防治番茄早疫病的生防菌株及其应用

摘要

本发明公开了一种防治番茄早疫病的生防菌株及其应用，属于植物保护技术领域。防治番茄早疫病的生防菌株，其分类命名为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）XGY13-2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.8974；XGY13-2菌株在发酵培养液于30℃180rpm摇床振荡培养8-9d，制备得到生防菌剂，活菌总浓度为1×10

说明书

技术领域

本发明涉及一种防治番茄早疫病的生防菌株及其应用，属于植物保护技术领域，专用于番茄早疫病的生物防治。 

背景技术

番茄是一种重要的蔬菜作物，其适应范围广，广泛分布于世界各地，被列为全世界产量最高的 30 种农作物之一。其产量高，营养丰富，富含维生素类和糖类，既可生食又可做加工之用，因而深受人们喜爱。番茄早疫病是由茄链格孢菌Alternaria solani (Ell & Mart) Jones et Grout侵染导致的常发病害，是世界性土传病害，为番茄的主要病害之一。在美国、澳大利亚、以色列、印度、希腊等地发病率都很高，严重时可使产量损失 35-78%。70 年代后期，80 年代以来在我国黑龙江、吉林、山东、河北、山西、广东、广西、湖北、江苏、上海、浙江、湖南和四川等大部分地区普遍发生，危害年趋严重，成为露地、保护地番茄生产中的重要病害。该病可以引起落叶、落花、落果和断枝，对产量影响很大，严重时可以使产量损失 50%以上，而且因果实内含有毒素，会使人体患有血液病，影响人体健康。番茄早疫病给人们生产和健康带来了不可低估的影响。 

目前番茄早疫病的防治主要依赖化学药剂,但易造成环境和食品的污染,同时也易诱发病原菌的抗药性,而关于番茄早疫病害的生物学防治,国内目前仅仅局限于拮抗微生物实验室简单的筛选工作。在国外已登记的数百种生物农药目录中,只有Bacillus subtilis QWT713对番茄早疫病害有一定的防治作用。 

当前,农业已进入一个新的发展阶段,面临着结构调整、产业升级、生态环境治理、提高产品质量安全性和市场竞争的严峻挑战,生物防治是植物病虫害防治必不可少的措施,也迫切需要开发并商业化生产对番茄早疫病防效良好的生物农药。 

发明内容

针对现有技术中没有对番茄早疫病有较高防效的生防制剂的现状，提供开发一种防治番茄早疫病的单一生防菌菌株及其应用，该菌剂对这种重要土传病害的防效可以达到60%以上。 

本发明采用的技术方案为： 

一种防治番茄早疫病的生防菌株，其分类命名为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）XGY13-2，于2014年3月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3     号 中国科学院微生物研究所，邮编 100101菌种保藏号为CGMCC NO.8974。

所述防治番茄早疫病的生防菌株在防治番茄早疫病方面的应用。 

所述的防治番茄早疫病的生防菌株在防治番茄早疫病方面的应用，将防治番茄早疫病的生防菌株按1%（v/v）的接种量接种于发酵培养液中，于30℃ 180 rpm摇床振荡培养8-9d，制备得到生防菌剂，然后浸种或者灌根使用。 

所述生防菌剂中活菌总浓度为1×10⁹ -1×10¹⁰ CFU/mL。 

所述发酵培养液为：蔗糖2g/L、玉米粉20g/L、黄豆粉10g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、七水硫酸镁0.2g/L、酵母膏0.4g/L、碳酸钙1g/L、氯化铁0.005g/L。 

上述生防菌剂在防治番茄早疫病方面的应用方法为：得到的生防菌剂稀释50-200倍后在番茄种植时浸种使用至少半小时，或者在移栽时以每亩9升进行灌根处理。 

有益效果

本发明的优点和积极效果表现在：本发明是专门针对番茄早疫病开发的生防制剂。本发明有利于番茄的无公害生产，减少甚至替代其他化学农药的使用，节省农民开支。提高番茄的产量和品质，促进农民增收。

温室实验表明：该菌制剂能显著降低番茄早疫病的发生。该菌剂可以稀释50-200倍后在番茄种植时浸种处理幼苗，或者在移栽时灌根处理。在温室条件下对于番茄早疫病的防效可以达到68.05%。 

具体实施方式

实施例1防治番茄早疫病的生防菌株的筛选方法 

防治番茄早疫病的生防菌株，地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）XGY13-2，为2013年在江苏南京病田土壤中分离得到，筛选过程如下：

于 2013 年7月，在江苏省南京市溧水区番茄早疫病发病严重的地块采集样品。采用五点采样法，每点间隔至少 10 m。每点收集三株健康植株的根围土，带回实验室进行分离。

称取根围土 3 g, 分别加入到 27 mL 灭菌水中（含灭菌玻璃珠），180 rmp 摇床振荡 0.5 h，静置 5 min，得到10^-1 稀释液，吸取上清液 0.1 mL 依次稀释，分别取 10^-4---10^-6 三个梯度 0.1 mL 涂 LB 平板，28°C 培养 48 h, 选取菌落数在50---300 之间的平板，计数并且挑取所有菌落，纯化，-70℃，40 % 甘油保存备用。 

用LB平板活化分离纯化的菌株，牙签挑取处于生长盛期的菌落点于含青枯病原菌的 YGPA 平板上，每板 5 点，间距相等，30℃ 培养 48 h，观察并且记录结果，分别量取颉颃菌内径以及颉颃圈外径。根据内外径之差划分为三个等级1—3mm，3—6mm，6mm以上。其中LB平板培养基的配方为：酵母粉5g/L、胰蛋白胨10g/L、 氯化钠10g/L。 

按照平板拮抗活性、蛋白酶活性、几丁质酶活性、纤维素酶活性、葡聚糖酶活性以及产嗜铁素活性，采用赋值法，选择出综合得分较高菌株，通过温室试验最终筛选出防治效果最好的XGY13-2。 

实施例2 菌株鉴定 

防治番茄早疫病的生防菌株，地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）XGY13-2的生理生化特性为：革兰氏阳性杆菌，0.6～0.8×1.5～3.0微米，细胞形态和排列呈杆状、单生。芽孢形态：产生近中生的椭圆状芽孢，孢囊稍膨大。菌落形态：菌落粗糙，不透明，粘着，扩展。明胶液化，淀粉水解，V.P.试验阳性，柠檬酸盐利用。培养特性：在肉汁培养基上的菌落为扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙皱褶，24h后菌落直径为3mm　培 养 基：Nutrient Agar （营养肉汁琼脂）：蛋白胨5 g，牛肉膏 30 g，NaCl 5 g，琼脂 15 g，蒸馏水 1L ，调pH 7.0-7.2。

实施例3 XGY13-2生防菌剂的制备 

LB培养基为：酵母粉5g/L、胰蛋白胨10g/L、 氯化钠10g/L。

发酵培养液为：蔗糖2g/L、玉米粉20g/L、黄豆粉10g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、七水硫酸镁0.2g/L、酵母膏0.4g/L、碳酸钙1g/L、氯化铁0.005g/L。 

将分离出的XGY13-2单菌落于上述LB液体培养基，30℃ 180 rpm摇床振荡培养10h，获得种子液。将种子液以1%（v/v）的接种量接种于上述发酵培养基，于30℃ 180 rpm摇床振荡培养8-9d，菌剂成品中活菌总浓度为1×10⁹ -1×10¹⁰ CFU/mL。 

  

实施例4 温室盆钵试验检测XGY13-2生防菌剂对番茄早疫病的防效

供试番茄苗长至5-6片叶时，进行如下处理：

番茄的叶片上涂抹10⁷cfu/ml的XGY13-2发酵液，全部涂抹番茄的叶片后，再灌根接种10mL/每株，每处理20株。对照用清水处理。实验结果见表1。

接种后第二周，以叶片为单位按 0-4 级标准调查病情，病害严重度分级标准、病害严重度和防效的计算公式如下： 

1 级：病斑面积占羽状叶面积的 1/4 以下； 

2 级：病斑面积占羽状叶面积的 1/4-1/2； 

3 级：病斑面积占羽状叶面积的 1/2-3/4，近一半小叶枯死； 

4 级：病斑面积占羽状叶面积的 3/4 以上，一半以上或全部小叶枯死；

                                                                  

调查结果显示，生防菌剂XGY13-2对番茄早疫病的防效达到68.05%。

表1 温室中生防菌剂XGY13-2对番茄早疫病的生防效果 

处理病害严重度>生防效果(%)XGY13-226.28±3.1268.05对照82.25±2.970

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