检测miR-129-2甲基化的试剂在制备检测乳腺癌试剂盒中的应用

摘要

本发明属于分子诊断领域，提供了检测miR-129-2甲基化的试剂在制备检测乳腺癌试剂盒中的应用。具体的说，本发明提供了序列为SEQ ID NO：1-4的引物在制备检测乳腺癌试剂盒中的应用。此外，本发明还提供了使用Touchdown-PCR非诊断检测miR-129-2甲基化的方法。

说明书

技术领域

本发明属于分子诊断技术领域，具体的说，使用引物检测微小RNA miR-129-2的甲基 化以诊断乳腺癌。

背景技术

微小RNA(microRNA)是一类高度保守的非编码小RNA分子，其通过在后转录水平 对目标信使RNA(mRNA)的降解或抑制，达到调节基因表达的目的。在人体中，微小RNA miR-129被转录为miR-129-1和miR-129-2，分别位于染色体7q32和11p11上，已经有文献 报道了miR-129-2在多种癌症中表达下调，预测其具有肿瘤抑制作用。

甲基化是一种基因的表观遗传学修饰方式。在哺乳动物中几乎所有DNA甲基化发生在 CpG二核苷酸序列的5＇胞嘧啶上。CpG岛区域的甲基化与基因转录抑制有关。基因启动子 甲基化被认为是一种调节肿瘤细胞中原癌基因活性的表观遗传学修饰机制。已经有研究显示 DNA甲基化在微小RNA的调控中有重要作用，如，研究发现在子宫内膜癌中miR-129-2的 启动子区呈高甲基化状态，当使用药物去除miR-129-2启动子甲基化时，SOX4表达下调， 肿瘤细胞增长受到抑制(Huang YW,Liu JC,Deatherage,et al.Epigenetic Repression of  microRNA-129-2Leads to Overexpression of SOX4Oncogene in Endometrial Cancer)。

目前，对于miR-129-2甲基化与癌症关系的研究主要集中在子宫内膜癌、胃癌、膀胱癌、 结直肠癌方面，尚没有对乳腺癌组织中miR-129-2甲基化的研究结果发表。

发明内容

针对上述问题，申请人使用一对甲基化和一对非甲基化引物以甲基化特异性引物PCR (MSP)检测了乳腺癌细胞株和正常样本中的miR-129-2甲基化情况，发现多个乳腺癌细胞 株中普遍存在miR-129-2甲基化，而正常样本中并没有miR-129-2甲基化，由此提供了检测 miR-129-2甲基化以诊断乳腺癌的方法。此外，针对普通PCR特异性不足的问题，申请人提 供了使用touch-down PCR方法非诊断检测miR-129-2甲基化的方法，以用于癌症发生分子 机制的实验室研究。

一方面，本发明提供了检测微小RNA甲基化的试剂在制备检测癌症试剂盒中的应用。

在进一步的方面，该应用中的微小RNA为miR-129-2，癌症为乳腺癌。

在进一步的方面，该应用中检测微小RNA甲基化的试剂为一组检测微小RNA甲基化 的引物，引物序列为SEQ ID NO：1-4。

另一方面，本发明提供了非诊断检测miR-129-2甲基化程度的方法，其中使用甲基化和 非甲基化引物对样品DNA进行PCR扩增(MSP)，根据扩增结果来判断miR-129-2甲基化 程度。非诊断检测方法可以是用于科研用途的方法，例如可以非诊断的检测来自各保藏机构 的细胞株样本，或者医疗机构所收集的研究用细胞/血液样本，这些样本的样本主体已经去 世/治愈/去向不明，所以显然检测其miR-129-2甲基化程度并不是为了检测样本主体的健康 状态而是为了科研。

在进一步的方面，该方法中甲基化和非甲基化引物的序列为SEQ ID NO：1-4，PCR方 法为touch-down PCR方法。

20μl反应体系：

1μl重亚硫酸盐处理的DNA、250μM正向引物和反向引物、0.75μM dNTPs、3.75mM MgCl2、 0.625units AmpliTaq GoldDNA聚合酶(Roche Molecular Systems,Inc.,Branchburg,NJ)

循环参数：

具体实施方式

试验材料：

乳腺癌细胞株MDA-MB-425、MDA-MB-468、SK-BR-3购买自中国科学院典型培养物 保藏委员会细胞库；

6例正常人组织样本，由合作医院提供；

作为对照的正常成人染色体DNA和甲基化DNA购买自US Biological；

引物由上海英骏(introvigen)合成；

试验中使用的其他材料均为常规市售种类。

试验过程：

收集培养中的MDA-MB-425、MDA-MB-468、SK-BR-3细胞株，提取DNA；

提取血浆样本DNA；

使用EpiTect亚硫酸氢钠试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)将DNA样品中未甲基化 的胞嘧啶转化为尿嘧啶；

使用甲基化引物

正向引物：GAGTTGGGGGATCGCGGACGGT(SEQ ID NO：1)

反向引物：ATATACCGACTTCTTCGATTCGCCG(SEQ ID NO：2)

和非甲基化引物：

正向引物：GAGTTGGGGGATTGTGGATGGT(SEQ ID NO：3)

反向引物：AATATACCAACTTCTTCAATTCACCA(SEQ ID NO：4)

进行touch-down(TD)PCR:

20μl反应体系：

1μl重亚硫酸盐处理的DNA、250μM正向引物和反向引物、0.75μM dNTPs、3.75mM MgCl2、 0.625单位AmpliTaq GoldDNA聚合酶(Roche Molecular Systems,Inc.,Branchburg,NJ)

循环参数：

以溴化乙锭染色，在6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶中观察扩增产物来判断miR-129-2甲基化 情况。

试验结果：

在三个乳腺癌细胞株MDA-MB-425、MDA-MB-468、SK-BR-3的DNA样品中均检出 miR-129-2甲基化，与作为阳性对照的正常成人染色体甲基化DNA一致。

6例正常人组织样本中均显示出miR-129完全未甲基化，与作为阴性对照的正常成人染 色体DNA一致。