一种胍基功能化石墨烯材料及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种胍基功能化石墨烯材料及其制备方法和应用。通过将氧化石墨烯表面的羧基酰化得到酰氯化石墨烯；然后与烷基二胺反应，得到氨基化石墨烯；最后以甲氧基异脲或其盐作为胍基化试剂，在碱性条件下加热反应，得到胍基功能化石墨烯。借助于胍基与磷酸基之间的特异性相互作用，本发明的胍基修饰石墨烯可作为固相萃取材料应用于磷酸化肽的选择性富集。

说明书

技术领域

本发明涉及一种功能化碳纳米材料，具体涉及一种胍基功能化石墨烯材料，该材料的制 备方法及其在磷酸化肽富集中的应用。

背景技术

蛋白质磷酸化是生命过程中发挥重要作用的翻译后修饰过程，对磷酸化蛋白及其酶解得 到的磷酸化肽的有效检测对于研究蛋白质磷酸化过程及其生物学意义具有十分重要的价值。 然而，含量少、质谱检测灵敏度低以及高丰度非磷酸化肽带来的信号抑制作用等因素，给磷 酸化肽的直接质谱检测带来了很大的困难。因此，通过预先的分离和富集手段来提高磷酸化 肽的检测灵敏度是十分有必要的，而用于富集磷酸化肽的固相萃取材料的开发也受到越来越 多的关注。

目前较为常用的磷酸化肽固相萃取材料包括固定化金属离子亲和色谱(IMAC)材料和金 属氧化物亲和色谱(MOAC)材料。IMAC将高价金属离子通过材料基底表面上键合的螯合 剂固定在材料基底表面上，得到配位不饱和的固定化金属离子，并利用其与磷酸基团的配位 相互作用来吸附磷酸化肽，从而实现对磷酸化肽的萃取分离和富集。但是该方法的缺点是选 择性不高，一些非磷酸化的酸性肽段也同时会被富集出来，并对磷酸化肽的质谱检测造成干 扰。MOAC则利用TiO₂、ZrO₂等金属氧化物与磷酸化肽之间的Lewis酸碱相互作用来萃取并 富集磷酸化肽。但由于材料对多磷酸化肽的吸附力较强，造成多磷酸化肽难于从材料表面解 吸下来并影响其后续的质谱检测，因而MOAC方法在多磷酸化肽的富集检测方面仍存在有一 定的缺陷。

静电吸引是另一种可以应用于磷酸化肽富集的非共价相互作用。将带正电荷的基团修饰 到富集材料基底表面上，可以利用正电基团与带负电荷的磷酸基团之间的静电吸引力来萃取 富集磷酸化肽。文献(C.K.Chang,C.C.Wu,Y.S.Wang and H.C.Chang.Selective extraction  and enrichment of multiphosphorylated peptides using polyarginine-coated diamond  nanoparticles.Analytical Chemistry,2008,80,3791-3797)中报道了将聚精氨酸修饰到预先氧化 的纳米金刚石颗粒表面，并借助于精氨酸上胍基与磷酸化肽上磷酸基团的静电吸引力，将所 制备的聚精氨酸修饰纳米金刚石颗粒作为萃取材料富集多磷酸化肽。但制备该固相萃取材料 所需的原料纳米金刚石颗粒和聚精氨酸成本较高，不利于大规模的应用。同时，该方法仅对 多磷酸化肽具有富集能力，而无法单独应用于单磷酸化肽和多磷酸化肽的同时富集。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于胍基-磷酸基静电相互作用的磷酸化肽固相萃取材料及 相应的磷酸化肽富集方法，能实现对单磷酸肽和多磷酸化肽的同时富集及对多磷酸化肽的选 择性富集。

为了实现上述目的，本发明采取如下的技术方案：

一种胍基功能化石墨烯材料，其特征在于石墨烯基底上修饰有胍基，胍基与石墨烯基底 相连的化学结构如下式所示：

其中G代表石墨烯基底，n为2～8的整数。

所述的胍基功能化石墨烯，其微观结构为直径1～5μm的不规则片状结构，其表面有明显 的褶皱。

所述的胍基功能化石墨烯，其N元素的质量百分含量为5％～15％，n＝6时该含量为 7％～10％。

本发明的胍基功能化石墨烯材料的合成方法，包括以下步骤：

(1)以氧化石墨烯为原料，使用氯化亚砜或三氯氧磷或草酰氯等酰化试剂将氧化石墨烯 表面羧基酰化，得到酰氯化石墨烯，反应式如下：

(2)将步骤(1)得到的酰氯化石墨烯与C2～C8的烷基二胺反应，得到氨基化石墨烯， 反应式如下；

(3)将步骤(2)得到的氨基化石墨烯分散于水中，加入甲氧基异脲或其盐作为胍基化 试剂，调节反应液pH至10～12后加热反应，得到胍基功能化石墨烯，反应式如下：

进一步的，上述步骤(1)酰化反应过程中所使用的酰化试剂为氯化亚砜时，可加入N,N- 二甲基甲酰胺作为酰化反应的催化剂，氯化亚砜与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为20:1～40:1， 酰化反应温度一般为60～80℃，反应时间为24～48小时；当使用三氯氧磷为酰化试剂时，反 应温度可以是50～80℃，反应时间为24～48小时；当使用草酰氯为酰化试剂时，反应温度可 以是20～50℃，反应时间为24～48小时。

优选的，上述步骤(2)氨基化反应是将酰氯化石墨烯投入到C2～C8的烷基二胺溶剂中 加热反应，反应温度为40～65℃，反应时间为24～60小时。

优选的，上述步骤(3)胍基化反应溶液中甲氧基异脲的浓度为0.25～1.5mol/L；甲氧基 异脲盐可以是甲氧基异脲的盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐和/或醋酸盐。

优选的，上述步骤(3)通过加入适量氢氧化钠或氢氧化钾调节反应液的pH为10～12。

优选的，上述步骤(3)胍基化反应的温度为40～70℃，反应时间为24～48小时。

本发明的胍基功能化石墨烯可作为固相萃取材料应用于磷酸化肽的固相萃取。

由此，本发明提供了一种磷酸化肽的固相萃取方法，在含醋酸的乙腈-水缓冲液(优选的， 醋酸浓度为0.05～0.2mol/L，乙腈的体积百分含量为40％～80％)中，使用所述胍基功能化石 墨烯能够同时富集单磷酸化肽和多磷酸化肽；或者，在含三氟乙酸的乙腈-水缓冲液(优选的， 三氟乙酸体积百分含量为0.015％～0.2％，乙腈的体积百分含量为40％～80％)中，使用所述胍 基功能化石墨烯能够选择性地富集多磷酸化肽。

富集完成之后，可以不将材料表面吸附的磷酸化肽洗脱下来，而直接将吸附有磷酸化肽 的材料分散于基质溶液中，利用基质辅助激光解吸离子化质谱进行分析。

本发明借助于胍基与磷酸基之间的特异性相互作用，将胍基修饰到石墨烯基底表面，并 将所得的胍基修饰石墨烯应用于磷酸化肽的选择性富集。所使用的氧化石墨烯修饰基底具有 比表面积大、表面官能团丰富而易于修饰、与基质辅助激光解吸离子化质谱兼容等优势。合 成胍基修饰石墨烯材料所使用的原料易于制备且价格低廉，因而适合于大规模的合成及应用。 同时，在不同的富集条件下，该材料可以实现对单磷酸化肽和多磷酸化肽的同时富集或对多 磷酸化肽的选择性富集，因而可以满足不同的磷酸化肽分析要求。

附图说明

图1为本发明所制备的胍基功能化石墨烯材料的傅里叶变换红外吸收光谱图；

图2为本发明所制备的胍基功能化石墨烯材料的透射电镜照片；

图3为胍基功能化石墨烯材料同时富集脱脂牛奶酶解液中单磷酸化肽和多磷酸化肽的质 谱分析结果；

图4为胍基功能化石墨烯材料选择性富集脱脂牛奶酶解液中多磷酸化肽的质谱分析结果。

具体实施方式

下面结合附图，通过实施例，进一步阐述本发明的技术方案，但是本申请的保护范围不 受这些实施例的具体条件的限制。

实施例1：

胍基功能化石墨烯材料的合成，包括酰化、氨基化、胍基化三个步骤，具体的制备方法 如下：

(1)向100mL圆底烧瓶中加入120mg氧化石墨烯、30mL氯化亚砜和1.5mL N,N-二 甲基甲酰胺，超声使氧化石墨烯在溶液中充分地分散开，然后在70℃下加热搅拌反应24小 时。反应结束后将反应体系自然冷却到室温，离心分离除去反应液，所得沉淀使用干燥的N,N- 二甲基甲酰胺洗涤一次；

(2)步骤(1)所得到的酰化产物直接投入到30mL预先加热融化的己二胺中，55℃下 加热搅拌反应48小时。反应结束后，加入25mL乙醇稀释反应液并使其自然冷却到室温，离 心分离除去己二胺和乙醇的混合溶剂，依次使用水和乙醇洗涤沉淀后，置于真空干燥箱中干 燥；

(3)向100mL圆底烧瓶中加入50mg步骤(2)所得到的氨基化石墨烯、3.0781g甲氧 基异脲硫酸盐和50mL水。超声使氨基化石墨烯充分分散后，加入氢氧化钠调节溶液的pH 至11，然后在60℃下加热搅拌反应24小时。反应结束后自然冷却到室温，加入1.65mL三 氟乙酸终止反应，离心分离除去反应液，依次使用水和乙醇洗涤沉淀，并置于真空干燥箱中 干燥。

所制备的胍基功能化石墨烯的傅里叶变换红外吸收光谱如图1所示，透射电镜照片如图 2所示。该材料中C元素质量百分含量为70.41％，H元素的质量百分含量为3.99％，N元素 质量百分含量为8.60％。

实施例2：

胍基功能化石墨烯材料同时富集脱脂牛奶酶解液中的单磷酸化肽和多磷酸化肽，其具体 步骤如下：

30μL脱脂牛奶与970μL50mmol/L的碳酸氢铵溶液混合后，在14000rpm下离心25min。 取上清液，100℃水浴5min使其中的蛋白质变性，然后加入30μL浓度为1mg/mL的胰蛋白 酶溶液，37℃水浴中酶解20小时，得脱脂牛奶酶解液。将20μL脱脂牛奶酶解液稀释于180μL 含0.1mol/L醋酸的乙腈-水缓冲液(乙腈含量为60％(v/v))中，然后向该脱脂牛奶酶解液稀 释液中加入200μg分散于水中的胍基功能化石墨烯材料(分散液浓度4mg/mL)。旋转混合 30min后，离心分离除去上清液，并用含0.1mol/L醋酸的乙腈-水缓冲液(乙腈含量为60％ (v/v))洗涤材料3次。最后，将吸附有磷酸化肽的材料分散于5μL含有47.5％乙腈(v/v)、 5％磷酸(v/v)、30mg/mL2,5-二羟基苯甲酸的基质溶液中，并使用基质辅助激光解吸离子化- 飞行时间质谱进行检测。

脱脂牛奶酶解液经富集后的质谱图如图3所示，所富集到的磷酸化肽中既有单磷酸化肽， 也有多磷酸化肽。

实施例3：

胍基功能化石墨烯材料选择性富集脱脂牛奶酶解液中的多磷酸化肽，其具体步骤如下：

30μL脱脂牛奶与970μL50mmol/L的碳酸氢铵溶液混合后，在14000rpm下离心25min。 取上清液，100℃水浴5min使其中的蛋白质变性，然后加入30μL浓度为1mg/mL的胰蛋白 酶溶液，37℃水浴中酶解20小时，得脱脂牛奶酶解液。将20μL脱脂牛奶酶解液稀释于含0.05％ 三氟乙酸(v/v)的180μL乙腈-水缓冲液(乙腈含量为66％(v/v))中，然后向该脱脂牛奶酶 解液稀释液中加入200μg分散于水中的胍基功能化石墨烯材料(分散液浓度4mg/mL)。旋 转混合30min后，离心分离除去上清液，并用含0.05％三氟乙酸(v/v)的乙腈-水缓冲液(乙 腈含量为66％(v/v))洗涤材料3次。最后，将吸附有磷酸化肽的材料分散于5μL含有47.5％ 乙腈(v/v)、5％磷酸(v/v)、30mg/mL2,5-二羟基苯甲酸的基质溶液中，并使用基质辅助激 光解吸离子化-飞行时间质谱进行检测。

脱脂牛奶酶解液经富集后的质谱图如图3所示，所富集到的磷酸化肽均为多磷酸化肽。

图3和图4中所富集到的磷酸化肽的信息如表1所示。

表1脱脂牛奶酶解液中检测到的磷酸化肽

注：表中p代表磷酸化修饰，pS表示磷酸化丝氨酸；o代表氧化修饰，oM表示氧化甲硫氨 酸；pyroQ表示焦谷氨酰胺。