一类侧基天然精氨酸和乳糖酸协同修饰的聚甲基丙烯酰胺阳离子聚合物、制备方法及用途

摘要

本发明公开了一类侧基天然精氨酸和乳糖酸协同修饰的聚甲基丙烯酰胺阳离子聚合物、制备方法及其作为基因载体的应用。系通过可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合以及后续脱保护反应合成了侧基为氨基的甲基丙烯酰胺阳离子功能聚合物，随后，将含保护基的精氨酸以及乳糖酸砌块联接到聚甲基丙烯酰胺分子上，最后脱除保护基后即得到目标聚合物，其制备方法简单，反应条件温和。细胞评价结果表明，本发明中制备的一类侧基天然精氨酸和乳糖酸协同修饰的聚甲基丙烯酰胺阳离子聚合物具有高生物相容性、低细胞毒性、高基因转染效率、良好的血清稳定性，是一类有效的新型糖基修饰聚合物非病毒基因载体，可作为高效的基因转染试剂得到应用。

说明书

技术领域

本发明涉及生物功能材料领域。具体涉及到侧基天然精氨酸和乳糖酸协同修饰的聚甲基丙烯酰胺阳离子聚合物、制备方法及其作为生物功能载体材料的应用。

背景技术

研制高效、低毒的新型阳离子聚合物载体材料已经成为了目前生物功能材料及转染试剂相关领域研究的主要方向之一。近来发现，许多阳离子聚合物作为基因载体的转染效率相对较低是因其在细胞内输送过程中需要跨越一些膜性细胞器(如细胞膜和核膜等)，而跨膜能力较低，因而增强阳离子聚合物基因载体的跨膜能力将是提高其基因转染效率的可能方法之一。目前在天然产物中发现一些富含精氨酸残基的多肽，如Tat肽、核定位(NLS)肽、肽核酸、糖基化多肽，以及合成的寡聚精氨酸多肽等具有较强的跨膜能力，相关研究表明精氨酸残基的存在对其穿膜能力起着至关重要的作用。因此，设计合成将天然精氨酸片段化学偶联至阳离子聚合物基因载体材料中进行改性，将可能提高其与基因的相互作用及载体/基因复合物的细胞内吞能力，进而实现提高基因转染效率的目的。在本发明的前期工作中，已经开发了一系列侧基精氨酸修饰的聚甲基丙烯酰胺阳离子聚合物作为基因载体(Biomaterials2013,34,7923；中国专利申请号201310325795.9)，发现天然精氨酸结构的修饰及修饰率对提高载体的转染效率具有重要影响，然而，该体系在细胞毒性和转染效率方面还有待进一步改善。

另一方面，糖类化合物是一类重要的生物活性物质，其具有良好的生物相容性和可降解性，不仅是生物体能量的来源，同时在生物体构建、物质代谢和信号转导等诸多的生理过程中发挥着极其重要的作用。目前，糖类化合物已被广泛应用于生物医药领域，一些自然界中广泛存在的多糖，如几丁质(chitin)、壳聚糖(chitosan)、纤维素(cellulose)、淀粉(starch)、糊精(dextran)等被大量应用于制备生物材料。此外，一些特定结构的小分子糖类化合物具有细胞膜识别、介导细胞黏附以及细胞内信号转导等生物学功能，被作为修饰基团引入生物材料中进行功能化改性，从而达到提高材料的生物相容性及实现特定生物功能的目的。近年来研究发现将一些小分子的糖类物质(如山梨醇、甘露糖、葡萄糖酸、乳糖酸等)作为结构砌块，与线性或枝化结构的PEI分子偶联后作为基因载体输送DNA或siRNA，能够进一步提高载体的生物相容性，其原因可能是由于引入的多羟基糖分子砌块导致载体表面阳离子电荷密度降低，从而降低了对细胞膜的破坏能力所致。而且经上述糖类物质修饰后的载体可获得大大优于未经修饰载体的基因转染效率，这可能与引入的多羟基糖分子砌块具有较高渗透性导致其细胞内吞效率提高相关。因此，合理的设计糖类分子砌块引入到相关的阳离子聚合物基因载体材料中，实现高效基因表达从而提高其转染效率，同时又能降低载体细胞毒性，将是解决转染效率与细胞毒性的有效方法，也是研发高性能基因输送生物材料的可行性方向。

进一步的，通过发展反应条件温和、可控的聚合反应及化学修饰技术得到分子量可控、分子量分布窄、结构明确的糖基修饰聚合物，有利于研究载体结构与其性能之间的关系，也可为进一步从结构上优化载体材料提供参考。因此，在上述的相关基础上，本发明拟设计开发一类具有规整可控分子骨架的阳离子聚合物，其结构中同时包含可提高载体/DNA复合物的非特异性胞吞能力的精氨酸阳离子片段，以及具有良好生物相容性并可提高表面渗透压的乳糖酸片段，进一步将其发展成为一系列新型的高效、低毒的基因载体。在此基础上，发展温和、高效、易操作的化学偶联和修饰方法，为发展安全、高效的基因治疗提供性能优良的新型生物材料。这也是本发明所致力的目标。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一类侧基天然精氨酸和乳糖酸协同修饰的聚甲基丙烯酰胺阳离子聚合物。

本发明的目的之二在于提供一类侧基天然精氨酸和乳糖酸协同修饰的聚甲基丙烯酰胺阳离子聚合物的制备方法。

本发明的目的之三是提供一类侧基天然精氨酸和乳糖酸协同修饰的聚甲基丙烯酰胺阳离子聚合物作为基因载体材料的用途。

本发明所提供的一类侧基天然精氨酸和乳糖酸协同修饰的聚甲基丙烯酰胺阳离子聚合物，可由以下化学结构式(I)表示：

上式(I)中，n表示甲基丙烯酰胺聚合物主链的聚合度，其取值范围为5～400，优选5～200；x表示侧基天然精氨酸修饰的聚甲基丙烯酰胺共聚单元的聚合度，其取值范围为5～400，优选5～200；y表示侧基天然乳糖酸修饰的聚甲基丙烯酰胺共聚单元的聚合度，其取值范围为5～200，优选5～100；A^-表示阴离子反离子，具体包括氯离子、三氟甲磺酸根离子或三氟乙酸根离子(TFA^-)。

依据本发明的一类侧基天然精氨酸和乳糖酸协同修饰的聚甲基丙烯酰胺阳离子聚合物的合成制备方法，其步骤包括：

第一步：将端氨基Boc保护的己二胺基甲基丙烯酰胺功能单体偶氮二异丁腈(AIBN)自由基聚合引发剂、RAFT链转移剂十二烷基三硫代碳酸-(4-氰基戊酸)酯按摩尔比5～400:3:1溶于有机溶剂中，于25～120℃下反应4～48h。然后浓缩反应溶液，将浓缩液在冰乙醚中沉淀除去未反应残留单体，所得沉淀经过滤干燥，得到侧基为Boc保护的己二胺基甲基丙烯酰胺聚合物，其分子量为1500～11万，优选1500～5万。数均分子量可以利用¹H核磁共振(¹H NMR)谱图中聚合物末端RAFT试剂残基上质子的特征峰积分与聚合物侧链上的特定基团上质子的特征峰积分的比值计算出，并能进一步通过凝胶渗透色谱(GPC)来表征，本发明中以核磁计算结果为准。随后上述聚合物加过量酸脱除Boc保护基，在0～50℃下反应1～3h，最终制备得到侧基己二胺基甲基丙烯酰胺阳离子功能聚合物，其结构式如下(Ⅱ)所示：

上式(Ⅱ)中，A^-表示阴离子反离子，具体包括氯离子、三氟甲磺酸根离子以及三氟乙酸根离子。n表示甲基丙烯酰胺聚合物主链的聚合度，其取值范围为5～400,优选5～200。

第二步：将叔丁氧羰基-N^ω-(2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)-L-精氨酸(Boc-Arg(Pbf)-OH)、乳糖酸、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、二异丙基乙基胺(DIPEA)按设定的摩尔比(1.0:0.1～0.3:0.8～2.5:1.0～3.0)事先溶解于有机溶剂中反应10～60min。然后加入第一步中的产物侧基己二胺基甲基丙烯酰胺阳离子功能聚合物，在0～50℃下反应12～120h，其后加入酸在0～50℃下持续反应1～3h以脱除精氨酸上的保护基团，然后减压旋蒸除去溶剂，将粗产物溶于水后过滤并在纯水中透析12～72h，进一步冷冻干燥制备得到如结构式(I)所示产物。所得共聚物的摩尔组成可以通过测定其¹H核磁共振(¹H NMR)谱图，利用精氨酸和乳糖酸片段上特定质子的特征峰积分与侧链上特定质子的特征峰积分的比值来计算得到。

根据本发明所提供的一类侧基天然精氨酸和乳糖酸协同修饰的聚甲基丙烯酰胺阳离子聚合物的合成制备步骤中，所述的有机溶剂包括乙酸乙酯、四氢呋喃、1，4-二氧六环、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、1，2-二氯乙烷、乙醚、乙腈、丙酮、苯、甲苯及其混合溶剂体系。

根据本发明所提供的一类侧基天然精氨酸和乳糖酸协同修饰的聚甲基丙烯酰胺阳离子聚合物合成制备步骤中使用的酸包括盐酸、三氟甲磺酸和三氟乙酸。

根据本发明所提供的一类侧基天然精氨酸和乳糖酸协同修饰的聚甲基丙烯酰胺阳离子聚合物的合成制备方法，合成步骤一所述的反应温度，优选但不仅限于25～120℃，特别优选15～50℃；合成步骤二所述的反应温度，优选但不仅限于0～50℃，特别优选0～30℃。

通过核磁共振，傅里叶变换红外光谱，凝胶色谱等表征方法对均聚物和共聚物的结构进行表征，结果表明聚合物结构明确。

根据本发明所提供的一类侧基天然精氨酸和乳糖酸协同修饰的聚甲基丙烯酰胺阳离子聚合物，与已公开报道的阳离子聚合物基因载体相比(Biomaterials,2009,30,658；J.Polym.Sci.,Part A:Polym.Chem,2010,48,2869)，通过侧基天然精氨酸的修饰增加了载体与基因复合物的细胞内吞能力，提高了活细胞基因转染效率。同时，本发明通过在侧基上同时引入乳糖酸残基，使得该类基因载体具有良好的生物相容性，并且乳糖酸分子中的多个羟基有利于提高其表面渗透压，从而提高基因转染效率，另一方面，高亲水性的乳糖酸砌块的引入可在载体表面形成水化层，有效降低血清蛋白的相互作用及表面吸附，赋予了该类乳糖酸修饰的生物材料良好的血清稳定性能。此外，本发明所提供的一类侧基天然精氨酸和乳糖酸协同修饰的聚甲基丙烯酰胺阳离子聚合物的合成制备方法简单、高效，便于合成制备结构规整可控的阳离子聚合物。与现有商业化的枝化聚乙烯亚胺阳离子聚合物基因转染试剂bPEI-25k相比较，本发明所提供的一类侧基天然精氨酸和乳糖酸协同修饰的聚甲基丙烯酰胺阳离子聚合物具有明显较低的细胞毒性。作为基因输送载体材料，在多种细胞株基因转染中具有与bPEI-25K相当的高基因转染效率，且可适用于有血清的转染体系，可作为一类高效低毒的基因转染试剂在基因转染中得到应用。

附图说明

图1、本发明实施例1,2中一类侧基天然精氨酸和乳糖酸协同修饰的聚甲基丙烯酰胺阳离子聚合物在肝癌模型细胞SK-HEP-1中的细胞毒性评价结果。具体试验方法参见实施例6。

图2、本发明实施例1中一类侧基天然精氨酸和乳糖酸协同修饰的聚甲基丙烯酰胺阳离子聚合物作为基因载体在肝癌模型细胞SK-HEP-1中绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染后的细胞荧光成像图。左图为荧光照片，右图为明场照片。其中，加入的阳离子聚合物基因载体与编码增强绿色荧光蛋白的质粒DNA的电荷比(+/-)为10，具体试验方法参见实施例7。

图3、本发明实施例1,2中一类侧基天然精氨酸和乳糖酸协同修饰的聚甲基丙烯酰胺阳离子聚合物作为基因载体在肝癌模型细胞SK-HEP-1中的荧光素酶基因转染评价结果，具体试验方法参见实施例8。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进行具体说明，将有助于对本发明的理解，但并不限制本发明的内容。

实施例1

第一步：将RAFT试剂4-氰基-4-(十二烷基三硫代碳酸)戊酸(35mg)、端氨基Boc保护的己二胺基甲基丙烯酰胺功能单体偶氮二异丁腈AIBN(2.8mg)自由基引发剂、干燥的四氢呋喃溶剂6mL加入到Schlenk反应管中。经3次冷冻－抽真空－融解通氮气循环过程除去反应液中的残留氧气后，将反应管内保持在氮气气氛下，移入经事先预热到70℃的油浴中搅拌反应6h。然后用液氮迅速冷却淬灭反应，减压旋蒸浓缩反应溶液，将浓缩液在冰乙醚中沉淀得淡黄色固体，过滤，在真空干燥箱中干燥24h，制备得到己二胺端氨基Boc保护的甲基丙烯酰胺聚合物，转化率为65％。通过1H核磁共振比较RAFT试剂的特征峰积分与单体的特征峰积分，计算出其聚合度为28，其数均分子量为M_n,NMR＝7.9KDa。通过流动相为四氢呋喃的凝胶渗透色谱(GPC)测得其数分子量为M_n,GPC＝9.0KDa，PDI为1.2，然后将所得的聚合物(1.0g)在室温下溶于5ml二氯甲烷和5ml三氟乙酸的有机混合溶剂中，在20℃下搅拌反应1h。减压旋转蒸发浓缩，在冰乙醚中沉淀、过滤，置于真空干燥箱中干燥，制备得到含有侧基为端氨基官能团的甲基丙烯酰胺聚合物，收率为90％，其主要化学结构特征如下：

¹H NMR(D₂O):3.09‐2.80(CH₂NH₂,CH₂NHCOCH)，2.35‐1.02(COCHCH₂,COCHCH₂,4×CH₂,)

第二步：将叔丁氧羰基‐N^ω‐(2,2,4,6,7‐五甲基二氢苯并呋喃‐5‐磺酰基)‐L‐精氨酸(Boc‐Arg(Pbf)‐OH,286.5mg)、乳糖酸(20.0mg)、苯并三氮唑‐N,N,N',N'‐四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU,190mg)、二异丙基乙基胺(DIPEA,120μL)溶于15mL DMF中，在20℃下搅拌反应30min。然后将第一步中反应所得的聚合物(250mg)加入反应瓶中，继续在20℃下搅拌反应3天。减压旋干有机溶剂，加入5mL二氯甲烷和5mL三氟乙酸的混合有机溶剂，室温下搅拌反应1h，减压旋蒸除去溶剂，加入25mL水后过滤，滤液在水中透析2天，进一步冷冻干燥得到白色固体即为聚合物1，通过¹H核磁共振比较精氨酸片段的特征峰积分与聚丙烯酰胺的特征峰积分，计算出侧基天然精氨酸修饰的聚甲基丙烯酰胺共聚单元的聚合度18，乳糖酸修饰的甲基聚丙烯酰胺共聚单元的聚合度为1，未被修饰的侧基共聚单元聚合度为9，其化学结构式如下：

其主要化学结构特征如下：

¹H NMR(D₂O):4.10‐4.27(OCHO,乳糖酸)，3.77‐3.67(CHNH₂CH₂，精氨酸)，3.20‐2.79(CH₂NH₂,CH₂NHCOCHNH₂,CH₂NHCOCHCH₂,NHCH₂CH₂)，2.50‐2.30(COCHCH₂，NHCH₂(CH₂)₂),2.10‐0.78(COCHCH₂,(CH₂)₄)

实施例2

第一步：将RAFT试剂4-氰基-4-(十二烷基三硫代碳酸)戊酸(70mg)、端氨基Boc保护的己二胺基甲基丙烯酰胺功能单体偶氮二异丁腈AIBN(5.6mg)自由基引发剂、干燥的甲苯溶剂15mL加入到Schlenk反应管中。经3次冷冻－抽真空－融解通氮气循环过程除去反应液中的残留氧气后，将反应管内保持在氮气气氛下，移入经事先预热到70℃的油浴中搅拌反应6h。然后用液氮迅速冷却淬灭反应，减压旋蒸浓缩反应溶液，将浓缩液在冰乙醚中沉淀得淡黄色固体，过滤，在真空干燥箱中干燥24h，制备得到己二胺端氨基Boc保护的甲基丙烯酰胺聚合物，转化率为68％。通过¹H核磁共振比较RAFT试剂的特征峰积分与单体的特征峰积分，计算出其聚合度为28，其数均分子量为M_n,NMR＝7.9KDa。通过流动相为四氢呋喃的凝胶渗透色谱(GPC)测得其数分子量为M_n,GPC＝9.0KDa，PDI为1.2，然后将所得的聚合物(1.0g)在室温下溶于5mL二氯甲烷和5mL三氟乙酸的有机混合溶剂中，在20℃下搅拌反应1h。减压旋转蒸发浓缩，在冰乙醚中沉淀、过滤，置于真空干燥箱中干燥，制备得到含有侧基为端氨基官能团的甲基丙烯酰胺聚合物，收率为90％，其主要化学结构特征如下：

¹H NMR(D₂O):3.09‐2.80(CH₂NH₂,CH₂NHCOCH)，2.35‐1.02(COCHCH₂,COCHCH₂,4×CH₂,)

第二步：将叔丁氧羰基‐N^ω‐(2,2,4,6,7‐五甲基二氢苯并呋喃‐5‐磺酰基)‐L‐精氨酸(Boc‐Arg(Pbf)‐OH,286.5mg)、乳糖酸(40.0mg)、苯并三氮唑‐N,N,N',N'‐四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU,190mg)、二异丙基乙基胺(DIPEA,120μL)溶于15ml DMF中，在20℃下搅拌反应30min。然后将第一步中反应所得的聚合物(250mg)加入反应瓶中，继续在20℃下搅拌反应3天。减压旋干有机溶剂，加入5mL二氯甲烷和5mL三氟甲磺酸的混合有机溶剂，室温下搅拌反应1h，减压旋蒸除去溶剂，加入25mL水后过滤，滤液在水中透析2天，进一步冷冻干燥得到白色固体即为聚合物2，通过¹H核磁共振比较精氨酸片段的特征峰积分与聚丙烯酰胺的特征峰积分，计算出侧基天然精氨酸修饰的聚甲基丙烯酰胺共聚单元的聚合度18，乳糖酸修饰的甲基聚丙烯酰胺共聚单元的聚合度为2，未被修饰的侧基共聚单元聚合度为8，其化学结构式如下：

其主要化学结构特征如下：

¹H NMR(D₂O):4.10‐4.27(OCHO,乳糖酸)，3.77‐3.67(CHNH₂CH₂，精氨酸)，3.20‐2.79(CH₂NH₂,CH₂NHCOCHNH₂,CH₂NHCOCHCH₂,NHCH₂CH₂)，2.50‐2.30(COCHCH₂，NHCH₂(CH₂)₂),2.10‐0.78(COCHCH₂,(CH₂)₄)

实施例3

第一步：将RAFT试剂4-氰基-4-(十二烷基三硫代碳酸)戊酸(35mg)、端氨基Boc保护的己二胺基甲基丙烯酰胺功能单体偶氮二异丁腈AIBN(2.8mg)自由基引发剂、干燥的四氢呋喃溶剂6mL加入到Schlenk反应管中。经3次冷冻－抽真空－融解通氮气循环过程除去反应液中的残留氧气后，将反应管内保持在氮气气氛下，移入经事先预热到70℃的油浴中搅拌反应6h。然后用液氮迅速冷却淬灭反应，减压旋蒸浓缩反应溶液，将浓缩液在冰乙醚中沉淀得淡黄色固体，过滤，在真空干燥箱中干燥24h，制备得到己二胺端氨基Boc保护的甲基丙烯酰胺聚合物，转化率为65％。通过¹H核磁共振比较RAFT试剂的特征峰积分与单体的特征峰积分，计算出其聚合度为28，其数均分子量为M_n,NMR＝7.9KDa。通过流动相为四氢呋喃的凝胶渗透色谱(GPC)测得其数分子量为M_n,GPC＝9.0KDa，PDI为1.2，然后将所得的聚合物(1.0g)在室温下溶于5mL二氯甲烷和5mL三氟乙酸的有机混合溶剂中，在20℃下搅拌反应1h。减压旋转蒸发浓缩，在冰乙醚中沉淀、过滤，置于真空干燥箱中干燥，制备得到含有侧基为端氨基官能团的甲基丙烯酰胺聚合物，收率为90％，其主要化学结构特征如下：

¹H NMR(D₂O):3.09‐2.80(CH₂NH₂,CH₂NHCOCH)，2.35‐1.02(COCHCH₂,COCHCH₂,4×CH₂,)

第二步：将叔丁氧羰基‐N^ω‐(2,2,4,6,7‐五甲基二氢苯并呋喃‐5‐磺酰基)‐L‐精氨酸(Boc‐Arg(Pbf)‐OH,126.5mg)、乳糖酸(60.0mg)、苯并三氮唑‐N,N,N',N'‐四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU,190mg)、二异丙基乙基胺(DIPEA,120μL)溶于15mL DMF中，在20℃下搅拌反应30min。然后将第一步中反应所得的聚合物(250mg)加入反应瓶中，继续在20℃下搅拌反应3天。减压旋干有机溶剂，加入5mL二氯甲烷和5mL三氟乙酸的混合有机溶剂，室温下搅拌反应1h，减压旋蒸除去溶剂，加入25mL水后过滤，滤液在水中透析2天，进一步冷冻干燥得到白色固体即为聚合物3，通过¹H核磁共振比较精氨酸片段的特征峰积分与聚丙烯酰胺的特征峰积分，计算出侧基天然精氨酸修饰的聚甲基丙烯酰胺共聚单元的聚合度10，乳糖酸修饰的甲基聚丙烯酰胺共聚单元的聚合度为5，未被修饰的侧基共聚单元聚合度为13，其化学结构式如下：

其主要化学结构特征如下：

¹H NMR(D₂O):4.10‐4.27(OCHO,乳糖酸)，3.77‐3.67(CHNH₂CH₂，精氨酸)，3.20‐2.79(CH₂NH₂,CH₂NHCOCHNH₂,CH₂NHCOCHCH₂,NHCH₂CH₂)，2.50‐2.30(COCHCH₂，NHCH₂(CH₂)₂),2.10‐0.78(COCHCH₂,(CH₂)₄)

实施例4

本发明实施例1，2中制备所得一类侧基天然精氨酸和乳糖酸协同修饰的聚甲基丙烯酰胺阳离子聚合物采用MTT法和肝癌模型细胞SK-HEP-1进行体外细胞毒性评估，主要试验方法如下：将SK-HEP-1细胞以每孔5×10³个细胞的密度接种于96孔培养板中，每孔加入100μl含有10％FBS的RPMI-1640培养基，然后将该96孔板置于37℃和5％的CO₂下孵育24小时。接着分别加入不同浓度所需质量的侧基天然精氨酸和乳糖酸协同修饰的聚甲基丙烯酰胺阳离子聚合物继续孵育24小时。进一步每孔加入20μL MTT(5mg/mL)溶液孵育2小时，接着每孔加入100μL DMSO溶解生成的甲臢化合物。采用酶标仪(BioTek,ELx800,USA)测定490/630nm处的吸光度值，评价根据本发明制备所得阳离子聚合物的细胞毒性。从附图1中可看出，实施例1，2中制备所得一类侧基天然精氨酸和乳糖酸协同修饰的聚甲基丙烯酰胺阳离子聚合物具有相对较低的细胞毒性，可作为相对安全的基因转染试剂得到应用。

实施例5

采用编码绿色荧光蛋白(EGFP)基因，通过荧光显微镜成像评价侧基天然精氨酸和乳糖酸协同修饰的聚甲基丙烯酰胺阳离子聚合物作为基因载体的细胞转染效率，主要试验方法如下：将SK-HEP-1细胞以每孔5×10⁵个的密度接种于6孔板中，其中每孔加入100μL含有10％FBS的RPMI-1640培养基，将该96孔板于37℃和5％的CO₂条件下孵育24小时。接着加入按不同载体/质粒DNA电荷比(+/-)对应的实施例1制备所得侧基天然精氨酸和乳糖酸协同修饰的聚甲基丙烯酰胺阳离子聚合物1与编码绿色荧光蛋白基因(EGFP)的复合物孵育48小时，以市售转染试剂聚乙烯亚胺bPEI-25k(N/P＝10)为参比，用Nikon Ti-S荧光倒置显微镜在明场和荧光条件下观察和成像，评价基因转染的效率。从附图2中可看出，实施例1中制备所得侧基天然精氨酸和乳糖酸协同修饰的聚甲基丙烯酰胺阳离子聚合物1具有较高的基因转染性能，可以有效的在SK-HEP-1细胞中输送编码绿色荧光蛋白(EGFP)基因。

实施例6

采用实施例1中制备的侧基天然精氨酸和乳糖酸协同修饰的聚甲基丙烯酰胺阳离子聚合物和荧光素酶报告基因Luciferase pDNA，以不同的正负电荷比(+/-)复合，然后转染SK-HEP-1细胞，评价阳离子聚合物载体的基因转染效率，具体试验方法如下：将SK-HEP-1细胞以1×10⁵/孔的密度接种在24孔培养板中，培养到一定密度后，分别加入有血清(10％FBS)和无血清(0％FBS)的培养基，然后再加入按不同正负电荷比的阳离子聚合物载体与Luciferase pDNA所形成的复合物，其中无血清培养实验组在5小时后换为含有血清的培养基，继续在37℃下培养24小时。最后，采用化学发光测试仪评价载体的细胞基因转染效率。从附图3中可看出，实施例1中制备所得侧基天然精氨酸和乳糖酸协同修饰的聚甲基丙烯酰胺阳离子聚合物1具有较高的抗血清转染性能，可在有血清条件下高效、方便的进行基因转染操作。

虽然本发明已将较佳实施例揭示如上，然其并非用以限定本发明的内容，任何熟悉此技艺者，在不脱离本发明的主要精神和内容范围内，当可作各种更动与润饰，因此发明的保护范围应以申请专利的实际权利要求范围为准。