酪氨酸蛋白激酶JAK2基因中与猪抗蓝耳病相关的SNP标记及其应用

摘要

本发明涉及酪氨酸蛋白激酶JAK2基因中与猪抗蓝耳病相关的SNP标记及其应用，所述与猪抗蓝耳病相关的SNP标记位于猪的酪氨酸蛋白激酶JAK2基因上，所述SNP标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中，该序列的81bp、115bp、151bp和264bp四处碱基分别为T、A、G和A的待测猪为易感蓝耳病猪品种，而这四处碱基分别为C、G、A和T的待测猪为抗蓝耳病猪品种。本发明提供的分子遗传标记不受猪的年龄、性别等限制，可用于抗蓝耳病猪品种的早期选育，甚至在猪刚出生时就可准确地进行筛选，可大大加快抗蓝耳病猪的育种进程；筛选方法准确，操作简单，成本低，效率高。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及酪氨酸 蛋白激酶JAK2基因中与猪抗蓝耳病相关的SNP标记及其应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS），俗称“蓝耳病”是由猪繁殖与呼 吸综合征病毒（PRRSV）引起的，该病毒是巢状病毒目动脉炎病毒科 的一个成员，同属的病毒还有马动脉炎病毒，鼠乳酸脱氢酶酶病毒和 猴出血热病毒。该病主要引起猪的繁殖与呼吸症状，表现为间质性肺 炎和母猪流产木乃伊胎等，每年对全世界的养猪业造成了巨大的经济 损失。2007年在中国爆发了一场高热病，该病迅速在全国范围扩散， 超过200万头猪被感染，40万头猪死亡，该病最后证实是由一种高致 病性的蓝耳病毒引起的。PRRSV主要感染猪的肺泡巨噬细胞，现在研 究表明在感染PRRSV后，先天免疫中PRRSV感染不能引起有效的I型 干扰素应答，体液免疫不能及时产生有效的中和抗体，而且会形成抗 体依赖的病毒增强效应，最终导致免疫抑制和持续感染，由于该病毒 的突变率极高，传统疫苗方法也不能有效控制该病，很多研究都致力 于寻找RNAi，干扰素等新的方法来针对该病毒，用于弥补传统方法 的不足。

由于不同的猪品种和个体的遗传背景差异，对蓝耳病的抗性也不 同，研究表明在临床症状和生理生化指标上，通城猪、梅山猪等国内 猪品种相较于国外长白猪、大白猪等感染高致病性PRRSV后有较强的 抗性。通过高通量测序的方法，对感染PRRSV前后长白猪和通城猪的 组织做差异基因表达分析，某些免疫相关的基因表达量在感染前后四 个品种间有显著的差异。另外，存在一些品种间的SNP位点，这些基 因在宿主的免疫应答中起到了很重要的作用，而且这些SNP位于基因 的外显子中，通过找出不同品种间PRRSV感染造成的基因表达差异， 不仅可以研究PRRSV的感染机制，还可以找出抗性或易感相关的基 因，通过对品种间的SNP进行比较分析，从而筛选出抗性较强的猪。

发明内容

本发明的目的是提供酪氨酸蛋白激酶JAK2基因中与猪抗蓝耳病 相关的SNP标记及其应用。

酪氨酸蛋白激酶JAK2参与细胞生长、发育、分化以及组蛋白修 饰等许多重要的生理过程，在天然免疫和和获得性免疫的信号调节通 路中起到了重要的作用，它可以和II类型受体，如IFN-α、IFN-β、细 胞白介素的受体结合，在信号转到的过程中发挥重要作用，当干扰素 等细胞因子结合到受体上时，JAK随即结合到受体的细胞质末端，随 后磷酸化SATA形成同源或异源二聚体，进入到细胞核里，激活相关 基因的转录。本发明人首次发现在两个不同抗性的猪品种：长白猪（易 感猪）、通城猪（抗病猪）之间的酪氨酸蛋白激酶JAK2基因外显子中 存在四个品种间SNP位点，用常规分子生物学方法检测这四个位点的 碱基类型，可以作为一种检测抗病和易感猪的方法。

为了实现本发明目的，本发明提供一种与猪抗蓝耳病相关的SNP 标记，其位于猪的酪氨酸蛋白激酶JAK2基因上，所述SNP标记的核苷 酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中，该序列的81bp、115bp、151bp和 264bp四处碱基分别为T、A、G和A的待测猪为易感蓝耳病猪品种， 而这四处碱基分别为C、G、A和T的待测猪为抗蓝耳病猪品种。

本发明还提供用于检测与猪抗蓝耳病相关的SNP标记的引物对， 其包括上游引物F：5’-AAGCATGATGAGCCAGCTTT-3’和下游引物 R：5'-CCACTTCCCCAGTGTTGTCT-3'。

本发明还提供与猪抗蓝耳病相关的SNP标记在鉴定抗蓝耳病猪 品种中的应用，其包括步骤：1）提取待测猪样品组织中的总RNA， 反转录成cDNA；2）以步骤1）中的cDNA为模板，F和R为引物，进 行RT-PCR反应；3）分析PCR产物，如果扩增产物序列中81bp、115bp、 151bp和264bp四处的碱基分别为C、G、A和T，则待测猪为抗蓝耳病 猪品种。

反转录PCR的步骤为：

i）打开RNA二级结构

在一支无核酸酶污染的小离心管中加入：

ii）反转录PCR

向上述离心管中加入：

反转录PCR的反应条件为：42℃，60min。

常规PCR使用的扩增体系以15μl计为：

常规PCR的反应条件为：：95℃ 5min；以95℃ 30s，50℃-70℃， 30s-2min；72℃ 30s-2min做35个循环；72℃ 10min，于4℃保温。

本发明还提供含有引物F和R的用于检测抗蓝耳病猪品种的试剂 盒。所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓 冲液中的一种或多种。优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明进一步提供与猪抗蓝耳病相关的SNP标记在猪的分子标 记辅助育种中的应用。

本发明提供了一种基于酪氨酸蛋白激酶JAK2基因中与猪抗蓝耳 病相关的SNP标记筛选抗蓝耳病猪的方法，该方法的优点在于：（一） 本发明提供的分子遗传标记不受猪的年龄、性别等限制，可用于抗蓝 耳病猪品种的早期选育，甚至在猪刚出生时就可准确地进行筛选，可 大大加快抗蓝耳病猪的育种进程；（二）筛选方法准确，操作简单， 成本低，效率高。

附图说明

图1为本发明实施例1中进行常规PCR所使用的扩增程序。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未 特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实 验手册（New York:Gold Spring Harbor Laboratory Press,1989），或按 照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1酪氨酸蛋白激酶JAK2基因中与猪抗蓝耳病相关的SNP 标记筛选抗蓝耳病猪的方法

前期实验通过对6个品种猪（长白猪、大白猪、杜洛克猪、清平 猪、梅山猪、通城猪）感染高致病性蓝耳病毒（PRRSV）进行抗病猪 的筛选，通过临床症状记录：采食量、体温、生理生化、细胞因子以 及存活时间等的检测，最后得到了对蓝耳病抗性差异较大的四个品 种：长白猪（易感猪）、通城猪（抗病猪）。为了研究高致病性蓝耳病 的感染机制和筛选抗性基因，后期实验选取了35日龄抗病猪和易感猪 各16头进行攻毒试验，对感染PRRSV后不同时间点的猪肺转录组进行 了高通量solexa测序，通过分子生物信息学的方法，发现在免疫相关 的酪氨酸蛋白激酶JAK2基因（GenBank登录号为AB036337.1）外显 子中存在四个品种间的SNP位点，在抗性猪品种中这四个位点的单核 苷酸分别是C、G、A和T，而在易感猪中，这四个位点的单核苷酸分 别为T、A、G和A，通过在这四个SNP位点附近设计引物扩增目的片 段，测序检测SNP碱基类型，可得到同样的结果，扩增片段的引物序 列如下：上游引物F：5’-AAGCATGATGAGCCAGCTTT-3’和下游引 物R：5'-CCACTTCCCCAGTGTTGTCT-3'。用该对引物检测待测猪这 四个SNP位点的碱基类型，即可用来筛选抗病猪。

一、总RNA的提取

1.动物组织：取新鲜或-70℃冻存动物组织，每30-50mg组织加 入1ml Trizol，匀浆仪进行匀浆处理。样品体积一般不要超过Trizol体 积的10%。

2.将以上样品在15-30℃放置5分钟，使得核酸蛋白复合物完全分 离。

3.可选步骤：4℃ 12,000rpm(约13,400g)离心10分钟，取上清。

注意：如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节 部分等，可离心去除。

4.向以上溶液中加入氯仿，每使用1ml Trizol加入0.2ml氯仿，盖 好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

5.4℃ 12,000rpm(约13,400g)离心10-15分钟，此时样品分成三层： 黄色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水 相（约500μl）转移到一个新的RNase-Free离心管中。

6.在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20-30 分钟。

7.4℃ 12,000rpm(约13,400g)离心10分钟，弃上清。

8.加入75%乙醇（用RNase-free水配制）洗涤沉淀。每使用1ml Trizol用1ml 75%乙醇对沉淀进行洗涤。

9.4℃5,000rpm(约2,300g)离心3分钟。用枪头小心吸出上层液 体，保留沉淀。

注意：不要吸出沉淀，剩余的少量液体可短暂离心，然后用枪头 吸出，注意不要吸弃沉淀。

10.室温放置2-3分钟，晾干，加入30-100μl RNase-free水，充分 溶解RNA。所得到RNA置-70℃保存。

二、反转录PCR

1.打开RNA二级结构

在一支无核酸酶污染的小离心管中加入：

2．反转录PCR

向上述离心管中加入：

在42℃孵育60分钟进行反应。

三、常规PCR反应

1.按下列反应体系(15μL体系)加样

2.按如图1所述的反应条件进行PCR扩增

四、克隆和测序

1.将PCR产物用E.Z.N.A Gel Extraction Kit胶回收试剂盒回收

2.将回收的产物连接pMD-19T载体（Takara），转化大肠杆菌，获 得阳性克隆，摇菌，测序（上海生工）。酶切、连接、转化操作详细 步骤见《分子克隆》第三版。

五、结果分析

测序结果如SEQ ID NO.1所示，其中，该序列的81bp、115bp、151bp 和264bp四处碱基分别为T、A、G和A的待测猪为易感蓝耳病猪品种， 而这四处碱基分别为C、G、A和T的待测猪为抗蓝耳病猪品种。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。