一种SIT1突变蛋白及其编码基因与其在植物耐逆性中的应用

摘要

本发明公开了一种SIT1突变蛋白及其编码基因与其在植物耐逆性中的应用。本发明提供了一种蛋白，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列3衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明发现水稻类受体激酶突变基因SIT1

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种SIT1突变蛋白及其编码基因与其在植物 耐逆性中的应用。

背景技术

盐胁迫是目前世界上影响作物产量的最主要的非生物因素。据联合国粮农组织的 不完全统计，我国盐碱地面积占耕地总面积的20％以上，且由于灌溉方式不当及淡水 资源匮乏等原因，这个比例还在不断增长。研究作物耐盐机制对于增加作物种植面积， 提高粮食产量具有非常重要的意义。

植物在遭受外界盐胁迫时，植物会做出一系列的应激反应，目前关于这一方面的 报道主要集中在离子通道及其调控子以及转录因子等基因上，比如朱健康教授实验室 所报道的经典的SOS(Salt Overly Sensitive)系统，大致由三个主要的组成部分SOS1， SOS2，SOS3构成，该系统通过磷酸化的调节植物Na离子的外排。还有另一类经典的 基因家族转运蛋白HKT1，第一HKT蛋白在小麦中被克隆出来发现该基因能够具有选择 性的亲和钠离子和钾离子，但是在拟南芥中AtHKT1却并不像小麦HKT一样具有较高的 离子选择性,而是在参与调节拟南芥地上和地下部分中的钠离子平衡过程中，而在水稻 中鉴定出的OsHKT2.1则是在根中调节了在低钾的情况下的钠离子的摄入发挥作用。而 在转录因子方面科学家们已经鉴定出了许多和盐胁迫相关的各类转录因子,比如一些 锌指蛋白、MYB、AP2/ERF、WRKY和NAC类的转录因子都是报道比较多的调节盐响应 的几大类转录因子，比如Zat12，ZFP179，ZFP182，SNAC1，SNAC2，SERF1等基因。 还有极少数关于植物耐盐性的报道是关于位于细胞表面的负责信号感知的类受体激酶 的比如OsSIK1，Srlk，AtLecRK2，盐胁迫信号经过一系列的中间传递过程，诱导下游 胁迫响应基因表达，使植物产生耐盐反应。植物类受体激酶是植物中最为庞大的基因 家族之一，关于此类基因的研究已成为植物学领域的一个研究热点。植物类受体激酶 蛋白主要由三部分组成：结构多样的胞外结构域，跨膜域和保守的胞内激酶结构域。 根据植物类受体激酶胞外结构域的不同，植物类受体激酶家族被分为多个亚家族。自 从20多年前第一个植物类受体激酶在玉米中被发现以后，越来越多的类受体激酶被克 隆出来，并被证明参与了从植物生长发育到参与逆境反应，如植物的自交不亲和过程， 激素信号的接收和传递，生长发育的调节，抗病反应等植物生长发育的各个方面。

已有结果表明类受体激酶很有可能作为细胞表面的盐胁迫信号的感应分子来发挥 作用。因此，研究植物类受体激酶在植物耐盐反应中的作用，对于阐明植物的抗盐机 制是十分重要的。该基因及其点突变形式的发现以及对其功能的研究对于阐述植物耐 盐性的机理提供了新的线索并对基因工程育种方面提供了新的材料和应用价值。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种SIT1突变蛋白及其编码基因。

本发明的SIT1突变蛋白，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列3衍生的蛋白质。

上述经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基 酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

编码上述蛋白的DNA分子也是本发明保护的范围。

上述DNA分子是如下(1)-(3)中任一种的DNA分子：

(1)编码区为序列表中的序列2所示的DNA分子；

(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码与植物耐逆性相关的蛋白 的DNA分子；

(3)与(1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少 具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％ 或至少具有99％同源性且编码与植物耐逆性相关蛋白的DNA分子。

上述严格条件为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；

含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护 的范围。

上述重组载体为将上述DNA分子插入表达载体中，得到表达上述蛋白的重组载体。

在本发明的实施例中，表达载体为pCAMBIA1300-35S::MH载体，重组载体为将序 列表中序列2所示的核苷酸插入pCAMBIA1300-35S::MH载体的XbaI和BglII双酶切位 点间得到的载体。

pCAMBIA1300-35S::MH载体为将序列5所示的DNA分子插入pCAMBIA1300载体的 BamHI和EcoRI酶切位点得到的载体。

扩增上述DNA分子全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。

上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调 控植物耐逆性中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述耐逆性为耐盐性；

所述调控植物耐逆性为提高植物耐逆性；

所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明提供的方法，为将上述蛋白的DNA分子导入目的植物，获得转基因植物， 所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物。

上述方法中，所述耐逆性为耐盐性；

所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物。

本发明的实验证明，本发明发现水稻类受体激酶突变基因SIT1^KE，其导入植物中 可以提高植物耐盐性，且比野生型SIT1基因的耐盐性高。证明该突变基因具有耐盐性， 为提高农作物抗盐性上提供了重要的理论依据和应用价值。

附图说明

图1为SIT1拟南芥超表达突变体的耐盐性分析图

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、SIT1突变基因SIT1^KE及其过表达载体的构建

1、SIT1基因的获得

提取日本晴水稻叶片RNA，反转录得到cDNA为模板，用引物 5′GCTCTAGATGCGGCGTCCCGAGCTAA3′和5′GAAGATCTCGCTCGAGGAATGTCA3′进行PCR 扩增，得到2034bp的PCR产物，经过测序，具有序列表序列1所示的核苷酸，为SIT1 去除终止密码子的基因。

2、SIT1突变基因SIT1^KE的获得

1)过表达SIT1基因重组载体

pCAMBIA1300-35S::MH载体为将序列5所示的DNA分子插入pCAMBIA1300载体的 BamHI和EcoRI酶切位点得到的载体。

以cDNA作为模板，用5′GCTCTAGATGCGGCGTCCCGAGCTAA3′和 5′GAAGATCTCGCTCGAGGAATGTCA3′进行PCR扩增，得到2034bp的PCR产物，经过测 序，该PCR产物具有序列表序列1自5’末端第1位－2022位核苷酸。

用XbaI和BglII双酶切上述PCR产物，得到的酶切产物与经过同样酶切的 pCAMBIA1300-35S::MH载体连接，得到重组载体pCAMBIA1300-35S::SIT1－7M6H，为 过表达SIT1基因重组载体。

经过测序，该载体为将序列表序列1自5’末端第1位－2022位核苷酸插入 pCAMBIA1300-35S::MH载体的XbaI和BglII酶切位点间得到的载体。

2)SIT1激酶点突变载体

序列1自5’末端第1位-2022位核苷酸为去终止密码子的SIT1。

将此片段利用Gateway方法连入pENTR^TM/SD/D-TOPO载体，得到重组载体 pENTR^TM/SD/D-TOPO-SIT1。

设计SIT1^KE点突变引物，参照Transgene点突变试剂盒方法用重组载体 pENTR^TM/SD/D-TOPO-SIT1生产含SIT1^KE的重组载体。

SIT1^KE点突变引物如下:

5'GTGGAGATTGCAGTGGAGAAGGTATCCCACG3'和

5'CCACTGCAATCTCCACTCGGGATACCAGTA3'

用XbaI和BglII双酶切含SIT1^KE的重组载体，回收2034bp的片段，与经过同样 酶切的载体pCAMBIA1300-35S::MH连接，得到pCAMBIA1300-35S::SIT1^KE-7M6H。经过 测序，该载体为将序列表中序列2所示的核苷酸插入pCAMBIA1300-35S::MH载体的 XbaI和BglII双酶切位点间得到的载体。

序列表中序列2所示的核苷酸为SIT1突变基因SIT1^KE，该基因编码的蛋白SIT1^KE的氨基酸序列为序列表中序列3。

序列表中序列1所示的核苷酸为SIT1基因，该基因编码的蛋白SIT1的氨基酸序 列为序列表中序列4。

SIT1基因的序列1自5’末端第1156-1158位AAG突变为GAG，得到序列2所示 的SIT1^KE；

SIT1蛋白的序列4自N’末端第386位赖氨酸突变为谷氨酸，得到序列3所示的 SIT1^KE。

实施例2、突变基因SIT1^KE在提高植物耐逆性中的应用

1、转SIT1^KE拟南芥的构建

将实施例1得到的重组质粒pCAMBIA1300-35S::SIT1^KE－7M6H转化农杆菌GV3101， 得到含有重组质粒的GV3101(提取质粒测序鉴定，质粒为pCAMBIA1300-35S::SIT1^KE－7M6H)。

拟南芥的遗传转化：把调配好的含有农杆菌的转化介质倒入大小合适的烧杯或广 口罐头瓶中，将已经提前剪过角果和开放花蕾的拟南芥(拟南芥的品种col-0，以下 简称野生型拟南芥)受体植株的整个地上部分都浸没到转化介质中，浸泡5-6min；取 出拟南芥植株，将茎、叶、花上等多余的水珠轻轻抖落，横躺在平整的桌面或凳子上， 等水珠基本干燥后置于干净的塑料盒中，仍然维持横躺的姿势，并用黑色袋子覆盖避 光保温，22℃光照培养室中恢复培养16-36h；揭去黑袋，将拟南芥重新竖直放置，在 22℃光照培养室中正常培养；一般生长2-3周后，角果多数已经饱满，此时尽量少浇 水和营养液，促进种子成熟；种子成熟后，放于1.5ml Ep管中，加入适量干燥剂硅胶， 常温下短期保存，长期保存最好把干燥的种子置于-70℃冰箱，得到T1代转SIT1^KE拟 南芥种子。

提取T1代转SIT1^KE拟南芥叶片基因组DNA，用5’-ATGCGGCGTCCCGAGCTAA-3’和 5’-CGCTCGAGGAATGTCA-3’进行PCR扩增，得到2022bp的为阳性T1代转SIT1^KE拟南 芥。

播种阳性T1代转SIT1^KE拟南芥传代，直到得到T3代转SIT1^KE拟南芥。T3代纯和 植株通过western blot利用c-MYC抗体(sigma)检测SIT1^KE-MYC融合蛋白的表达。

采用同样的方法将pCAMBIA1300-35S::SIT1－7M6H转入拟南芥中，培养直到得 到T3代转SIT1拟南芥。

2、SIT1^KE在提高水稻耐盐性中的应用

将T3代转SIT1^KE拟南芥株系4#、9#在含有100mM NaCl的1/2MS培养基上培养， 以野生型拟南芥Col和T3代转SIT1拟南芥为对照。实验重复3次，结果取平均值。

结果如图1所示，A图为表型图，B图为存活率统计图，其中，SIT1为T3代转 SIT1拟南芥、SIT1^KE9和SIT1^KE4为T3代转SIT1^KE拟南芥株系、col为野生型拟南芥； 可以看出，

在正常条件下，各个株系无显著差异；

在100mM NaCl胁迫下，与野生型拟南芥和T3代转SIT1拟南芥相比，点突变 SIT1^DAT3代转SIT1^KE拟南芥SIT1^KE9和SIT1^KE4均表现出明显的耐盐抗性，转SIT1^KE拟南 芥的存活率(为95％以上)高于野生型植物(约85％)，远远高于T3代转SIT1拟南 芥SIT1。

上述结果表明，SIT1^KE可以提高植物盐性，在植物耐盐性方面发挥正向调节作用。