，避光出现气泡，用滤纸吸尽过多液体。

实验结果显示：下调LOC401296基因表达引起细胞发生明显纺锤体形态异常，包括纺锤 体偏移、纺锤体不对称、纺锤体偏移及不对称、多极纺锤体、单级纺锤体、纺锤体紊乱或缺 失等多种异常形态(图11)。随机分析200个有丝分裂期细胞进行统计分析，结果表明，对 照组细胞中纺锤体异常细胞比例为10.5％，LOC401296下调组细胞中纺锤体异常细胞比例为 73％。实验证明，下调LOC401296基因表达会导致纺锤体形成和功能障碍，影响染色体分离、 细胞分裂等重要生理过程，进一步抑制细胞正常生长。该结果进一步证实了LOC基因的表达 与有丝分裂相关，抑制该基因或其蛋白产物，能够阻断有丝分裂进程，进而抑制细胞生长， 可用于抑制肿瘤生长，具有抗肿瘤的应用前景。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以 权利要求书所界定的为准。