法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2017-04-19
授权
授权
2014-07-16
实质审查的生效 IPC(主分类):C07K16/00 申请日:20111118
实质审查的生效
2014-06-18
公开
公开
本申请要求2010年11月19日提交的美国临时专利申请No. 61/415,614的优先权。该申请的公开内容通过引用在本文以其整体合 并。
【技术领域】
本发明涉及新人源化的，嵌合和鼠抗体，特别针对人CC趋化因 子配体20(CCL20)。本发明的人源化的抗体特别良好适合作为治疗 炎性和自身免疫疾病的治疗剂。
【背景技术】
免疫系统是身体用于区别非我(例如，外源生物或物质)与自我 的高度复杂的生物-回路。身体中非我的检测可导致发炎，其中各种细 胞和分子组分协作应答由非-我生物或物质导致的潜在地有害事件。尽 管炎性过程辅助保护身体免于外源攻击，免疫系统的去-调节可导致负 面结果诸如自我攻击，例如，自身免疫疾病。通过改变炎性分子诸如 趋化因子的功能，可能减少与免疫/炎性应答相关的病症的起始和进 展。
趋化因子是在发炎中起到中枢作用的小(8～10kDa)蛋白家族。 在炎性过程期间，趋化因子在有害刺激位点局部产生和作为中心起作 用者募集表达它们的同源受体，7跨膜G蛋白-偶联的受体(GPCR) 的免疫细胞。CCL20，替代性地命名的肝和活化-调控的趋化因子 (LARC)，巨噬细胞炎性蛋白-3α(MIP-3α)，或Exodus-1，是由 上皮细胞表达的可溶性趋化因子。上皮角质形成细胞和滑膜-衬细胞已 知在稳态以及炎性和病理学病情诸如癌，银屑病和类风湿性关节炎期 间产生大量CCL20。CCL20的同源受体是CC趋化因子受体6 (CCR6)；CCL20是知道与CCR6相互作用的唯一趋化因子。响应 CCL20信号，具有CCR6的免疫细胞，诸如未成熟的树突细胞(DC)， 效应子/记忆T-细胞，及B细胞，迁移及浸润周围组织，由此活化炎 性级联。
因为CCL20表达在由炎性细胞因子诸如白细胞介素1β(IL-1β) 和肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的发炎中显著地增强，CCL20-CCR6 相互作用被认为在病理学炎性过程中起到作用。
类风湿性关节炎(RA)是最常见的自身免疫疾病之一。RA的第 1迹象常常是滑膜炎，其显现为肿胀的，疼痛关节。尽管尚不知起始 滑膜炎的特定因子，滑膜衬上皮细胞和滑膜成纤维细胞被认为是炎性 反应的主要诱导物。自RA患者的滑液有效化学-吸引人单核细胞和促 -炎性T辅助性17(Th17)细胞，其然后诱导及恶化RA炎性过程。 因为反应性滑膜细胞能产生大量CCL20(特别在IL-1β和TNF-α的 影响下)，而CCR6是Th17细胞的主要受体，CCL20-CCR6相互作 用被认为在炎性过程中起到关键作用。
CCL20-CCR6相互作用也可在特定类型的皮炎中起到重要作用。 银屑病，例如，始于皮肤中的有害银屑病事件(由环境和/或遗传因素 诱导的)之后是Th17细胞的浸润。因为CCR6在Th17细胞，B细胞， 树突细胞和组织损伤效应子T细胞表面表达，CCL20可代表银屑病中 这些细胞类型的主要化学吸引物。CCL20-CCR6相互作用的重要性的 进一步证据可见于使用白细胞介素23(IL-23)-诱导的银屑病小鼠模型 的研究(Hedrick et al.，J.Clin.Invest.119：2317-2329(2009))。在此 模型中，IL-23的注射导致白细胞介素22(IL-22)-依赖性银屑病发炎。 但是，当注射IL-23时Ccr6-/-小鼠未呈现银屑病-样症状，指示CCR6 需要银屑病发展。
人角质形成细胞可产生大量的CCL20，尤其在源于Th17的细胞 因子白细胞介素17(IL-17)，IL-22和TNF-α的影响下。而CCL20 和CCR6在正常皮肤中罕有检测，二者在特应性皮炎和脓疱银屑病中 呈现增加的表达水平。CCL20的强诱导和CCR6+细胞的蓄积可在人 皮炎损伤的显微免疫组织化学分析中观察到。这些观察提供皮炎炎性 过程中CCL20和CCR6的作用的另外的证据。
目前可利用的用于治疗免疫病症的MAb生物制品可粗略分为3 组：免疫刺激细胞因子抑制物(例如，抗-TNF-α MAbs)，免疫细胞 消除物(例如，抗-CD20 MAbs)和附属分子阻断剂(例如.阿巴西普)。 这些生物制品可对于治疗炎性疾病有用；但是，由于主要对这些治疗 的非-应答或应答速度逐渐降低，对具有新作用机理以迎合患，例如， CCL20/CCR6-介导的病症的患者的医学需求的替代性的生物制品有 紧急需求。主题发明的抗体代表该替代性的生物制品。
【发明概述】
本发明涉及中和抗-CCL20抗体，或其抗原结合部分。在特定实 施方式中，抗-CCL20抗体是人源化的抗-人CCL20抗体，其可包含 (CDR)小鼠抗-人CCL20抗体的互补决定区。在一些实施方式中， 抗-CCL20抗体是小鼠或嵌合抗-人CCL20抗体或其抗原结合部分。
在一些实施方式中，抗-CCL20抗体或其抗原结合部分结合于人 CCL20。在一些实施方式中，抗体或部分不结合于人CCL16。
本发明的抗体特异性结合CCL20。在一些实施方式中，抗-CCL20 抗体或其抗原结合部分结合于短尾猴和/或恒河猴CCL20以及人 CCL20。在一些实施方式中，抗-CCL20抗体或其抗原结合部分不结 合于小鼠和/或大鼠CCL20。在一实施方式中，抗-CCL20抗体或抗原 -结合部分结合于人，短尾猴和恒河猴CCL20，但不结合于小鼠和大 鼠CCL20。
在一些实施方式中，抗-CCL20抗体或其抗原结合部分对人 CCL20具有小于下列的结合亲和力(KD)：
●1nM，500pM，100pM，90pM，80M，70pM，60pM或50pM， 使用单价表面等离子体共振测定，或者
●1nM，500pM，100pM，75pM，50pM，25pM，20pM，15pM， 14pM，13pM，12pM，11pM，10pM，9pM，8pM，7pM，6pM或 5pM，使用二价表面等离子体共振测定。
在特定实施方式中，抗体或部分对人CCL20具有大于对人CCR6 的结合亲和力的结合亲和力。
在一些实施方式中，抗-CCL20抗体或其抗原结合部分对人 CCL20具有小于100，90，80，70，60，50，40或30(x105M-1s-1) 的ka，如由二价表面等离子体共振测定。在一些实施方式中，抗-CCL20 抗体或其抗原结合部分对人CCL20具有小于10，9，8，7，6，5，4 或3(x10-5s-1)的kd，如由二价表面等离子体共振测定。
在一些实施方式中，抗-CCL20抗体或其抗原结合部分对恒河猴 CCL20具有小于100，90，80，70，60，50，40或30(x105M-1s-1) 的ka，如由二价表面等离子体共振测定。在一些实施方式中，抗-CCL20 抗体或其抗原结合部分对恒河猴CCL20具有小于50，40，30，20， 10，9，8，7，6，5，4，3或2(x10-5s-1)的kd，如由二价表面等离 子体共振测定。在一些实施方式中，抗-CCL20抗体或其抗原结合部 分对恒河猴CCL20具有小于100，90，80，70，60，50，40，30，20 或10pM的KD，如由二价表面等离子体共振测定。
在一些实施方式中，抗-CCL20抗体或其抗原结合部分对短尾猴 CCL20具有小于500，400，300，200，100，90，80，70，60，50， 40或30(x105M-1s-1)的ka，如由二价表面等离子体共振测定。在一 些实施方式中，抗-CCL20抗体或其抗原结合部分对短尾猴CCL20具 有小于50，40，30，20，19，18，17，16，15，14，13，12，11，10， 9，8，7或6(x10-5s-1)的kd，如由二价表面等离子体共振测定。在 一些实施方式中，抗-CCL20抗体或其抗原结合部分对短尾猴CCL20 具有小于100，90，80，70，60，50，40，30，20，19，18，17，16 或15pM的KD，如由二价表面等离子体共振测定。
在一些实施方式中，抗-CCL20抗体或其抗原结合部分以小于 100，90，80，70，60，50，40，39，38，37，36，35或34pM的EC50结合于人CCL20。在一些实施方式中，抗-CCL20抗体或其抗原结合 部分以小于500，400，300，200，150，140，130，120，110，100， 90，80，70，65，60，59，58，57，56，55，54，53，52，51或50pM 的EC50结合于恒河猴CCL20。在一些实施方式中，抗-CCL20抗体或 其抗原结合部分以小于500，400，350，300，250，200，190，180， 170，160，150，140，130，120，110，109，108，107，106，105， 104，103或102pM的EC50结合于短尾猴CCL20。
在一些实施方式中，抗-CCL20抗体或其抗原结合部分对人 CCL20具有超过其他人趋化因子的选择性，所述其他人趋化因子包括 但不限于CX3CL1，CXCL1，CXCL2，CXCL4，CXCL8，CXCL9， CXCL10，CXCL12，CXCL13，CXCL16，CCL1，CCL2，CCL3， CCL4，CCL5，CCL7，CCL11，CCL13，CCL16，CCL17，CCL19， CCL21，CCL22，CCL24，CCL25，CCL27，CCL28和/或XCL1。 在特定实施方式中，抗-CCL20抗体或抗原-结合部分对人CCL20具 有超过全部所述趋化因子的选择性。
在一些实施方式中，抗-CCL20抗体或其抗原结合部分以小于20， 19，18，17，16，15，14，13，12，11，10，9，8，7，6，5，4，3， 2，1.7，1.6，1.5，1.4，1.3，1.2或1.1nM的IC50减小人或小鼠CCR6+ 细胞的人CCL20-诱导的趋化性。在特定实施方式中，抗-CCL20抗体 或其抗原结合部分以小于1.7，1.6，1.5，1.4，1.3，1.2或1.1nM的IC50减小人或小鼠CCR6+细胞的人CCL20-诱导的趋化性。在一些实施方 式中，抗-CCL20抗体或其抗原结合部分以小于45，40，35，30，25， 20，19，18，17，16，15，14，13，12，11，10，9，8，7，6，5.5， 5.4，5.3，5.2，5.1，4.9，4.8，4.7或4.6nM的IC90减小人或小鼠CCR6+ 细胞的人CCL20-诱导的趋化性。在特定实施方式中，抗-CCL20抗体 或其抗原结合部分以小于6，5.5，5.4，5.3，5.2，5.1，4.9，4.8，4.7 或4.6nM的IC90减小人或小鼠CCR6+细胞的人CCL20-诱导的趋化 性。在一些实施方式中，抗-CCL20抗体或其抗原结合部分以小于70， 65，60，55，50，45，40，35，30，25，20，15，10，9，8或7nM 的IC95减小人或小鼠CCR6+细胞的人CCL20-诱导的趋化性。在特定 实施方式中，抗-CCL20抗体或其抗原结合部分以小于10，9.9，9.8， 9.7，9.6，9.5，9.4，9.3，9.2，9.1或9nM的IC95减小人或小鼠CCR6+ 细胞的人CCL20-诱导的趋化性。
在一些实施方式中，抗-CCL20抗体或其抗原结合部分体外减小 人或小鼠CCR6+细胞的人CCL20-诱导的趋化性。
在一些实施方式中，抗-CCL20抗体或其抗原结合部分体内减小 人或小鼠CCR6+细胞的人CCL20-诱导的趋化性。
在一些实施方式中，抗-CCL20抗体或其抗原结合部分在受试者 中，例如，在胶原-诱导的关节炎(CIA)和/或葡萄糖-6-磷酸异构酶 (G6PI)-诱导的关节炎小鼠模型中减少关节炎症状(诸如肘或膝远端的 骨端关节损伤及红斑及肿胀程度)进展。在一些实施方式中，抗体或 其抗原结合部分减少受试者中的骨损伤，包括骨质疏松症，骨侵蚀和/ 或新骨形成，例如，.在CIA模型中。在一些实施方式中，抗体或抗原- 结合部分减少受试者中的软骨寡聚体基质蛋白(COMP)血清水平， 例如，在CIA模型中。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分减 少受试者中，例如，CIA模型中的小鼠爪中核因子κB配体(RANKL) 的受体活化物，核因子κB(RANK)的受体活化物，酒石酸盐抗性酸 性磷酸酶(TRAP)，和/或组织蛋白酶K的mRNA水平。在一些实 施方式中，抗体或其抗原结合部分减少特应性皮炎症状(例如，干燥， 尺度，红斑，渗出/结痂和/或抓痕)受试者中，例如，NC/Nga株小鼠 中噁唑酮-诱导的特应性皮炎的症状。在一些实施方式中，抗体或抗原 -结合部分减少受试者中过敏性接触性皮炎症状，例如，小鼠模型中二 硝基氟苯(DNFB)-诱导的过敏性接触性皮炎的症状。
在一些实施方式中，抗-CCL20抗体或其抗原结合部分包含重链， 其CDR3(H-CDR3)包含SEQ ID NO：67或68的序列。
在一些实施方式中，抗-CCL20抗体或其抗原结合部分包含轻链， 其CDR3(L-CDR3)包含SEQ ID NO：75的序列。
在特定实施方式中，抗-CCL20抗体或其抗原结合部分包含 H-CDR3，其序列包含SEQ ID NO：67和L-CDR3，其序列包含SEQ ID NO：75；或H-CDR3，其序列包含SEQ ID NO：68和L-CDR3，其序 列包含SEQ ID NO：75。
在一些实施方式中，抗-CCL20抗体或其抗原结合部分包含重链， 其CDR1(H-CDR1)，CDR2(H-CDR2)和CDR3(H-CDR3)分 别包含下列序列：
●SEQ ID NO：60，63和67；
●SEQ ID NO：60，64和67；
●SEQ ID NO：61，65和68；
●SEQ ID NO：77，79和67；或者
●SEQ ID NO：78，80和68。
在一些实施方式中，抗-CCL20抗体或其抗原结合部分包含轻链， 其CDR1(L-CDR1)，CDR2(L-CDR2)和CDR3(L-CDR3)分别 包含下列序列：
●SEQ ID NO：70，73和75；或者
●SEQ ID NO：71，73和75。
在一些实施方式中，抗-CCL20抗体或其抗原结合部分包含：
●H-CDR1，其包含选自下列的序列：SEQ ID NO：60～62，77 和78；
●H-CDR2，其包含选自下列的序列：SEQ ID NO：63-66和79-81；
●H-CDR3，其包含SEQ ID NO：67或68的序列；
●L-CDR1，其包含选自下列的序列：SEQ ID NO：70～72；
●L-CDR2，其包含SEQ ID NO：73或74的序列；或者
●L-CDR3，其包含SEQ ID NO：75；
或其任何组合。
在特定实施方式中，抗-CCL20抗体或其抗原结合部分包含 H-CDR1，H-CDR2，H-CDR3，L-CDR1，L-CDR2和L-CDR3，其 分别包含下列序列：
●SEQ ID NO：60，63，67，70，73和75；
●SEQ ID NO：60，64，67，70，73和75；
●SEQ ID NO：61，65，68，70，73和75；
●SEQ ID NO：77，79，67，70，73和75；
●SEQ ID NO：78，80，68，70，73和75；
●SEQ ID NO：60，63，67，71，73和75；
●SEQ ID NO：60，64，67，71，73和75；
●SEQ ID NO：61，65，68，71，73和75；
●SEQ ID NO：77，79，67，71，73和75；或者
●SEQ ID NO：78，80，68，71，73和75。
在一些实施方式中，抗-CCL20抗体或其抗原结合部分包含重链 可变结构域，所述重链可变结构域包含选自下列的序列：SEQ ID NO： 9～14。在一些实施方式中，抗-CCL20抗体或其抗原结合部分包含重 链可变结构域，所述重链可变结构域包含选自下列的序列：SEQ ID NO：39，41和43。
在一些实施方式中，抗-CCL20抗体或其抗原结合部分包含轻链 可变结构域，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO：15或16的序列。 在一些实施方式中，抗-CCL20抗体或其抗原结合部分包含轻链可变 结构域，所述轻链可变结构域包含选自下列的序列：SEQ ID NO：40， 42和44。
在特定实施方式中，抗-CCL20抗体或其抗原结合部分包含重链 可变结构域和轻链可变结构域，其分别包含下列序列：
●SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：15；
●SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：15；
●SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：15；
●SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：15；
●SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：15；
●SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15；
●SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：16；
●SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：16；
●SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：16；
●SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：16；
●SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：16；或者
●SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16。
在特定实施方式中，抗-CCL20抗体或其抗原结合部分包含重链 可变结构域和轻链可变结构域，其分别包含下列序列：
●SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40；
●SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：42；
●SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：44；
●SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：40；
●SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42；
●SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：44；
●SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：40；
●SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：42；或者
●SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44。
在一些实施方式中，抗-CCL20抗体或其抗原结合部分包含重链， 所述重链具有选自下列的序列：无信号序列(如果存在)，及任选地 无C-端赖氨酸的SEQ ID NO：1～6和108。在一些实施方式中，抗 -CCL20抗体或其抗原结合部分包含轻链，所述轻链具有选自下列的 序列：无信号序列(如果存在)的SEQ ID NO：7，8，110和112。在 特定实施方式中，抗-CCL20抗体包含重链和轻链，其分别具有下列 序列：
●SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：7；
●SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：7；
●SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：7；
●SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：7；
●SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7；
●SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7；
●SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：8；
●SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：8；
●SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：8；
●SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：8；
●SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：8；
●SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8；
●SEQ ID NO：108和SEQ ID NO：110；或者
●SEQ ID NO：108和112；
所述序列无信号序列，SEQ ID NO：1-6和108任选地无C-端赖 氨酸。
本发明也提供抗-CCL20抗体或其抗原结合部分，其包含由选自 下列的序列编码的重链可变结构域：SEQ ID NO：25～30。在一些实 施方式中，抗-CCL20抗体或其抗原结合部分包含由选自下列的序列 编码的重链可变结构域：SEQ ID NO：51，53和55。
而且，本发明提供抗-CCL20抗体或其抗原结合部分，其包含由 SEQ ID NO：31或32的序列编码的轻链可变结构域。在一些实施方式 中，抗-CCL20抗体或其抗原结合部分包含由选自下列的序列编码的 轻链可变结构域：SEQ ID NO：52，54和56。
在特定实施方式中，抗-CCL20抗体或其抗原结合部分包含重链 可变结构域和轻链可变结构域，其分别由下列序列编码：
●SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：31；
●SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：31；
●SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：31；
●SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：31；
●SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：31；
●SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31；
●SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：32；
●SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：32；
●SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：32；
●SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：32；
●SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：32；或者
●SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：32。
在特定实施方式中，抗-CCL20抗体或其抗原结合部分包含重链 可变结构域和轻链可变结构域，其分别由下列序列编码：
●SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52；
●SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：54；
●SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：56；
●SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：52；
●SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54；
●SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：56；
●SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：52；
●SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：54；或者
●SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56。
在一些实施方式中，抗-CCL20抗体或其抗原结合部分包含由选 自下列的序列编码的重链：SEQ ID NO：17～22和109，所述序列缺 少编码信号序列(如果存在)的序列和任选地缺少编码C-端赖氨酸的 序列。在一些实施方式中，抗-CCL20抗体或其抗原结合部分包含由 选自下列的序列编码的轻链：SEQ ID NO：23，24，111和113，所述 序列缺少编码信号序列(如果存在)的序列。在特定实施方式中，抗 -CCL20抗体包含重链和轻链，其分别由下列序列编码：
●SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：23；
●SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：23；
●SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：23；
●SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：23；
●SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：23；
●SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23；
●SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：24；
●SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：24；
●SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：24；
●SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：24；
●SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：24；
●SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：24；
●SEQ ID NO：109和SEQ ID NO：111；或者
●SEQ ID NO：109和SEQ ID NO：113；
所述序列缺少编码信号序列(如果存在)的序列，SEQ ID NO： 17～22和109任选地缺少编码C-端赖氨酸的序列。
在一些实施方式中，将抗-CCL20抗体或其抗原结合部分人源化 或嵌合。在一些实施方式中，人源化的抗-CCL20抗体或部分的重链 框架区利用IGHV1-46*03人种系基因(见，例如，Altschul等人， ″Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs″，Nucleic Acids Res.25：3389-3402(1997))。 在特定实施方式中，重链框架区与IGHV1-46*03人种系基因的框架区 具有至少50％同源性。例如，重链框架区可为至少50％，至少60％， 至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％， 或甚至100％同一于IGHV1-46*03人种系基因的框架区。在一些实施 方式中，人源化的抗-CCL20抗体或部分的轻链框架区利用 IGKV1D-39*01人种系基因(见Altschul等人，见上)。在特定实施 方式中，轻链框架区与IGKV1D-39*01人种系基因的框架区具有至少 50％同源性。例如，轻链框架区可为至少50％，至少60％，至少70％， 至少80％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％，或甚至100％ 同一于IGKV1D-39*01人种系基因的框架区。
在一些实施方式中，抗-CCL20抗体或其抗原结合部分(至所述 部分包含至少重链恒定区的部分的程度)是IgG，IgM，IgE，IgA， 或IgD分子。在特定实施方式中，抗-CCL20抗体或其抗原结合部分 具有IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型。
在一些实施方式中，抗-CCL20抗体是单克隆抗体。
本发明也提供抗-CCL20抗体或其抗原结合部分，其结合位于分 子的N-环和/或β2-β3发夹区的人CCL20的表位。在一些实施方式中， 所述抗-CCL20抗体或部分与本文所述的抗体或部分结合于人CCL20 的相同的表位。而且，本发明提供与本文所述的抗体或部分竞争或交 叉-竞争结合人CCL20的抗-CCL20抗体或其抗原结合部分。
在一些实施方式中，由本发明的抗体或其抗原结合部分结合的人 CCL20表位包含一个或更多选自下列的氨基酸序列：
●SEQ ID NO：84的残基7～9；
●SEQ ID NO：84的残基10～19；
●SEQ ID NO：84的残基20～21；以及
●SEQ ID NO：84的残基20～22，
或对应于SEQ ID NO：84的所述残基的野生型人CCL20的残基。
在一些实施方式中，所述人CCL20表位还包含一个或更多选自 下列的氨基酸序列：
●SEQ ID NO：84的残基39～55；
●SEQ ID NO：84的残基39～57；
●SEQ ID NO：84的残基56～67；以及
●SEQ ID NO：84的残基61～70，
或对应于SEQ ID NO：84的所述残基的野生型人CCL20的残基。
在特定实施方式中，所述人CCL20表位包含由SEQ ID NO：84 的残基7～9，10～19，20～22，39～55，56～57和61～70，或对应 于SEQ ID NO：84的所述残基的野生型人CCL20的残基组成的氨基 酸序列的任何组合。
在特定实施方式中，所述人CCL20表位包含SEQ ID NO：84的 残基7～9，10～19和20～22，或对应于SEQ ID NO：84的所述残基 的野生型人CCL20的残基。在特定实施方式中，所述人CCL20表位 包含SEQ ID NO：84的残基7～9，10～19，20～22，39～55，56～57 和61～70，或对应于SEQ ID NO：84的所述残基的野生型人CCL20 的残基。在特定实施方式中，所述人CCL20表位包含SEQ ID NO：84 的残基7～9，10～19，20～22，39～57和61～70，或对应于SEQ ID NO：84的所述残基的野生型人CCL20的残基。
在特定实施方式中，所述人CCL20表位包含SEQ ID NO：84的 残基7～9，10～19和20～21，或对应于SEQ ID NO：84的所述残基 的野生型人CCL20的残基。在特定实施方式中，所述人CCL20表位 包含SEQ ID NO：84的残基7～9，10～19，20～21，39～55，56～67 和61～70，或对应于SEQ ID NO：84的所述残基的野生型人CCL20 的残基。在特定实施方式中，所述人CCL20表位包含SEQ ID NO：84 的残基7～9，10～19，20～21，39～57和61～70，或对应于SEQ ID NO：84的所述残基的野生型人CCL20的残基。
在一些实施方式中，由抗体或其抗原结合部分结合的人CCL20 表位包含SEQ ID NO：84的一个或更多氨基酸残基(或对应于SEQ ID NO：84的所述残基的野生型人CCL20的残基)，其选自残基7，8， 9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，39，40， 41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55， 56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69和70， 或其任何组合。
本发明也提供本文所述的抗-CCL20抗体的任何抗原-结合部分。 所述抗原-结合部分可为，例如，单链抗体，Fv，Fab，Fab’，F(ab’)2， Fd，单链Fv分子(scFv)，双特异性单链Fv二聚体，多价单链Fv 多聚体，双抗体，结构域-删除的抗体，或单结构域抗体(dAb)。
本发明也提供本文所述的抗体或抗原-结合部分的变体，其中所述 变体不同于抗体或部分1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个氨基酸取 代。
一方面，本发明提供针对人CCL20的抗体，其中所述抗体的重 链可变结构域和轻链可变结构域分别包含下列序列：
●SEQ ID NO：9和15；
●SEQ ID NO：9和16；
●SEQ ID NO：10和16；
●SEQ ID NO：11和15；
●SEQ ID NO：11和16；
●SEQ ID NO：12和16；
●SEQ ID NO：13和16；或者
●SEQ ID NO：14和16。
一方面，本发明提供抗体，其重链包含SEQ ID NO：1和其轻链 包含SEQ ID NO：7，其中所述氨基酸序列缺乏信号序列。
在另一方面，本发明提供抗体，其重链包含无C-端赖氨酸的SEQ ID NO：1和其轻链包含SEQ ID NO：7，其中所述氨基酸序列缺乏信 号序列。
一方面，本发明提供抗体，其重链包含SEQ ID NO：1和其轻链 包含SEQ ID NO：8，其中所述氨基酸序列缺乏信号序列。
在另一方面，本发明提供抗体，其重链包含无C-端赖氨酸的SEQ ID NO：1和其轻链包含SEQ ID NO：8，其中所述氨基酸序列缺乏信 号序列。
一方面，本发明提供抗体，其重链包含SEQ ID NO：2和其轻链 包含SEQ ID NO：8，其中所述氨基酸序列缺乏信号序列。
在另一方面，本发明提供抗体，其重链包含无C-端赖氨酸的SEQ ID NO：2和其轻链包含SEQ ID NO：8，其中所述氨基酸序列缺乏信 号序列。
一方面，本发明提供抗体，其重链包含SEQ ID NO：3和其轻链 包含SEQ ID NO：7，其中所述氨基酸序列缺乏信号序列。
在另一方面，本发明提供抗体，其重链包含无C-端赖氨酸的SEQ ID NO：3和其轻链包含SEQ ID NO：7，其中所述氨基酸序列缺乏信 号序列。
一方面，本发明提供抗体，其重链包含SEQ ID NO：3和其轻链 包含SEQ ID NO：8，其中所述氨基酸序列缺乏信号序列。
在另一方面，本发明提供抗体，其重链包含无C-端赖氨酸的SEQ ID NO：3和其轻链包含SEQ ID NO：8，其中所述氨基酸序列缺乏信 号序列。
一方面，本发明提供抗体，其重链包含SEQ ID NO：4和其轻链 包含SEQ ID NO：8，其中所述氨基酸序列缺乏信号序列。
在另一方面，本发明提供抗体，其重链包含无C-端赖氨酸的SEQ ID NO：4和其轻链包含SEQ ID NO：8，其中所述氨基酸序列缺乏信 号序列。
一方面，本发明提供抗体，其重链包含SEQ ID NO：5和其轻链 包含SEQ ID NO：8，其中所述氨基酸序列缺乏信号序列。
在另一方面，本发明提供抗体，其重链包含无C-端赖氨酸的SEQ ID NO：5和其轻链包含SEQ ID NO：8，其中所述氨基酸序列缺乏信 号序列。
一方面，本发明提供抗体，其重链包含SEQ ID NO：6和其轻链 包含SEQ ID NO：8，其中所述氨基酸序列缺乏信号序列。
在另一方面，本发明提供抗体，其重链包含无C-端赖氨酸的SEQ ID NO：6和其轻链包含SEQ ID NO：8，其中所述氨基酸序列缺乏信 号序列。
一方面，本发明提供抗体，其重链包含SEQ ID NO：108和其轻 链包含SEQ ID NO：110。
在另一方面，本发明提供抗体，其重链包含无C-端赖氨酸的SEQ ID NO：108和其轻链包含SEQ ID NO：110。
一方面，本发明提供抗体，其重链包含SEQ ID NO：108和其轻 链包含SEQ ID NO：112。
在另一方面，本发明提供抗体，其重链包含无C-端赖氨酸的SEQ ID NO：108和其轻链包含SEQ ID NO：112。
在另一方面，本发明提供一个或更多核酸分子，例如，分离的核 酸分子，其编码重链或其抗原结合部分或轻链或其抗原结合部分，其 中所述重链和轻链或其抗原结合部分可结合形成抗-CCL20抗体或其 抗原结合部分。在一些实施方式中，编码重链或其抗原结合部分的核 酸分子包含选自下列的核苷酸序列：SEQ ID NO：17～22，25-30和 109，或无编码信号序列的序列的所述核苷酸序列，如果存在所述信号 序列。SEQ ID NO：17～22和109的核苷酸序列也可任选地缺乏编码 C-端赖氨酸的序列，如果存在。在一些实施方式中，编码轻链或其抗 原结合部分的核酸分子包含选自下列的核苷酸序列：SEQ ID NO：23， 24，31，32，111和113，或无编码信号序列的序列的所述核苷酸序列， 如果存在所述信号序列。在一些实施方式中，一个或更多核酸分子编 码本文所述的抗体或部分的重链或其抗原结合部分和轻链或其抗原结 合部分。在特定实施方式中，一个核酸分子编码所述重链或其抗原结 合部分及所述轻链或其抗原结合部分。
在一实施方式中，编码重链或其抗原结合部分的核酸分子，编码 轻链或其抗原结合部分的核酸分子，或编码重链和轻链或其抗原结合 部分的核酸分子，用于治疗有需求的受试者。
在另一方面，本发明提供载体，其包含编码本文所述的抗体或部 分的重链或其抗原结合部分，轻链或其抗原结合部分，或二者的核酸 序列。
在另一方面，本发明提供细胞，其表达本文所述的抗体或部分的 重链或其抗原结合部分，轻链或其抗原结合部分，或二者。
在另一方面，本发明提供制造本文所述的抗体或部分的方法，包 括维持本文所述的细胞在适合于所述抗体或部分表达的条件下。在一 些实施方式中，方法包括分离抗体或部分的步骤。
本发明也提供产生分泌抗-CCL20抗体的杂交瘤的方法。在特定 实施方式中，杂交瘤产生结合野生型人CCL20的抗体。本发明也提 供由本发明的方法产生的杂交瘤。任选地，将由杂交瘤分泌的单克隆 抗体收集及可进一步纯化(例如，基本上纯化的，分离的)。在其他实 施方式中，方法还包括测定由杂交瘤分泌的单克隆抗体的核苷酸序列。
在另一方面，本发明提供组合物，其包含本文所述的抗体或部分 及药学可接受的媒质或载体。
一方面，本文所述的抗体或部分用作药物。在特定实施方式中， 本文所述的抗体或部分用于治疗有需求的受试者。在特定实施方式中， 抗体或部分用于治疗CCR6-关联的病情，CCL20关联的病情或二者。 该病情包括但不限于炎性和自身免疫疾病，特别关节炎，尤其类风湿 性关节炎，特应性或过敏性皮炎，及银屑病。在另一特定实施方式中， 抗体或部分用于治疗癌。抗体或部分可用于治疗，例如，Grave氏病， 白癜风，甲状腺功能亢进，类风湿性关节炎，银屑病，特应性皮炎， 接触性皮炎，克罗恩病，炎性肠疾病，B细胞恶性肿瘤，乳腺腺癌， 慢性肝炎，接触性皮炎，成胶质细胞瘤，肝细胞癌，子宫颈的人乳头 瘤病毒感染，蕈样真菌病，胰腺腺癌，牙周疾病，甲状腺乳头癌，掌 跖脓疱病，与斑丘疹相关的病情，大疱性表皮松解，斑秃，多发性硬 化，多发性肌炎，皮肌炎，Behcet氏病，急性泛发性发疹性脓疱病， 血管炎，青少年特发性关节炎，结节病，支气管哮喘，过敏性鼻炎， 肾同种异体移植排斥，移植物抗宿主病，肝同种异体移植排斥，慢性 阻塞性肺部疾病，囊性纤维化，肾小球肾炎，呼吸道合胞体病毒感染， 多发性骨髓瘤和/或郎格尔汉斯细胞组织细胞增多症。
在一些实施方式中，抗-CCL20抗体或部分用于减少有需求的受 试者中CCR6+细胞的CCL20-介导的趋化性。
在一些实施方式中，本发明提供：
1.单克隆抗-人CCL20抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包 含重链，其互补决定区3(CDR3)包含SEQ ID NO：67或68。
2.实施方式1的单克隆抗体或抗原-结合部分，其中所述重链的 互补决定区1(CDR1)，互补决定区2(CDR2)，及互补决定区3 (CDR3)分别包含选自下列的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO：60，64和67；
(b)SEQ ID NO：60，63和67；
(c)SEQ ID NO：61，65和68；
(d)SEQ ID NO：77，79和67；以及
(e)SEQ ID NO：78，80和68。
3.单克隆抗-人CCL20抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包 含轻链，其互补决定区3(CDR3)包含SEQ ID NO：75。
4.实施方式3的单克隆抗体或抗原-结合部分，其中所述轻链的 互补决定区1(CDR1)，互补决定区2(CDR2)，及互补决定区3 (CDR3)分别包含选自下列的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO：70，73和75；以及
(b)SEQ ID NO：71，73和75。
5.实施方式1或3的抗体或抗原-结合部分，其中所述抗体的重 链包含CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO：67或68和所述抗体的 轻链包含CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO：75。
6.实施方式2或4的抗体或抗原-结合部分，其中所述重链CDR1， CDR2和CDR3及所述轻链CDR1，CDR2和CDR3分别包含选自下 列的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO：60，64，67，70，73和75；
(b)SEQ ID NO：60，64，67，71，73和75；
(c)SEQ ID NO：60，63，67，70，73和75；
(d)SEQ ID NO：60，63，67，71，73和75；
(e)SEQ ID NO：61，65，68，70，73和75；
(f)SEQ ID NO：61，65，68，71，73和75；
(g)SEQ ID NO：77，79，67，70，73和75；
(h)SEQ ID NO：77，79，67，71，73和75；
(i)SEQ ID NO：78，80，68，70，73和75；以及
(j)SEQ ID NO：78，80，68，71，73和75。
7.单克隆抗-人CCL20抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包 含重链，其可变结构域包含选自SEQ ID NO：9～14的氨基酸序列。
8.单克隆抗-人CCL20抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包 含轻链，其可变结构域包含SEQ ID NO：15或16。
9.实施方式7或8的抗体或抗原-结合部分，其中所述重链可变 结构域及所述轻链可变结构域分别包含选自下列的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO：9和15；
(b)SEQ ID NO：9和16；
(c)SEQ ID NO：10和16；
(d)SEQ ID NO：11和15；
(e)SEQ ID NO：11和16；
(f)SEQ ID NO：12和16；
(g)SEQ ID NO：13和16；以及
(h)SEQ ID NO：14和16。
10.单克隆抗-人CCL20抗体，其重链包含选自下列的氨基酸序 列：无信号序列的SEQ ID NO：1～6和SEQ ID NO：108。
11.单克隆抗-人CCL20抗体，其重链包含选自下列的氨基酸序 列：无信号序列的SEQ ID NO：1～6和SEQ ID NO：108，其中所述 氨基酸序列缺乏C-端赖氨酸。
12.单克隆抗-人CCL20抗体，其轻链包含选自下列的氨基酸序 列：无信号序列的SEQ ID NO：7和8和SEQ ID NO：110和112。
13.实施方式10～12之任一项的抗体，其中所述重链及所述轻链 分别包含选自下列的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO：1和7；
(b)SEQ ID NO：1和8；
(c)SEQ ID NO：2和8；
(d)SEQ ID NO：3和7；
(e)SEQ ID NO：3和8；
(f)SEQ ID NO：4和8；
(g)SEQ ID NO：5和8；
(h)SEQ ID NO：6和8；
(i)SEQ ID NO：108和110；以及
(j)SEQ ID NO：108和112；
其中所述氨基酸序列缺乏信号序列，如果存在所述信号序列，且
其中SEQ ID NO：1～6任选地缺乏C-端赖氨酸。
14.单克隆抗体，其重链包含SEQ ID NO：108和其轻链包含SEQ ID NO：110。
15.单克隆抗体，其重链包含无C-端赖氨酸的SEQ ID NO：108 和其轻链包含SEQ ID NO：110。
16.单克隆抗体，其重链包含SEQ ID NO：108和其轻链包含SEQ ID NO：112。
17.单克隆抗体，其重链包含无C-端赖氨酸的SEQ ID NO：108 和其轻链包含SEQ ID NO：112。
18.单克隆抗-人CCL20抗体，或其抗原结合部分，其与实施方 式1～17之任一项的单克隆抗体或抗原-结合部分结合人CCL20的相 同的表位。
19.单克隆抗-人CCL20抗体，或其抗原结合部分，其与实施方 式1～17之任一项的单克隆抗体或抗原-结合部分竞争结合人CCL20。
20.单克隆抗-人CCL20抗体，或其抗原结合部分，其与实施方 式1～17之任一项的单克隆抗体或抗原-结合部分交叉-竞争结合人 CCL20。
21.实施方式1～12之任一项的单克隆抗体或抗原-结合部分，其 中抗体是人源化的抗体。
22.实施方式1～6之任一项的单克隆抗体或抗原-结合部分，其 中所述重链的框架区利用IGHV1-46*03人种系序列，且其中所述轻链 的框架区利用IGKV1D-39*01人种系序列。
23.实施方式1～9和18～22之任一项的单克隆抗体，其中所述 抗体包含人IgG1，IgG2，IgG3或IgG4恒定区。
24.单克隆抗-人CCL20抗体，或其抗原结合部分，其重链包含 可变结构域，所述可变结构域包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：39，41和43。
25.单克隆抗-人CCL20抗体，或其抗原结合部分，其轻链包含 可变结构域，所述可变结构域包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：40，42和44。
26.实施方式24或25的抗体或抗原-结合部分，其中所述重链包 含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：39，41和43且其中所述轻链 包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：40，42和44。
27.实施方式26的抗体，其中所述重链及所述轻链分别包含选自 下列的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO：39和40；
(b)SEQ ID NO：41和42；以及
(c)SEQ ID NO：43和44。
28.单克隆抗-人CCL20抗体，或其抗原结合部分，其中所述抗 体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO：39和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO：40。
29.实施方式24～28之任一项的单克隆抗体或抗原-结合部分， 其中所述抗体是嵌合抗体。
30.实施方式1～9，18～22和24～28之任一项的抗原-结合部分， 其中所述部分是单链抗体，Fv，Fab，Fab’，F(ab’)2，Fd，单链Fv 分子(scFv)，双特异性单链Fv二聚体，双抗体，结构域-删除的抗 体或单结构域抗体(dAb)。
31.实施方式1～30之任一项的单克隆抗体或抗原-结合部分，其 中所述抗体或抗原-结合部分具有一个或更多选自下列的性质：
(a)不结合于人CCL16；
(b)结合于短尾猴或恒河猴CCL20，但不结合于小鼠或大鼠 CCL20；
(c)使用单价表面等离子体共振测定对人CCL20具有70pM或 更小的结合亲和力；
(d)使用二价表面等离子体共振测定对人CCL20具有12pM或 更小的结合亲和力；
(e)对人CCL20具有大于对人CCR6的结合亲和力的结合亲和 力；
(f)对人CCL20具有超过对下列的选择性：人CX3CL1，CXCL1， CXCL2，CXCL4，CXCL8，CXCL9，CXCL10，CXCL12，CXCL13， CXCL16，CCL1，CCL2，CCL3，CCL4，CCL5，CCL7，CCL11， CCL13，CCL16，CCL17，CCL19，CCL21，CCL22，CCL24，CCL25， CCL27，CCL28或XCL1；
(g)以1.7nM或更小的IC50减小CCR6+细胞的人CCL20-诱导 的趋化性；
(h)体内减小CCR6+细胞的人CCL20-诱导的趋化性；
(i)体外减小CCR6+细胞的人CCL20-诱导的趋化性；
(j)减小受试者中关节炎症状的进展；
(k)减少受试者中的骨质疏松症，骨侵蚀或新骨形成；
(l)减小受试者中的软骨寡聚体基质蛋白(COMP)血清水平；
(m)减小受试者中RANKL，RANK，TRAP或组织蛋白酶K 的mRNA水平；
(n)减小受试者中特应性皮炎的进展；以及
(o)减小受试者中过敏性接触性皮炎的进展。
32.单克隆抗-人CCL20抗体，或其抗原结合部分，其结合人 CCL20的表位，所述人CCL20的表位包含一个或更多选自下列的氨 基酸序列：
(a)SEQ ID NO：84的残基7～9；
(b)SEQ ID NO：84的残基10～19；以及
(c)SEQ ID NO：84的残基20～22。
33.实施方式32的单克隆抗体或抗原-结合部分，其中所述表位 包含SEQ ID NO：84的残基7～9，10～19和20～22。
34.实施方式32的单克隆抗体或抗原-结合部分，其中所述表位 还包含一个或更多选自下列的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO：84的残基39-55；
(b)SEQ ID NO：84的残基56～67；以及
(c)SEQ ID NO：84的残基61～70。
35.实施方式34的单克隆抗体或抗原-结合部分，其中所述表位 包含SEQ ID NO：84的残基7～9，10～19，20～22，39～55，56～67 和61～70。
36.分离的核酸分子，其编码实施方式1～35之任一项的抗体或 部分的重链或其抗原结合部分。
37.分离的核酸分子，其编码实施方式1～35之任一项的抗体或 部分的轻链或其抗原结合部分。
38.分离的核酸分子，其编码实施方式1～35之任一项的抗体或 部分的重链或其抗原结合部分，及轻链或其抗原结合部分。
39.分离的核酸分子，其编码单克隆抗-人CCL20抗体的重链或 其抗原结合部分，其中所述核酸分子包含选自下列的核苷酸序列：SEQ ID NO：17～22，25-30和109，或无编码信号序列的序列的所述核苷 酸序列，如果存在所述信号序列。
40.编码单克隆抗-人CCL20抗体的轻链或其抗原结合部分的分 离的核酸分子，其中所述核酸分子包含选自下列的核苷酸序列：SEQ ID NO：23，24，31，32，111和113，或无编码信号序列的序列的所 述核苷酸序列，如果存在所述信号序列。
41.实施方式39或40的分离的核酸分子，其中所述核酸分子包 含选自下列的核苷酸序列：SEQ ID NO：17～22，25-30和109，或无 编码信号序列的序列的所述核苷酸序列，如果存在所述信号序列；且 其中所述核酸分子还包含选自下列的核苷酸序列：SEQ ID NO：23， 24，31，32，111和113，或无编码信号序列的序列的所述核苷酸序列， 如果存在所述信号序列。
42.(1)编码实施方式1～35之任一项的抗体或部分的重链或其 抗原结合部分的核酸序列，(2)编码实施方式1～35之任一项的抗体 或部分的轻链或其抗原结合部分的核酸序列，或(3)二者作为药物的 用途。
43.重组载体，其包含(1)编码实施方式1～35之任一项的抗体 或部分的重链或其抗原结合部分的核酸序列，(2)编码实施方式1～ 35之任一项的抗体或部分的轻链或其抗原结合部分的核酸序列，或 (3)二者。
44.宿主细胞，其包含第1核酸序列，其编码实施方式1～35之 任一项的抗体或部分的重链或其抗原结合部分，所述第1核酸序列可 操作地连接于表达控制元件，及第2核酸序列，其编码所述抗体或部 分的轻链或其抗原结合部分，所述第2核酸序列可操作地连接于表达 控制元件。
45.制造抗-人CCL20抗体或其抗原结合部分的方法，包括维持 实施方式44的宿主细胞在适合于所述抗体或部分表达的条件下。
46.实施方式45的方法，还包括分离抗体或部分。
47.组合物，其包含实施方式1～35之任一项的单克隆抗体或抗 原-结合部分和药学可接受的媒质或载体。
48.治疗有需求的受试者的方法，包括给受试者施用有效量的实 施方式1～35之任一项的抗体或抗原-结合部分或实施方式47的组合 物。
49.治疗有需求的受试者中的病情的方法，包括给受试者施用有 效量的实施方式1～35之任一项的抗体或抗原-结合部分或实施方式 47的组合物。
50.实施方式49的方法，其中所述病情是CCR6-关联的病情。
51.实施方式49的方法，其中所述病情是自身免疫或炎性病情。
52.实施方式49的方法，其中所述病情是类风湿性关节炎，银屑 病，特应性皮炎，接触性皮炎，克罗恩病，炎性肠疾病，Grave氏病， 白癜风，甲状腺功能亢进，慢性肝炎，子宫颈的人乳头瘤病毒感染， 蕈样真菌病，骨质疏松症或牙周疾病。
53.治疗癌的方法，包括给受试者施用有效量的实施方式1～35 之任一项的抗体或抗原-结合部分或实施方式47的组合物。
54.实施方式53的方法，其中所述癌是B细胞恶性肿瘤，乳腺 腺癌，成胶质细胞瘤，肝细胞癌，胰腺腺癌或甲状腺乳头癌。
55.减小有需求的受试者中的CCR6+细胞的CCL20-介导的趋化 性的方法，包括给受试者施用实施方式1～35之任一项的抗体或抗原- 结合部分或实施方式47的组合物。
56.体外减小CCR6+细胞的CCL20-介导的趋化性的方法，使用 实施方式1～35之任一项的抗体或抗原-结合部分或实施方式47的组 合物。
57.治疗受试者中的病情的方法，包括给受试者施用实施方式1～ 35之任一项的抗体或抗原-结合部分或实施方式47的组合物，其中所 述病情选自：
(a)肘或膝远端的骨端关节损伤；
(b)红斑；
(c)肿胀；
(d)增加的软骨寡聚体基质蛋白(COMP)血清水平；
(e)增加的核因子κB配体(RANKL)的受体活化物，核因子κB (RANK)的受体活化物，酒石酸盐抗性酸性磷酸酶(TRAP)，或 组织蛋白酶K的mRNA水平；
(f)特应性皮炎；以及
(g)过敏性接触性皮炎。
58.实施方式1～35之任一项的抗体或抗原-结合部分或实施方式 47的组合物用于制备药物的用途。
59.实施方式1～35之任一项的抗体或抗原-结合部分或实施方式 47的组合物作为药物的用途。
【附图说明】
图1是显示相比野生型小鼠CCR6缺陷小鼠欠敏感于胶原-诱导的 关节炎的图。野生型，CCR6+/+小鼠；Het，CCR6+/-小鼠；敲除，CCR6-/-小鼠。见实施例1。
图2是图显示相比野生型小鼠，CCR6缺陷小鼠在胶原-诱导的关 节炎损伤中呈现T-细胞的损伤的浸润(如由CD3水平指示)。数据 显示的是自一个实验(n＝7小鼠/组)的平均值±SEM。*p＜0.05， **p＜0.01。见实施例1。
图3是图显示相比野生型小鼠，CCR6缺陷小鼠在胶原-诱导的关 节炎损伤中呈现巨噬细胞的损伤的浸润(如由F4/80水平指示)。数 据显示的是自一个实验(n＝7小鼠/组)的平均值±SEM。**p＜0.01。 见实施例1。
图4是图显示在二硝基氟苯(DNFB)-诱导的过敏性接触性皮炎模 型中，相比野生型小鼠，CCR6缺陷小鼠抵抗增加的耳厚度。WT，野 生型小鼠；KO，CCR6缺陷小鼠。见实施例1。
图5是图显示2F5-5MAb抑制CCL20-诱导的趋化性。见实施例 2。
图6A～C描绘本发明的抗体的可变结构域(SEQ ID NO：9～16) 与小鼠抗-人抗体36F7C10(VH：SEQ ID NO：39；VL：SEQ ID NO：40) 和42G5B10(VH：SEQ ID NO：43)的那些及与种系序列IGHV1-46*03 (SEQ ID NO：57)，JH4(SEQ ID NO：58)和IGKV1D-39*01(SEQ ID NO：59)的序列比对。指示各CDR的Kabat和Chothia定义。 ABM67212(SEQ ID NO：82)和BAH04867.1(SEQ ID NO：83)是 显示的人源化的抗体链的框架区所来源的人抗体。见实施例3。
图7A～C是描绘由人源化的抗-人CCL20抗体链的不同组合抑制 体外趋化性的表。数据表示3次试验，除了其中指示的之外。见实施 例4。
图8A～C描绘实施以评定人源化的HC2/LK3抗-人CCL20抗体 的抑制性效应的3个独立试验。HC2/LK3抗体显示抑制CCL20-诱导 的趋化性。对各实验显示IC50，IC90和IC95值。见实施例4。
图9A～C描绘一系列图显示，在经内皮迁移测定中人源化的抗体 B)HC2/LK3和C)HC2/LC3展示与A)小鼠抗体36F7C10可比较的细 胞迁移的剂量依赖性抑制。见实施例4。
图10A和B描绘BiacoreTM感观图，其展示，A)HC2/LC3和B) HC2/LK3人源化的抗体以浓度-依赖性方式结合于人CCL20。见实施 例5。
图11A～D展示抗-人CCL20抗体特异性结合于人CCL20。用板 -结合的CCL20和其他趋化因子(以1μg/ml)的ELISA测定用于检 测A)36F7C10和嵌合抗体，及B)人源化的HC2LK3和HC2LC3抗 体的结合。(C)用His-标签锚定的CCL20的ELISA测定用于检测 结合。(D)BiacoreTM实验确认抗-人CCL20抗体结合于人CCL20， 及呈现可忽略的结合于CXCL4。见实施例6。
图12显示CCL20(SEQ ID NO：114)和CCL16(SEQ ID NO：115) 的a56-残基重叠部分之间的氨基酸序列比对。见实施例6。
图13A和B是显示与CCL20特别反应及与CCL16不反应的A) 嵌合和B)人源化的抗-人CCL20抗体的一系列图。见实施例6。
图14显示人(SEQ ID NO：85)，恒河猴(SEQ ID NO：86)， 短尾猴(SEQ ID NO：87)和小鼠(SEQ ID NO：88)CCL20直系同 原物之间的氨基酸序列比对。见实施例7。
图15是ELISA测定中抗-人CCL20抗体检测的示意图。见实施 例7。
图16A～C描绘展示有效结合人，恒河猴和短尾猴CCL20，但不 结合于小鼠CCL20的A)嵌合和B)，C)人源化的抗-人CCL20抗体的 一系列图。见实施例7。
图17A和B描绘展示有效结合人，恒河猴和短尾猴CCL20，但 不结合于大鼠或小鼠CCL20的人源化的及嵌合抗-人CCL20抗体的 图。B)人源化的及A)嵌合抗体保留它们所来源的A)小鼠抗体36F7C10 的结合特异性。见实施例7。
图18A和B显示由氢/氘交换人CCL20的表位标位的结果。此实 验利用了自R&D Systems的人CCL20(SEQ ID NO：84)的变体，其 中第2～最后残基是显示于野生型序列中的D代替N。(A)在4个 时间点(自上：150s，500s，1500s和5000s)指示CCL20的各残基的 氘化水平。(B)人CCL20的结构，指示由本发明的抗体结合的表位。 见实施例9。
图19是展示小鼠CCR6-转导的B300细胞向小鼠和人CCL20迁 移的一对图。见实施例10。
图20是显示小鼠，嵌合及人源化的抗-人CCL20抗体以剂量-依 赖性样式抑制小鼠T-细胞向人CCL20体内迁移的图。见实施例10。
图21是显示仓鼠抗-小鼠CCL 20 MAb 2F5-5减少小鼠中胶原- 诱导的关节炎症状的图。见实施例11。
图22是展示2F5-5 MAb减少胶原-诱导的关节炎症状的进展的 个体动物临床分值表。见实施例11。
图23是描绘由X-射线评分对小鼠爪分级的图。2F5-5 MAb显示 减少患胶原-诱导的关节炎的小鼠中的骨病理学。cont：对照IgG。见 实施例11。
图24描绘指示患胶原-诱导的关节炎的小鼠爪中骨病理学的评分 的X-射线的例。O：骨质疏松症，E：骨侵蚀，N：新骨形成。见实施 例11。
图25A～C显示胶原-诱导的关节炎小鼠模型中软骨破坏，血清软 骨寡聚体基质蛋白(COMP)的标记物的测量。(A)用COMP标准 的校准数据。X轴，单元/l；Y轴，在450nm处光密度。(B)对用仓 鼠对照IgG或2F5-5MAb处理的小鼠时平板模板和原始数据。(C) 自个体动物的数据展示相比用对照IgG抗体处理的动物，用2F5-5 MAb处理的动物中减少的COMP水平。见实施例11。
图26是显示2F5-5MAb降低小鼠中COMP的血清水平的图。 Ctrl IgG：同种型-匹配的抗体；CCL20 mAb：2F5-5MAb。见实施例 11。
图27A和B是显示2F5-5MAb减少破骨细胞标记物A)RANKL 和RANK，及B)TRAP和组织蛋白酶K的mRNA表达的图。Ctrl IgG： 同种型-匹配的抗体；CCL20mAb：2F5-5MAb；Y轴：定量PCR单 元。见实施例11。
图28是图显示在小鼠中2F5-5MAb对葡萄糖-6-磷酸异构酶-诱导 的关节炎具有预防效应。见实施例12。
图29是显示在小鼠中2F5-5MAb抑制噁唑酮-诱导的特应性皮炎 的进展的图。见实施例13。
图30是显示在小鼠中2F5-5MAb抑制二硝基氟苯-诱导的过敏性 接触性皮炎的图(如由耳厚度测量)。见实施例14。
【发明详述】
本发明针对特异性结合CCL20或其部分(例如，其抗原性部分) 的抗体。本发明也针对所述抗体的抗原-结合部分。在一实施方式中， 抗体中和CCL20的一个或更多活性。抗体被说成特异性结合CCL20， 如果其不基本上结合于非-CCL20分子。实质性结合是，例如，以≤ 100nM，优选≤10nM，1nM，100pM，50pM，40pM或35pM的KD结合，如由BiacoreTM(二价形式)测定。在一实施方式中，抗体或部 分特异性结合人CCL20或其部分，人CCL20的一些序列变体诸如等 位基因变体，及也可与自其他物种的CCL20交叉-反应。在一实施方 式中，抗体或部分对野生型(也被称为天然存在的或内源性)人CCL20 具有结合特异性。除非另外指示，“人CCL20”指称野生型人CCL20。 有信号序列的野生型人CCL20的氨基酸序列显示于图14(SEQ ID NO： 85)。无信号序列的野生型人CCL20的氨基酸序列(SEQ ID NO：85 的残基1-26)见于SEQ ID NO：99(见表18)。图18描绘无信号序 列的人CCL20的变体(SEQ ID NO：84)其中，最后一个的下一残基 是D代替N，如在野生型序列(SEQ ID NO：85)中。在一些实施方 式中，抗体或部分结合于野生型人CCL20，或人CCL20，其中最后 一个的下一残基是显示于野生型序列的D代替N，有或无信号序列的 序列(例如，SEQ ID NO：84，85或99)。在特定实施方式中，抗体或 部分特异性结合人，恒河猴和短尾猴CCL20但不结合于小鼠或大鼠 CCL20。
本文所述的抗体和其抗原结合部分可通过使用知道的技术纯化和 /或分离。纯化的”或“分离的”的抗体或部分是已自它们所来源(例如， 细胞上清液；混合物诸如库中抗体混合物；等)的分子(例如，肽)分 离出的，及包括由本文所述的方法或其他适合的方法获得的抗体。分 离的抗体包括基本上纯的(例如，基本上纯的)抗体，以及由化学合成， 重组技术和其组合产生的抗体。
更特别是，本发明涉及抗-人CCL20抗体，抗体的抗原-结合部分 (即，部分)，抗体的轻链，抗体重链，及这些轻链或重链的部分。 本发明也涉及缺少重和/或轻链信号序列的抗体及糖基化的抗体。本发 明也涉及前体抗体，非糖基化的抗体和，其重和/或轻链包含信号序列 的抗体。本发明也涉及编码本文所述的任何抗体重链和/或轻链，或其 部分的核酸分子；包含该核酸的载体和宿主细胞；产生任何本文所述 的抗体重和/或轻链或其部分的方法；及使用抗体，抗体链，或部分的 方法。
本发明的抗体和其抗原结合部分可用于治疗有需求的受试者(例 如，人患者)以根据需要减少CCL20结合于CCR6，CCL20-介导的 发炎和/或CCR6+细胞的CCL20-介导的趋化性。
本发明的抗体包括包含2个重链和2个轻链的传统抗体。在一些 实施方式中，一个或更多重和/或轻链包含可变结构域(在本文也称为 “可变区”)和恒定区(在本文也称为“恒定区”)。完全可变结构域， 当存在时，包含4个框架区(FR)和3个互补决定区(CDR)，自氨 基末端，以FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4的顺序 排列。可实施视觉检查和序列分析以鉴定CDR边界。对于本发明， CDR序列通过使用Kabat系统(Kabat，E.A.et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，U.S.Government Printing Office(1991)) 和/或Chothia系统(Chothia&Lesk，Canonical Structures for the Hypervariable Regions of Immunoglobulins，J.Mol.Biol.196：901-917 (1987))定义，例如，在图6中显示。
包含人重链恒定区的本发明的实施方式可包含任何同种型的人恒 定区，包括IgG，IgM，IgA，IgD和IgE，其中重链分别具有γ(γ)， μ(μ)，α(α)，δ(δ)或ε(ε)类型，和任何亚类包括IgG1，IgG2， IgG3，IgG4，IgA1和IgA2，其中重链分别具有γ1，γ2，γ3，γ4，α1 和α2类型。包含人轻链的实施方式可包含人κ(κ)或人λ(λ)轻链。
如本文所用，术语“抗体”指称完全抗体(包含2个全长重链和2 个全长轻链)。术语″抗原-结合片段″在本文与术语“抗原-结合部分” 互换使用，除非另外指示。抗体的抗原-结合部分可为下列形式，例如， 单链抗体，Fv片段，Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，Fd片段， 单链Fv分子(scFv)，双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09665)， 双抗体，结构域-删除的抗体和单结构域抗体(dAbs)。见，例如，Jespers 等人，Nature Biotechnology 22(9)：1161-1165(2004))。也在本发明 之内的是包含VH和/或VL的抗原-结合分子。在VH的情况中，分子 也可包含一个或更多CH1，铰链，CH2和CH3区。
抗体部分可由酶促切割或由重组技术产生。例如，木瓜蛋白酶或 胃蛋白酶切割可用于分别产生Fab或F(ab’)2片段。抗体也可使用已 在天然的停止位点上游导入一个或更多终止密码子的抗体基因以各种 截短的形式产生。例如，编码F(ab’)2片段重链的重组体构建体可设计 为包括编码重链的CH1结构域和铰链区的DNA序列。
在另一实施方式中，可制造包含本发明的全部或部分抗-CCL20 抗体的连接于另一多肽的融合抗体或免疫粘附素的。在一实施方式中， 仅将抗-CCL20抗体的可变结构域连接到多肽。在另一实施方式中， 将抗-CCL20抗体的VH结构域连接到第1多肽，而将抗-CCL20抗体 的VL结构域连接到第2多肽，其与第1多肽以使得VH和VL结构域 可与另一个相互作用而形成抗原结合位点的方式关联。在仍另一实施 方式中，VH结构域由接头从VL结构域分离，使得VH和VL结构域可 与另一个相互作用(见下文单链抗体)。VH-接头-VL抗体然后连接到 目标多肽。此外，可制造将2个(或更多)单链抗体连接到另一个的 融合抗体，以在单多肽链上建造二价或多价抗体，或建造双特异性抗 体。
为了建造本发明的单链抗体，将编码VH-及VL的DNA片段可操 作地连接到编码柔性的接头，例如，编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另 一片段，使得VH和VL序列可作为VL和VH结构域由柔性的接头接合 的连续的单链蛋白表达。见，例如，Bird等人，Science 242：423-426 (1988)；Huston et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883(1988)； McCafferty et al.，Nature 348：552-554(1990)；等。在一些实施方式 中，单链抗体是单价(仅使用单VH和VL)，二价(使用2个VH和 VL)，或多价(使用多于2个VH和VL)。本发明也涵盖特异性结合 人CCL20及另一分子的双特异性或多价抗体。
在其他实施方式中，其他修饰的抗体可通过使用编码抗-CCL20 抗体的核酸分子制备。例如，“κ体”(Ill et al.，Protein Eng.10：949-57 (1997))，“小抗体”(Martin等人，EMBO J.13：5303-9(1994))，“双 特异性抗体”(Holliger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448 (1993))，或“Janusins”(Traunecker et al.，EMBO J.10：3655-3659 (1991)and Traunecker et al.，Int.J.Cancer(Suppl.)7：51-52(1992)) 可通过使用标准分子生物学技术根据说明书的教导制备。
在另一方面，本发明提供在本文例示的抗体的变体，或所述变体 抗体的抗原-结合部分，其中所述变体抗体特异性结合于人CCL20， 但与例示的抗体在序列上不同1，2，3，4，5，6，7，8，9，10个或 更多氨基酸取代(例如，在CDR区，FR区，和/或恒定区中)。根据 本发明，变体抗体可为至少80％，至少85％，至少90％，至少91％， 至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％ 至少98％或至少99％同一于以重链，重链可变结构域，轻链，轻链可 变结构域，6个CDR，或8个FR的参照抗体。
如本文所用，多肽的序列相似性，也称为序列同一性，一般通过 使用序列分析软件测量，其使用对各种取代，缺失和其他修饰，包括 保守性氨基酸取代分配的相似性量度匹配类似序列。例如，遗传学计 算机组(GCG)序列分析套装含有程序诸如“Gap”和“Bestfit”，其可 使用默认参数测定紧密相关的多肽，诸如自不同生物物种的同源多肽 之间或野生型蛋白和其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。见， 例如，GCG 6.1版。多肽序列也可用FASTA，GCG 6.1版中的程序， 使用默认或建议的参数比较。FASTA(例如，FASTA2和FASTA3) 提供查询和搜索序列之间的最佳重叠区的比对和百分率序列同一性 (Pearson，Methods Enzymol.183：63-98(1990)；Pearson，Methods Mol.Biol.132：185-219(2000))。当比较本发明的序列与含有大量的 自不同生物的序列的数据库时使用的另一算法是计算机程序BLAST， 尤其blastp或tblastn，使用默认参数。见，例如，Altschul et al.，J.Mol. Biol.215：403-410(1990)；Altschul et al.，Nucleic Acids Res. 25：3389-402(1997)；在本文通过引用合并。
根据本发明，可将抗体中的一个或更多半胱氨酸，其可为化学反 应性的，变化为另一残基，诸如，无限制地，丙氨酸或丝氨酸。在一 实施方式中，取代非-规范半胱氨酸。可在可变结构域的CDR或框架 区或抗体恒定区中制造取代。在一些实施方式中，半胱氨酸是规范的。 在一些实施方式中，移出抗体的潜在蛋白水解位点。该位点可发生在 可变结构域的CDR或框架区或抗体恒定区中。半胱氨酸残基的取代 和蛋白水解位点的移出可降低抗体产物的异质性的风险由此增加其同 质性。在一些实施方式中，通过改变一个或二个残基消除形成潜在脱 酰胺位点的天冬酰胺-甘氨酸对。在一些实施方式中，将抗体去免疫以 减少其免疫原性。减少抗体免疫原性的技术为本领域所熟知。见，例 如，PCT公开No.WO 98/52976和WO 00/34317。
在一些实施方式中，与本发明的例示的抗体相比抗体具有一个或 更多保守性氨基酸取代。“保守性氨基酸取代”是氨基酸残基被具有具 有类似化学性质(例如，电荷或疏水性)的侧链R基的另一氨基酸残 基取代的取代。一般而言，保守性氨基酸取代基本上不会变化蛋白的 功能性质。在2个或更多氨基酸序列由保守性取代而彼此不同的情况 中，百分率序列同一性或相似性程度可向上调整以校正取代的保守性 性质。制造此调节的方法为本领域技术人员所熟知。见例如，Pearson， Methods Mol.Biol.243：307-31(1994)。
具有类似化学性质的侧链的氨基酸组的例包括1)脂肪族侧链：甘 氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂肪族-羟基侧链： 丝氨酸和苏氨酸；(3)含有酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4) 芳族侧链：苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸，精 氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；及(7)含有硫 的侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸取代组是：缬氨 酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬 氨酸，谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守性取代是 在Gonnet等人，Science 256：1443-45(1992).A“moderately conservative”replacement is any change having a nonnegative value in the PAM250 log-likelihood matrix中公开的PAM250对数-似然性 矩阵中具有正值的任何变化。
在特定实施方式中，本发明的抗体或抗原-结合部分的氨基酸取代 是：(1)减小蛋白水解的感受性，(2)减小氧化的感受性，(3)为 形成蛋白复合物改变结合亲和力，例如，增强抗体的ADCC和CDC 活性，(4)赋予或修饰该类似物的其他物理化学或功能性质，但仍保 留特异性结合于人CCL20，(5)移出C-端赖氨酸，及(6)添加或 移出糖基化位点的那些。
一方面，本发明提供是本发明的抗体的重或轻链，或含有重或轻 链的可变结构域的部分的新和新多肽。该多肽是有用的，因为其可分 别与轻或重抗体链偶联而形成抗-CCL20抗体。
在本文描述的是包含新小鼠抗-人CCL20抗体的CDR，及所述人 源化的抗体的抗原-结合部分的新人源化的中和抗-CCL20抗体。本文 所用的术语“人源化的抗-CCL20抗体”指称包含非-人来源的抗 -CCL20抗体，在本文也称为供体抗体(例如，小鼠抗-CCL20抗体) 的一个或更多CDR(CDR1，CDR2和CDR3)，及自人序列的至少部 分的抗体。人抗体部分可为一个或更多框架区(例如，全部框架区)， 和/或全部或部分恒定区。在一些实施方式中，人序列框架区包含种系 序列，但可包括非-种系突变。非-人抗-CCL20抗体的6个CDR移植 进人框架的CDR-移植的抗-CCL20抗体是本发明的人源化的抗 -CCL20抗体的一例。见，例如，Cabilly等人，美国专利No.4,816,567； Cabilly等人，欧洲专利No.0,125,023B1；Boss等人，美国专利No. 4,816,397；Boss等人，欧洲专利No.0,120,694B1；Neuberger，M.S. 等人，WO 86/01533；Neuberger，M.S.等人，欧洲专利No.0,194,276 B1；Winter，美国专利No.5,225,539；Winter，欧洲专利No.0,239,400 B1；Padlan，E.A.等人，欧洲专利申请No.0,519,596A1。也见，Ladner 等人，美国专利No.4,946,778；Huston，美国专利No.5,476,786；及 Bird等人，科学242：423-426(1988))。在一些实施方式中，人源化 的抗体是去-免疫的抗体。见，例如，Carr等人，美国专利No.7,264,806， 认为去-免疫的抗体已修饰为减少潜在T-细胞表位数，由此减少施用 给人后抗体引发免疫应答的倾向。
在特定实施方式中，人源化的抗体包含一种或更多以下鼠单克隆 抗-人CCL20抗体的一个或更多轻链CDR和/或一个或更多重链 CDR：36F7C10，42G5B10和40-1C10B9，其中CDR根据Kabat系 统，Chothia系统，或其任何组合鉴定。在一些实施方式中，人源化 的抗体包含抗体36F7C10，42G5B10或40-1C10B9的全部3个重链 CDR和全部3个轻链CDR。
在另一实施方式中，人源化的抗体具有本发明的鼠抗-人CCL20 抗体的结合特异性(例如，特异于人CCL20，相同的或类似表位特异 性)和/或具有中和活性。人源化的抗体可具有本文所述的鼠，嵌合或 人源化的抗-人CCL20抗体的结合特异性，表位特异性和/或中和活性。 例如，本发明的人源化的抗体可与鼠，嵌合或人源化的抗-人CCL20 抗体为结合人CCL20而竞争，和/或其可具有鼠，嵌合或人源化的抗- 人CCL20抗体的中和功能。在特定实施方式中，人源化的抗体具有 小鼠抗体36F7C10，42G5B10和40-1C10B9中的任何一种的结合特异 性，表位特异性和/或中和活性。
人源化的抗体的人序列部分(例如，框架区；恒定区)可来自任 何适合的人抗体。例如，人源化的或嵌合抗体中的人恒定区或其部分 可由人κ或λ轻链基因，和/或由人γ(例如，γ1，γ2，γ3，γ4)，μ，α(例 如，α1，α2)，δ或ε重链基因，包括等位基因变体编码。可选择特定 人恒定区同种型(例如，IgG1；IgG2)，变体或其部分以修饰效应子功 能。例如，可将突变的恒定区(即，变体)合入抗体以减少结合Fc受 体和/或固定补体的能力。(见例如，Winter等人，GB 2,209,757B； Morrison等人，WO 89/07142；Morgan等人，WO 94/29351)。
如本文所用，术语“种系”指称随它们经生殖细胞自亲本传代到后 代的抗体基因和基因段时核苷酸序列和氨基酸序列。此种系序列区别 于编码B细胞中的特定抗体的核苷酸序列，其已在亲和性成熟过程期 间通过重组和超突变事件而改变。“利用”特定种系的抗体相比其他种 系序列，具有与种系核苷酸序列或与其所特定的氨基酸序列最接近地 对齐的核苷酸或氨基酸序列。该抗体可由相比种系序列是突变的序列 编码或包含相比种系序列是突变的序列。
在一些实施方式中，人框架与种系序列具有最小变异，例如，小 于3，4，5，6，7，8，9或10个受体框架残基已被取代以改善抗体的 一种或更多性质。在一些实施方式中，受体框架残基用供体框架残基 取代，例如，以改善结合亲和力(见，例如，Queen等人，美国专利No. 5,530,101)。在特定实施方式中，人源化的抗体链框架中的有限数量 的氨基酸(例如，1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个氨基酸)选择为与在供 体序列中，而非受体序列中，的那些位置的氨基酸相同(即，“回复突 变”)以增加包含人CCL20的人源化的抗体链的亲和性。
人框架区(例如，重和/或轻链可变区的)优选获自或源于与供体 抗体的抗原-结合区(例如，鼠抗-CCL20抗体)的类似或相当的区(例 如，重或轻链可变区)具有序列相似性的人种系序列。人源化的抗体 的人序列部分的框架区的其他源包括人可变区共有序列(见例如， Kettleborough等人，蛋白Engineering 4：773-783(1991)；Carter等 人，WO 94/04679；Carter美国专利No.6,407,213))。例如，可将用来 获得非人部分的抗体的供体序列区(例如，可变区序列)与描述于 Kabat，E.A.等人Sequences of Proteins of Immunological Interest， Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，U.S. Government Printing Office(1991)的人序列比较，以选择特定人源化 的抗体的人部分的来源，例如，框架区的来源。
在一实施方式中，人源化的抗体链的框架区获自或源于与非人供 体的可变区具有至少约50％，至少约55％，至少约60％，至少约65％， 至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％ 或至少约95％总体序列同一性的人Ig可变区。在特定实施方式中， 人源化的抗体链的框架区获自或源于与非人供体抗体的可变区的框架 区具有至少约50％，至少约55％，至少约60％，至少约65％，至少 约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，或 至少约95％总体序列同一性的人可变区框架区。
在一实施方式中，人源化的抗体的至少一个框架区(FR)获自或 源于人序列的一个或更多链。由此，FR可包括获自或源于一个或更 多人序列抗体(例如，自人抗体链，自人共有序列)的FR1和/或FR2 和/或FR3和/或FR4。
本领域技术人员会同意，在一些情况中，侧接鼠抗-CCL20抗体 的一个或更多CDR的残基可对于功能(例如，结合)直接或间接贡献， 及在一些情况中，可为必要。因此，在一些实施方式中，侧接鼠框架 的一个或更多CDR(例如，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10个或更侧接氨基酸) 的一个或更多氨基酸也包括在人源化的抗体中。
在一些实施方式中，本发明的人源化的抗体的人重链框架区利用 人IGHV1-46*03种系序列。在一些实施方式中，本发明的人源化的抗 体的人轻链框架区利用人IGKV1D-39*01种系序列。可在这些FR区 中，例如，在描述于下例的一个或更多残基中任选地制造突变(例如， 回复突变)以改善人源化的抗体的CCL20-结合亲和力。
“亲和性”是描述结合相互作用的强度的本领域术语和一般指称抗 体与抗原结合的总体强度。抗体对抗原的亲和性一般表达为特定抗体- 抗原相互作用的结合亲和力平衡常数(KD)。
在一些实施方式中，抗体以500pM或更小，400pM或更小，300pM 或更小，200pM或更小，100pM或更小，90pM或更小，80pM或更 小，70pM或更小，60pM或更小，50pM或更小，或45pM或更小， 如由单价表面等离子体共振测定；或12pM或更小，10pM或更小， 8pM或更小，6pM或更小，或5pM或更小，如由二价表面等离子体 共振测定，的亲和性(KD；KD＝Koff(kd)/Kon(ka))结合于人CCL20。 在一些实施方式中，抗体以1000×105M-1s-1或更小，900×105M-1s-1或 更小，800×105M-1s-1或更小，700×105M-1s-1或更小，600×105M-1s-1或 更小，500×105M-1s-1或更小，400×105M-1s-1或更小，300×105M-1s-1或 更小，240×105M-1s-1或更小，200×105M-1s-1或更小，190×105M-1s-1或 更小，180×105M-1s-1或更小，170×105M-1s-1或更小，160×105M-1s-1或 更小，或150×105M-1s-1或更小的ka结合于人CCL20，如由单价表面 等离子体共振(BiacoreTM)测定。在一些实施方式中，抗体以 1000×10-5s-1或更小，900×10-5s-1或更小，800×10-5s-1或更小，700×10-5s-1或更小，600×10-5s-1或更小，500×10-5s-1或更小，400×10-5s-1或更小， 300×10-5s-1或更小，240×10-5s-1或更小，200×10-5s-1或更小，190×10-5s-1或更小，180×10-5s-1或更小，170×10-5s-1或更小，160×10-5s-1或更小， 150×10-5s-1或更小，140×10-5s-1或更小，130×10-5s-1或更小，120×10-5s-1或更小，100×10-5s-1或更小，90×10-5s-1或更小，80×10-5s-1或更小， 70×10-5s-1或更小，或65×10-5s-1或更小的kd结合于人CCL20，如由单 价表面等离子体共振(BiacoreTM)测定。
如对于本领域技术人员显而易见，各种方法可用于确认根据本文 提供的方法产生的及本领域知道的抗体和其抗原结合部分具有必要的 特异性(例如，结合特异性，表位特异性)。例如，对人CCL20具有 结合特异性的本发明的人源化的抗-CCL20抗体或部分的结合功能可 通过使用任何适合的方法，例如，监测人源化的抗体或部分和人 CCL20(或，例如，具有CCL20的氨基酸序列的肽或包含人CCL20的 固体支持物)之间的复合物形成的测定来检测。
本发明的抗体或其抗原结合部分(例如，本发明的人源化的抗体 或部分)与本文公开的特定鼠，嵌合或人源化的单克隆抗体结合人 CCL20上的相同的表位，或结合与本文公开的特定鼠，嵌合或人源化 的单克隆抗体所结合的人CCL20上的表位重叠的人CCL20上的表位 的能力，可通过使用本领域技术人员知道的各种技术，包括例如，竞 争性结合测定来容易测定。这些可涉及标记的形式的所述特定抗体的 使用，及标记的抗体和人CCL20在本发明的抗体的存在及缺失下的 测量。
本文所用的“表位”包括能特异性结合于抗体的任何蛋白决定子。 表征抗体所结合的表位的方法为本领域所知。一种表征由本发明的抗 -CCL20抗体结合的表位的方法描述在实施例9中。一旦测定抗原上 期望的表位，则可例如使用本发明中描述的技术产生针对该表位的抗 体。或者，在发现过程期间，抗体的产生和表征可阐明关于期望表位 的信息。自此信息，然后可就结合相同的表位竞争性地筛选抗体。例 如，熟练的工人可进行竞争研究而发现与另一个竞争性地结合的抗体， 即，竞争结合抗原的抗体。
在一实施方式中，为测定是否测试抗体或其抗原结合部分与本发 明的人源化的抗体结合于相同的或重叠表位，允许本发明的抗-CCL20 抗体在饱和条件下结合CCL20，然后测量测试抗体结合CCL20的能 力。如果测试抗体能在与参照抗-CCL20抗体相同的时间结合CCL20， 则测试抗体可与参照抗-CCL20抗体结合于不同表位。但是，如果测 试抗体不能在相同的时间结合CCL20，则测试抗体可结合于相同的表 位，重叠表位或紧邻由本发明的抗-CCL20抗体结合的表位的表位。 此实验可通过使用，例如，ELISA，RIA，BiacoreTM或流式细胞术实 施。为了测试是否抗-CCL20抗体与另一抗-CCL20抗体交叉-竞争， 可在2个方向使用上述竞争方法，即，测定是否参照抗体阻断测试抗 体和反之亦然。在一些实施方式中，实验通过使用BiacoreTM实施。
表位框并也可用于表征本发明的抗体。术语“框并”指称基于它们 的抗原结合特征组合抗体的方法。基于它们的交叉-竞争的“框并”抗体 的高通量过程描述于国际专利申请号WO 03/48731。“表位框并”可通 过允许未标记的形式的抗-CCL20抗体“A”结合对应于CCL20的序列 的合成肽或CCL20阳性细胞来研究。随后添加标记的第2抗-CCL20 抗体“B”及可评定可相对于细胞或合成肽之前未暴露于抗-CCL20抗 体“A”的对照样品结合的标记的抗体的量。或者，抗-CCL20抗体“A” 和“B”可用不同荧光色素或致使检测的化学品标记，及可使用能检测 标记物的装置测量可同时衔接CCL20肽的两种标记的抗体的量或由 流式细胞术测量同时衔接CCL20阳性细胞的抗体的量。BiacoreTM和 Octet技术致使人们研究未标记的形式的抗体的竞争性结合。期望此 未标记的形式的抗体的使用，由于一些抗体的化学修饰可缓和结合活 性。也见描述于Jia等人，J.Immunol.Methods 288：91-98(2004)的 技术，其在实施表位框并中也有用。
本文提供的也是本发明的抗-CCL20抗体的部分，诸如轻链，重 链和轻和重链的部分。这些抗体部分可获自或源于抗体(例如，通过 减小和/或切割)，或由编码具有期望的性质(例如，结合人CCL20，序 列相似性)的部分抗体或其链的核酸产生或表达。它们也可由例如， 关联部分的新合成来制备。包含人和非人来源的期望的部分(例如，抗 原-结合区，CDR，FR，C区)的人源化的抗体可通过使用合成和/或重 组核酸产生以制备编码期望的人源化的链的构建体(例如，eDNA)。 例如，为制备部分抗体(例如，部分链)，可将一个或更多终止密码 子在期望的位置导入核酸序列。编码人源化的可变区的核酸(例如， DNA)序列可通过使用PCR诱变方法构建而改变即有的DNA序列(见 例如，Kamman et al.，Nucl.Acids Res.17：5404(1989))。可将编码 新CDR的PCR引物与基于相同的，或非常类似的，人可变区的之前 人源化的可变区的DNA模板杂交(Sato等人，Cancer Research 53：851-856(1993))。如果类似DNA序列不是对于作为模板使用可 利用的，可自合成寡核苷酸构建包含编码可变区序列的序列的核酸(见 例如，Kolbinger，Protein Engineering 8：971-980(1993))。也可将编 码信号肽的序列(“信号序列”)合入核酸(例如，在合成时，在插入 载体时)。如果信号肽序列不是可利用的(例如，不一般存在)，可 使用来自另一抗体的信号肽序列(见，例如，Kettleborough，Protein Engineering 4：773-783(1991))。使用这些方法，本文所述的方法 或其他适合的方法，可容易产生变体。
如本文所用，简称“mAb”(或“MAb”)指称单克隆抗体，其可为， 例如，由细胞克隆群合成的抗体或人源化的抗体。产生单克隆抗体的 克隆群可为永生化的细胞的克隆群。在一些实施方式中，克隆群中的 永生化的细胞是一般通过自免疫的动物的个体B淋巴细胞与自淋巴细 胞肿瘤的个体细胞的融合产生的杂交细胞(杂交瘤)。
本发明部分涉及对人CCL20具有结合特异性及包含人源化的轻 链和人源化的重链和/或其部分的人源化的抗体或其抗原结合部分。在 一实施方式中，人源化的抗体包含轻链，所述轻链包含SEQ ID NO：7 的一个或更多CDR(例如，全部3个CDR)和重链，所述重链包含 SEQ ID NO：1的一个或更多CDR(例如，全部3个CDR)；轻链， 所述轻链包含SEQ ID NO：7的一个或更多CDR(例如，全部3个 CDR)和重链，所述重链包含SEQ ID NO：2的一个或更多CDR(例 如，全部3个CDR)；轻链，所述轻链包含SEQ ID NO：7的一个或 更多CDR(例如，全部3个CDR)和重链，所述重链包含SEQ ID NO： 3的一个或更多CDR(例如，全部3个CDR)；轻链，所述轻链包含 SEQ ID NO：7的一个或更多CDR(例如，全部3个CDR)和重链， 所述重链包含SEQ ID NO：4的一个或更多CDR(例如，全部3个 CDR)；轻链，所述轻链包含SEQ ID NO：7的一个或更多CDR(例 如，全部3个CDR)和重链，所述重链包含SEQ ID NO：5的一个或 更多CDR(例如，全部3个CDR)；轻链，所述轻链包含SEQ ID NO： 7的一个或更多CDR(例如，全部3个CDR)和重链，所述重链包含 SEQ ID NO：6的一个或更多CDR(例如，全部3个CDR)；轻链， 所述轻链包含SEQ ID NO：8的一个或更多CDR(例如，全部3个 CDR)和重链，所述重链包含SEQ ID NO：1的一个或更多CDR(例 如，全部3个CDR)；轻链，所述轻链包含SEQ ID NO：8的一个或 更多CDR(例如，全部3个CDR)和重链，所述重链包含SEQ ID NO： 2的一个或更多CDR(例如，全部3个CDR)；轻链，所述轻链包含 SEQ ID NO：8的一个或更多CDR(例如，全部3个CDR)和重链， 所述重链包含SEQ ID NO：3的一个或更多CDR(例如，全部3个 CDR)；轻链，所述轻链包含SEQ ID NO：8的一个或更多CDR(例 如，全部3个CDR)和重链，所述重链包含SEQ ID NO：4的一个或 更多CDR(例如，全部3个CDR)；轻链，所述轻链包含SEQ ID NO： 8的一个或更多CDR(例如，全部3个CDR)和重链，所述重链包含 SEQ ID NO：5的一个或更多CDR(例如，全部3个CDR)；或轻链 包含SEQ ID NO：8的一个或更多CDR(例如，全部3个CDR)和重 链，所述重链包含SEQ ID NO：6的一个或更多CDR(例如，全部3 个CDR)。
在一实施方式中，本发明的人源化的抗体包含重链(H)-CDR1， H-CDR2，H-CDR3，轻链(L)-CDR1，L-CDR2和L-CDR3，其氨基酸 序列分别是：
(a)分别是SEQ ID NO：60，64，67，70，73和75；
(b)分别是SEQ ID NO：60，64，67，71，73和75；
(c)分别是SEQ ID NO：60，63，67，70，73和75；
(d)分别是SEQ ID NO：60，63，67，71，73和75；
(e)分别是SEQ ID NO：61，65，68，70，73和75；
(f)分别是SEQ ID NO：61，65，68，71，73和75；
(g)分别是SEQ ID NO：77，79，67，70，73和75；
(h)分别是SEQ ID NO：77，79，67，71，73和75；
(i)分别是SEQ ID NO：78，80，68，70，73和75；以及
(j)分别是SEQ ID NO：78，80，68，71，73和75。
在另一实施方式中，本发明的人源化的抗体包含H-CDR3，其序 列是SEQ ID NO：67或68。在特定实施方式中，本发明的人源化的抗 体包含H-CDR3和L-CDR3，其序列分别是SEQ ID NO：67和75，； 或分别是SEQ ID NO：68和75。
在另一实施方式中，人源化的抗体对人CCL20具有结合特异性 及包含轻链，所述轻链包含选自下列的一个或更多CDR：SEQ ID NO： 70或71；73；及75，或其组合；及重链，所述重链包含选自下列的 一个或更多CDR：SEQ ID NO：60，61，77或78；63，64，65，79 或80；及67或68；或其组合。
在另一实施方式中，对人CCL20具有结合特异性的人源化的抗 体包含轻链，所述轻链包含SEQ ID NO：7，8，110或112的一个或 更多CDR(例如，全部3个CDR)，及重链，所述重链包含SEQ ID NO：1，2，3，4，5，6或108的一个或更多CDR(例如，全部3个 CDR)。
本发明也涉及本文所述的人源化的抗体的人源化的抗体轻链。在 一实施方式中，人源化的抗体轻链包含选自下列的一个或更多CDR： 70或71；73；及75，或其组合。例如，人源化的抗体具有L-CDR1， L-CDR2和L-CDR3，其氨基酸序列分别是70，73和75；或分别是 71，73和75。
本发明也涉及本文所述的人源化的抗体的人源化的抗体重链。在 一实施方式中，人源化的抗体重链包含选自下列的一个或更多CDR： 60，61，77或78；63，64，65，79或80；及67或68；或其组合。 例如，人源化的抗体具有H-CDR1，H-CDR2和H-CDR3，其氨基酸 序列是：
(a)SEQ ID NO：60，63和67；
(b)SEQ ID NO：60，64和67；
(c)SEQ ID NO：61，65和68；
(d)SEQ ID NO：77，79和67；或者
(e)SEQ ID NO：78，80和68。
在一实施方式中，本发明的人源化的抗体包含轻链，所述轻链包 含可变结构域(VL)SEQ ID NO：15或16的序列。在相关的实施方式 中，人源化的抗体包含轻链，其氨基酸序列包含SEQ ID NO：7，8， 110和112之一或由SEQ ID NO：7，8，110和112之一组成。在一实 施方式中，人源化的抗体包含轻链，其氨基酸序列包含无信号序列的 SEQ ID NO：7或8，或由其组成。
在一实施方式中，本发明的人源化的抗体包含重链，所述重链包 含SEQ ID NO：9～14之一的可变结构域(VH)序列。在相关的实施 方式中，人源化的抗体包含重链，其氨基酸序列包含SEQ ID NO：1～ 6和108之一，或由其组成。在一实施方式中，人源化的抗体包含重 链，其氨基酸序列包含无信号序列及任选地有C-端赖氨酸的SEQ ID NO：1～6之一，或由其组成。在一实施方式中，人源化的抗体包含重 链，其氨基酸序列包含无C-端赖氨酸的SEQ ID NO：108，或由其组 成。
在一些实施方式中，本发明的人源化的抗体包含VH和VL，其氨 基酸序列包含以下序列或由以下序列组成：
(a)SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：15；
(b)SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：15；
(c)SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：15；
(d)SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：15；
(e)SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：15；
(f)SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15；
(g)SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：16；
(h)SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：16；
(i)SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：16；
(j)SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：16；
(k)SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：16；或者
(l)SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16。
在一实施方式中，本发明的人源化的抗体包含轻链(LC)和重链 (HC)，其氨基酸序列包含以下序列或由以下序列组成：
(a)SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：7；
(b)SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：7；
(c)SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：7；
(d)SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：7；
(e)SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7；
(f)SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7；
(g)SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：8；
(h)SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：8；
(i)SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：8；
(j)SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：8；
(k)SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：8；
(l)SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8，
(m)SEQ ID NO：108和SEQ ID NO：110；以及
(n)SEQ ID NO：108和SEQ ID NO：112；
其中氨基酸序列缺乏信号序列，如果存在所述信号序列，且其中 SEQ ID NO：1～6和SEQ ID NO：108任选地缺乏C-端赖氨酸。
本发明提供包含本发明的例示的人源化的重链或其抗原结合部 分，及例示的人源化的轻链或其抗原结合部分的任何组合；换言之， 重和轻链可为“混合的和匹配的”。需知，任何该组合可能保留结合人 CCL20以及趋化性中和活性。这些功能性质可通过使用本文所述的方 法容易测试。的确，图7展示本发明的例示的人源化的重和轻链的几 种组合的中和活性。
本发明也提供与在本文例示的抗体结合相同的表位，和/或竞争或 交叉-竞争的抗-人CCL20抗体或其抗原结合部分。这些抗体可为，例 如，人源化的，嵌合或小鼠抗体。例如，本发明提供与小鼠抗-CCL20 抗体36F7C10，40-1C10B9和42G5B10之一，或这些小鼠抗体的人源 化的或嵌合形式结合相同的表位，和/或竞争或交叉-竞争的抗-人 CCL20抗体和部分。抗体与参照抗体结合相同的表位，或竞争或交叉 -竞争的能力可如本文所述测定。由非限制例的方式，包含自小鼠抗体 36F7C10的3个重链CDR和3个轻链CDR的任何抗体或部分会预期 与小鼠抗体36F7C10结合相同的表位，竞争和交叉-竞争。该抗体可 包括，例如，抗体，其重链包含SEQ ID NO：9～11中的任何一个和 其轻链包含SEQ ID NO：15或16。在一些实施方式中，该抗体可还包 括，例如，抗体，其重链包含SEQ ID NO：12～14中的任何一个和其 轻链包含SEQ ID NO：15或16。
如果需要，例如，为诊断或检定目的(例如，允许，例如，监测治 疗的成像)，人源化的抗体(或其抗原结合部分)可包含可检测的标 记物。适合的可检测的标记物和标记人源化的抗体或其抗原结合部分 的方法为本领域所熟知。适合的可检测的标记物包括，例如，放射性 同位素(例如，铟-111，锝-99m或碘-131)，正电子发射标记物(例 如，氟-19)，顺磁性离子(例如，钆(III)，锰(II))，表位标记 物(标签)，亲和性标记物(例如，生物素，亲和素)，旋转标记物， 酶，荧光基团或化学发光基团。当未采用标记物时，复合形成(例如， 人源化的抗体和人CCL20之间的)可通过表面等离子体共振，ELISA， FACS或其他适合的方法测定。
本发明中使用的抗-CCL20抗体或其抗原结合部分也可，例如， 经化学反应或遗传修饰，缀合于改善抗体’药代动力学诸如半衰期的其 他部分(例如，聚乙二醇化部分)。在一些实施方式中，本发明中使 用的抗-CCL20抗体可连接到适合的细胞因子，例如，经化学缀合或 遗传修饰(例如，与抗体编码序列框内随附细胞因子的编码序列，由 此建造抗体：细胞因子融合蛋白)。
本发明也涉及人源化的抗体(或本发明的其抗原结合部分)偶联 于另一治疗剂，诸如生物活性化合物(例如，细胞因子，超抗原，细胞 毒性剂或毒素)的免疫缀合物。例如，对人CCL20(或其抗原结合部 分)具有结合特异性的人源化的抗体可偶联于生物学蛋白，植物或细 菌来源的分子(或其衍生物)，白细胞介素-2抗体或白喉毒素抗体。
如本文所述，已产生对人CCL20具有结合特异性的小鼠单克隆 抗体。本发明的人源化的及嵌合抗体可源于本发明的小鼠单克隆抗体。 即，在一些实施方式中，本发明的人源化的及嵌合抗-CCL20抗体包 含取自本发明的小鼠单克隆抗体的序列，诸如一个或更多CDR序列 (例如，全部6个CDR序列)或一个或更多可变结构域(例如，重链 可变结构域和轻链可变结构域)。
如本文所用，术语“小鼠单克隆抗体”指称含有鼠抗体的轻链CDR (L-CDR1，L-CDR2和L-CDR3)和重链CDR(H-CDR1，H-CDR2 和H-CDR3)的，及鼠来源的框架和恒定区的抗体。
本发明涉及本文所述的小鼠单克隆抗体，以及小鼠单克隆抗体的 抗原-结合部分，小鼠单克隆抗体的轻链，小鼠单克隆抗体的重链，及 这些重和轻链的部分。在特定实施方式中，小鼠单克隆抗体是 36F7C10，40-1C10B9或42G5B10。本发明涉及缺少重和轻链信号序 列的小鼠单克隆抗体和糖基化的小鼠单克隆抗体。本发明也涉及前体 抗体，非糖基化的抗体和重和/或轻链包含信号序列的抗体。本发明也 涉及编码以上小鼠抗体重链，轻链或其部分之任何的核酸分子；包含 该核酸的载体和宿主细胞；产生以上小鼠重或轻链或其部分之任何的 方法；及使用小鼠抗体或其抗原结合部分的方法。
对人CCL20具有结合特异性的小鼠单克隆抗体或其抗原结合部 分的结合功能可通过使用任何适合的方法，例如使用监测小鼠单克隆 抗体或部分和人CCL20(或，例如，具有CCL20的氨基酸序列的肽或 包含人CCL20的固体支持物)之间的复合物形成的测定来检测。
本文提供的也是包括轻链，重链和轻和重链的部分的鼠抗体的部 分。这些抗体部分可，例如，由本文所述的用于人源化的抗体部分的 手段获得或衍生。
在一实施方式中，本发明的小鼠单克隆抗体包含轻链，所述轻链 包含SEQ ID NO：40，42或44和还包含重链，所述重链包含SEQ ID NO：39，41或43。在特定实施方式中，小鼠单克隆抗体包含轻链， 所述轻链包含SEQ ID NO：40和重链，所述重链包含SEQ ID NO：39； 轻链，所述轻链包含SEQ ID NO：42和重链，所述重链包含SEQ ID NO：41；或轻链，所述轻链包含SEQ ID NO：44和重链，所述重链包 含SEQ ID NO：43。
在另一实施方式中，本发明也涉及对人CCL20具有结合特异性 的小鼠单克隆抗体，包含序列选自下列的轻链可变区：SEQ ID NO： 40，42和44；及序列选自下列的重链可变区：SEQ ID NO：39，41和 43。
本发明也涉及小鼠单克隆抗体，其轻链包含SEQ ID NO：40，42 或44的可变区。
本发明也涉及小鼠单克隆抗体，其重链包含SEQ ID NO：39，41 或43的可变区。
如果需要，例如，为诊断或检定目的(例如，成像)，小鼠单克 隆抗体或其抗原结合部分可包含例如，如本文所述用于人源化的抗体 的可检测的标记物。本文所述的用于本发明的人源化的抗体的全部适 合的方法和技术也可用于本发明的小鼠单克隆抗体。
如本文所述，已产生对人CCL20具有结合特异性的嵌合抗体。 如本文所用，术语“嵌合抗体”指称含有源于一种物种的抗体可变结构 域而源于不同物种的抗体恒定区的重组蛋白。在一实施方式中，对人 CCL20具有结合特异性的嵌合抗体包含自小鼠抗-人CCL20单克隆抗 体的可变结构域。在一实施方式中，对人CCL20具有结合特异性的 嵌合抗体包含自人抗体的恒定区。在特定实施方式中，嵌合抗体包含 自小鼠抗-人CCL20单克隆抗体的可变结构域和自人抗体的恒定区。
本发明涉及本文所述的嵌合抗体，以及嵌合抗体的抗原-结合部 分，嵌合抗体的轻链和重链，及这些轻和重链的部分。本发明涉及缺 少重和轻链信号序列的嵌合抗体和糖基化的嵌合抗体。本发明也涉及 前体抗体，非糖基化的抗体和重和/或轻链包含信号序列的抗体。本发 明也涉及编码以上嵌合抗体重链，轻链或其部分之任何的核酸分子； 包含该核酸的载体和宿主细胞；产生这些以上嵌合抗体重或轻链或其 部分之任何的方法；及使用嵌合抗体的方法。
对人CCL20具有结合特异性的嵌合抗体的结合功能可通过使用 任何适合的方法，例如使用监测嵌合抗体和人CCL20(或，例如，具有 CCL20的氨基酸序列的肽或包含人CCL20的固体支持物)之间的复 合物形成的测定来检测。
本文提供的也是包括轻链，重链和轻和重链的部分的嵌合抗体的 部分。这些抗体部分可，例如，由本文所述的用于人源化的抗体部分 的手段获得或衍生。
在一实施方式中，本发明的嵌合抗体包含SEQ ID NO：40的轻链 可变区和SEQ ID NO：39的重链可变区；SEQ ID NO：42的轻链可变 区和SEQ ID NO：41的重链可变区；或SEQ ID NO：44的轻链可变区 和SEQ ID NO：43的重链可变区。
本发明也涉及对人CCL20具有结合特异性的嵌合抗体，包含轻 链可变区序列，所述轻链可变区序列选自：SEQ ID NO：40，42或44 的轻链可变区；及还包含重链可变区序列，所述重链可变区序列选自： SEQ ID NO：39，41或43的重链可变区。
本发明也涉及嵌合轻链，其包含SEQ ID NO：40，42或44的可 变区。
本发明也涉及嵌合重链，其包含SEQ ID NO：39，41或43的可 变区。
如果需要，例如，为诊断或检定目的(例如，成像)，嵌合抗体 或其抗原结合部分可包含，例如，如本文所述用于人源化的抗体的可 检测的标记物。用于本发明的人源化的抗体的本文所述的全部适合的 方法和技术也可用于本发明的嵌合抗体。
在一些实施方式中，本发明的抗-CCL20抗体是完全人抗体。如 本文所用，术语″人抗体″是指可变和恒定区序列是人序列的任何抗 体。术语包括具有源于人基因的序列，但已变化，例如减小可能的免 疫原性，增加亲和性，消除可造成不期望的折叠的半胱氨酸，等的抗 体。术语也包括该在非-人细胞中重组产生的抗体，其可附加人细胞中 不典型的糖基化。制备完全人抗体的方法为本领域所知。例如，人抗 -CCL20抗体可通过体外方法，诸如噬菌体展示，核糖体展示(CAT)， 酵母展示等鉴定，或可从人B细胞或人杂交瘤细胞产生。或者，人抗 体可通过用CCL20抗原免疫在它们的基因组之内包含一些或全部人 免疫球蛋白重链和轻链座位的许多非-人，转基因动物之任何来产生。 在一些实施方式中，包含人免疫球蛋白基因的非-人动物是具有人免疫 球蛋白″小座位″的动物(例如，GenPharm International，Inc.)。在一 些实施方式中，人抗-CCL20抗体通过使用(Abgenix， Inc.，Fremont，CA)，HuMAb-小(Medarex，Inc.)，小鼠(Regeneron Pharmaaceuticals，Inc.)，AlivaMab小鼠(Ablexis， LLC)，KMTM小鼠(Kirin Pharma USA，Inc.)，等来产生。
本发明也涉及包含编码本发明的人源化的抗体或其轻链或重链， 小鼠单克隆抗体或其轻链或重链，嵌合抗体或其轻链或重链，或以上 任何之抗原-结合部分的序列的分离的和/或重组核酸。在一些实施方 式中，本发明提供选自下列的核酸序列：SEQ ID NO：17～32，51～ 56，109，111和113。
在一些实施方式中，本发明的核酸分子包括核酸序列，其与一个 或更多本文引用的核酸序列或编码任何提供的VH或VL序列的氨基酸 序列的核酸序列在高度严格条件下杂交，或至少70％，75％，80％， 85％，90％，95％，97％，98％或99％同一。
在本文称为“分离的”或“纯化的”核酸是已自它们的来源(例如， 如它们存在于细胞内或核酸混合物诸如库中)的基因组DNA或细胞 RNA的核酸分离出的核酸，及包括由本文所述的方法或其他适合的方 法获得的核酸。在一些实施方式中，分离的核酸是基本上纯的核酸， 由化学合成产生的核酸，通过生物学和化学方法的组合产生的核酸， 或分离的重组核酸(见，例如，Daugherty等人，Nucleic Acids Res. 19(9)：2471-2476(1991)；Lewis and Crowe，Gene 101：297-302(1991))。
说到核苷酸序列包括其补体，除非另外特殊说明。由此，说到具 有特定序列的核酸应理解为包括其互补链，与其互补序列。术语“多核 苷酸”在本文指至少10个碱基长度的聚合物，可能分离的，形式的核 苷酸，核糖核苷酸或脱氧核苷酸或两种类型的核苷酸的修饰的形式。 术语包括单和双链形式。
在本文被称为“重组体”的核酸是已由重组DNA方法产生的核酸， 包括由依赖于人工重组方法的过程，诸如聚合酶链反应(PCR)和/ 或使用限制酶克隆进载体来产生的那些核酸。在一些实施方式中，重 组核酸由通过天然的细胞机理发生的重组事件所致，但选择用于在导 入设计为允许及制造可能的期望的重组事件的核酸的细胞之后。
本发明也更特别涉及包含编码对人CCL20具有结合特异性的人 源化的抗体，小鼠抗体或嵌合抗体，或所述抗体的抗原-结合部分的核 苷酸序列的分离的和/或重组核酸。在一些实施方式中，抗体是本发明 的小鼠抗体，本发明的人源化的抗体，其中非人部分源于鼠抗-CCL20 单克隆抗体；或非人部分源于鼠抗-CCL20单克隆抗体的本发明的嵌 合抗体。
在一些实施方式中，本发明的核酸用于产生对人CCL20具有结 合特异性的人源化的抗体，对人CCL20具有结合特异性的小鼠抗体， 及对人CCL20具有结合特异性的嵌合抗体。例如，可将编码本发明 的人源化的抗体，小鼠抗体或嵌合抗体的核酸(例如，DNA(诸如 cDNA)或RNA)或一个或更多核酸整合入适合的构建体(例如，重 组载体)用于序列的进一步操作或用于在适合的宿主细胞中产生编码 的抗体。
也提供适合于对人CCL20具有结合特异性的人源化的抗体，对 人CCL20具有结合特异性的小鼠抗体或对人CCL20具有结合特异性 的嵌合抗体的表达的构建体或载体。各种载体是可利用的，包括在宿 主细胞中以单拷贝或多拷贝维持，或已整合进宿主细胞的染色体的载 体。可将构建体或载体导入适合的宿主细胞，及可产生表达本发明的 人源化的抗体，小鼠抗体或嵌合抗体的细胞及维持在培养中。单载体 或多载体可用于对人CCL20具有结合特异性的人源化的抗体，小鼠 抗体或嵌合抗体的表达。
适合的表达载体，例如哺乳动物细胞表达载体，也可含有许多组 分，包括但不限于以下一种或更多：复制原点；可选择的标记物基因； 一个或更多表达控制元件诸如转录控制元件(例如，启动子，增强子， 终止子)，一个或更多翻译信号；和/或用于膜靶向或分泌的信号序列 或前导序列(编码“信号肽”)。在构建体或载体中，信号序列可由构 建体或载体或其他源提供。例如，转录和/或翻译信号可用于指导表达。
在一些实施方式中，提供启动子用于本发明的抗体或抗体链在适 合的宿主细胞中表达。在一些实施方式中，启动子是组成性的。在一 些实施方式中，启动子是诱导性的。启动子可可操作地连接于编码抗 体或抗体链，或所述抗体或链的抗原-结合部分的核酸，使得其直接表 达编码的多肽。用于原核生物(例如，用于大肠埃希氏菌(E.coli)的 lac，tac，T3，T7启动子)和真核生物(例如，酵母醇脱氢酶(ADH1)， SV40，CMV)宿主的各种适合的启动子是可利用的。本领域技术人员 为表达本发明的抗-CCL20抗体或其抗原结合部分能选择适当的启动 子。
在一些实施方式中，编码本发明的抗体或抗体链的载体包含用于 选择携带载体的宿主细胞的可选择的标记物。在一些实施方式中，可 选择的标记物是编码赋予抗生素或药物抗性的产物的基因，其可用于 原核生物细胞(例如，β-内酰胺酶基因(氨苄西林抗性)，Tet基因(四 环素抗性)，等)和真核生物细胞(例如，新霉素(G418或遗传霉素)， gpt(麦考酚酸)，氨苄西林或潮霉素抗性基因)。在一些实施方式中， 可选择的标记物是二氢叶酸还原酶，允许在各种宿主中用甲氨喋呤选 择。在一些实施方式中，可选择的标记物是编码宿主的营养缺陷型的 标记物(例如，LEU2，URA3，HIS3)的基因，其例如，用于在酵母中 使用。在一些实施方式中，载体是病毒(例如，杆状病毒)或噬菌体 载体。在一实施方式中，载体能整合进宿主细胞的基因组(例如，反 转录病毒载体)。在一些实施方式中，载体是可复制的载体及包含复 制原点。
本发明由此涉及编码本发明的人源化的抗体，人源化的轻链，人 源化的重链，小鼠抗体，小鼠抗体轻链，小鼠抗体重链，嵌合抗体， 嵌合轻链，或嵌合重链的分离的核酸分子。本发明也涉及编码这些抗 体或它们的链之任何的抗原-结合部分的分离的核酸分子。由本发明的 核酸编码的多肽序列在上文及下列实施例中描述。
在一些实施方式中，本发明的核酸或载体编码本发明的重链(或 其抗原结合部分)或轻链(或其抗原结合部分)。含有编码重链的核 酸和编码轻链的核酸，或编码所述重链及所述轻链的抗原-结合部分的 核酸的宿主细胞，可用于制造包含重和轻链的抗体(或抗体的抗原- 结合部分)。编码重链的核酸和编码轻链的核酸可放在分开的表达载 体上。它们也可放在单表达载体上在相同的或不同表达控制下。见， 例如，美国专利No.6,331,415和7,662,623。
本发明的另一方面涉及制造本发明的抗-人CCL20抗体或其抗原 结合部分的方法。抗体或部分可，例如，通过在适合的宿主细胞中一 种或更多编码抗体或部分的重组核酸的表达来产生。宿主细胞可通过 使用任何适合的方法产生。例如，可将本文所述的一个或更多表达构 建体导入适合的宿主细胞，及得到的细胞可维持在适合于构建体或载 体表达的条件下。在一些实施方式中，得到的细胞维持在培养物，动 物，或植物中。适合的宿主细胞可为原核生物，包括细菌细胞诸如大 肠埃希氏菌(E.coli)(例如，株DH5αTM(Invitrogen，Carlsbad，CA))， 枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和/或其他适合的细菌；真核生物细胞，诸 如真菌或酵母细胞(例如，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，曲霉 属(Aspergillus sp.)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，粟酒 裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，粗糙链孢霉(Neurospora crassa))或其他低等真核生物细胞，及高等真核生物细胞诸如那些 自昆虫的细胞(例如，果蝇属(Drosophila)Schneider S2细胞，Sf9昆 虫细胞(WO 94/26087(O’Connor)，TN5B1-4(HIGH 5)昆虫细胞 (Invitrogen)，哺乳动物(例如，COS细胞，诸如COS-1(ATCC登 录号CRL-1650)和COS-7(ATCC登录号CRL-1651)，CHO(例 如，ATCC登录号CRL-9096)，CHO DG44(Urlaub and Chasin.，Proc. Natl.Acac.Sci.USA 77(7)：4216-4220(1980))，293(ATCC登录号 CRL-1573)，HeLa(ATCC登录号CCL-2)，CV1(ATCC登录号 CCL-70)，WOP(Dailey等人，J.Virol.54：739-749(1985))，3T3， 293T(Pear等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：8392-8396(1993))， NS0细胞，SP2/0细胞，HuT 78细胞等))，或植物(例如，烟草，浮 萍，及藻)。(见，例如，Ausubel等人，eds.Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates and John Wiley& Sons Inc.(1993))。在一些实施方式中，宿主细胞不是多细胞生物 (例如，植物或动物)的部分。在特定实施方式中，宿主细胞是分离 的宿主细胞或是细胞培养物的部分。
本发明也涉及包含本发明的核酸或载体的细胞。在一些实施方式 中，载体是表达载体。在一些实施方式中，可将一种或更多编码人源 化的抗体或其抗原结合部分的重和轻链，小鼠抗体或其抗原结合部分 的重和轻链，或嵌合抗体或其抗原结合部分的重和轻链，对人CCL20 具有结合特异性的所述抗体或部分的核酸，或包含该核酸的一种或更 多构建体由适合于选择的宿主细胞的方法导入适合的宿主细胞。在一 些实施方式中，导入方法是，例如，转化，转染，电穿孔或感染。在 一些实施方式中，核酸可操作地连接于一个或更多表达控制元件。在 特定实施方式中，核酸在载体中，在由细胞内加工建造的构建体中， 或整合进宿主细胞基因组。宿主细胞可维持在适合于表达的条件下。 在一些实施方式中，这些条件包括诱导物，或编码的多肽产生的适合 的培养基(补充，例如，适当的盐，生长因子，抗生素，营养物补充物， 等)的存在。这些过程包括在转基因动物或植物(例如，烟草)中宿 主细胞(例如，乳腺细胞)的表达(见例如，WO 92/03918)。在一些 实施方式中，抗体或部分从宿主细胞，培养基，或乳分离。
本发明也涉及本发明的抗体或部分(例如，人源化的抗体或部分) 在融合蛋白N-端位置，C-端位置或内部连接到另一部分(例如，不存 在于天然发现的抗体中的部分)的融合蛋白。在一些实施方式中，融 合蛋白可通过将编码抗体序列的核酸插入适合的表达载体，诸如pET 载体(例如，pET～15b，Novagen)，噬菌体载体(例如，pCANTAB 5 E，Pharmacia)或其他载体(例如，pRIT2T蛋白A融合载体， Pharmacia)来产生。可将得到的构建体导入用于表达的适合的宿主 细胞。在一些实施方式中，表达的融合蛋白自细胞裂解物利用适合的 亲和性基质分离或纯化(见，例如，Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.，Eds.，Vol.2，Suppl.26，pp.16.4.1-16.7.8 (1991)))。
本发明涉及包含编码在本文提供的抗体或部分，或其重和/或轻链 (例如，本发明的人源化的抗体，人源化的轻链或人源化的重链，小 鼠抗体，小鼠轻链或小鼠重链，嵌合抗体，或嵌合重链或嵌合轻链)的 重组核酸的宿主细胞。本发明也涉及包含编码抗体的抗原-结合部分或 其链的重组核酸的宿主细胞。在一些实施方式中，宿主细胞包含在本 文所称的本发明的重组载体。在一些实施方式中，所述重组载体是表 达载体。在特定实施方式中，所述重组载体是哺乳动物细胞表达载体。
本发明也涉及制备本发明的抗体或部分，或其重或轻链的方法。 在一实施方式中，方法包括维持本文所述的本发明的宿主细胞在适合 于所述抗体或部分或其重和/或轻链表达的条件下。在一些实施方式 中，宿主细胞含有一种或更多编码本发明的抗体或部分，或其重和/ 或轻链的分离的核酸。在一些实施方式中，宿主细胞培养在基体上或 悬浮液中。在一些实施方式中，方法还包括纯化或分离抗体或抗体链 的步骤。
本发明还涉及通过噬菌体展示制备抗体或其抗原结合部分的方 法。在一些实施方式中，淘选对CCL20抗原的幼稚抗体噬菌体展示 库。在一些实施方式中，使用通过引导的选择制备抗体的方法(见， 例如，美国专利公开号US 2006-0251658A1)。在特定实施方式中， 建造在知道的抗-CCL20抗体的，例如，固定的重链(和/或轻链)CDR3 区周围建造的自定义库。重和轻链的CDR1和CDR2区可源于幼稚库 (Osburn等人，Methods 36：61-68(2005))。在一实施方式中，抗 -CCL20scFvs从用于获得具有期望的结合性质的小鼠-人嵌合抗体的 scFv幼稚抗体库产生。这些库可筛选具有期望的结合性质的抗体。在 一些实施方式中，使用scFv噬菌体库。在特定实施方式中，识别人 CCL20的scFvs通过对重组人CCL20的一系列重复的选择循环从 scFv引导的选择库分离，如基本上描述于Vaughan等人。Nature Biotech.14：309-314(1996)。简言之，在与库温育后，预偶联于顺磁 性珠的固定的抗原及结合的噬菌体可由磁分离恢复，而将未结合的噬 菌体洗掉。结合的噬菌体可然后如由Vaughan等人描述回收(1996；见 上)和重复选择过程。
在特定实施方式中，构建由与幼稚人轻链可变区的库以单链形式 融合的小鼠抗-CCL20抗体的重链的整个可变结构域组成的库。在选 择之后，鉴定互补于小鼠重链可变区的人轻链可变区。然后构建由以 单链形式与由自小鼠抗-CCL20抗体重链可变结构域的幼稚人CDR1 和CDR2区和固定的CDR3区组成的嵌合重链可变区融合的如上述选 择的人轻链可变区库组成的库。在选择CCL20结合体之后，选择最 佳结合克隆。6个CDR区中的5个可为人来源而重链可变区的CDR3 可与小鼠重链可变结构域的原CDR3相同。
在一些实施方式中，选择通过使用偶联于Dynabeads M-270胺 (Dynal)的CCL20根据生产商的建议实施。在一些实施方式中，使 用生物素化的CCL20的选择可通过使用伯胺特定剂琥珀酰亚胺基 -6-(生物素酰胺基)己酸盐跟随生产商的使用说明(EZ link NHS LC Biotin，Pierce)制备。
在一些实施方式中，基于测量存在于周质制备物中的scFvs竞争 结合CCL20的能力的竞争测定以高通量筛选测试作为周质制备物的 自选择的输出。
可使能在高通量筛选中竞争的样品经历DNA测序，如描述于 Vaughan等人(1996；见上)和Osburn等人(2005；见上)。可然 后表达克隆及纯化为scFvs或IgG及，例如，使用测定诸如抗体-依赖 性细胞介导的细胞毒性(ADCC)测定和补体依赖性细胞毒性(CDC) 测定评定它们结合CCL20，中和CCL20或其组合的能力。然后可如 描述在WO 01/66754的实施例3中制备纯化的scFv制备物。通过使 用BCA方法测定纯化的scFv制备物的蛋白浓度(Pierce)。类似方 法可用于筛选固定的全长抗体重或轻链或重或轻链可变结构域的最佳 偶体(对链)。
在另一实施方式中，使用描述于PCT公开号WO 93/06213的表 位印模方法，将抗-人CCL20抗体或其抗原结合部分，如本文所述， 首先用于选择向CCL20具有类似结合活性的重和轻链序列，在本文 通过引用合并。在特定实施方式中，此方法中使用的抗体库是如描述 于PCT公开号WO 92/01047，McCafferty等人，Nature 348：552-554 (1990)；及Griffiths等人，EMBO J.12：725-734(1993)制备的及 筛选的scFv库，全部在本文通过引用合并。在特定实施方式中，通过 使用人CCL20作为抗原筛选scFv抗体库。
一旦选择初始VL和VH结构域，可实施“混合和匹配”实验，其中 就CCL20结合筛选不同对的起初选择的VL和VH段，以选择优选的 VL/VH配对组合。此外，未进一步改善抗体质量，优选的VL/VH对的 VL和VH段可以与负责在天然的免疫应答期间抗体的亲和性成熟的体 内体细胞突变过程类似的过程随机突变。在一些实施方式中，随机突 变在VH和/或VL的CDR3区之内发生。在特定实施方式中，此体外 亲和性成熟通过，例如，使用分别与VH CDR3或VL CDR3互补的PCR 引物扩增VH和VL结构域来实现，其中引物已在特定位置“添加的”4 种核苷酸碱基的随机混合物，使得得到的PCR产物编码已将随机突变 导入VH和/或VL CDR3区的VH和VL段。这些随机突变的VH和VL段可就结合CCL20再筛选。
通过本发明的抗-CCL20抗体自重组抗体显示库的筛选及分离， 编码选择的抗体的核酸可自显示包装(例如，自噬菌体基因组)恢复 及由标准物重组DNA技术亚克隆进其他表达载体。在一些实施方式 中，对核酸进一步操作以建造本发明的其他抗体形式，如本文所述。 在特定实施方式中，为表达通过组合库的筛选分离的重组人抗体，将 编码抗体的DNA克隆进重组表达载体及导入哺乳动物宿主细胞，如 本文所述。
在特定实施方式中，本发明提供产生分泌对人CCL20具有结合 特异性的单克隆抗体的杂交瘤的方法，包括给与人CCL20转基因小 鼠具有相同的株(例如，CD1)的非-转基因小鼠施用CCL20转基因小 鼠的淋巴细胞，由此产生免疫的，非-转基因小鼠。使免疫的，非-转 基因小鼠的脾细胞与永生化的细胞接触，由此产生融合的细胞，及将 融合的细胞维持在分泌对人CCL20具有结合特异性的单克隆抗体的 杂交瘤产生的条件下，由此产生分泌对人CCL20具有结合特异性的 单克隆抗体的杂交瘤。
本发明也提供制备突变的形式的本发明的抗-CCL20抗体和其抗 原结合部分的方法。在一些实施方式中，抗体或部分在重和/或轻链的 可变结构域中突变。在特定实施方式中，所述突变改变抗体或部分的 一种或更多结合性质。在特定实施方式中，在一个或更多CDR区制 造突变以增加或降低抗-CCL20抗体或部分的KD，增加或减小koff， 或改变抗体或部分的结合特异性。定点诱变的技术为本领域所熟知。 见例如。Sambrook等人和Ausubel等人，见上。在另一实施方式中， 在已知相比本发明的单克隆抗体中的种系是变化的氨基酸残基上制造 一个或更多突变。在特定实施方式中，在可变结构域的CDR区或框 架区，或恒定区中制造突变。在特定实施方式中，在可变结构域中制 造突变。在一些实施方式中，在已知相比本发明的抗体或部分的可变 结构域的CDR区或框架区的种系是变化的氨基酸残基上制造一个或 更多突变。
在另一实施方式中，将框架区突变从而得到的框架区具有对应种 系基因的氨基酸序列。在特定实施方式中，在框架区或恒定区制造一 个或更多突变以增加抗-CCL20抗体或部分的半衰期。见例如PCT公 开WO 00/09560。在特定实施方式中，在框架区或恒定区中制造突变 以改变抗体的免疫原性，或提供共价或非-共价结合另一分子的位点。 根据本发明，单抗体或部分可在任何一个或更多可变结构域的CDR 或框架区或恒定区中具有突变。
本发明的抗-CCL20抗体或其抗原结合部分也可通过产生目标抗 体重和轻链序列转基因的哺乳动物或植物和产生可由其恢复的形式的 抗体转基因地产生。在一些实施方式中，抗-CCL20抗体或部分山羊， 牛或其他哺乳动物的乳中产生及自其回收。见，例如，美国专利No. 5,827,690，5,756,687，5,750,172和5,741,957。在一些实施方式中，将 包含人抗体座位的非-人转基因动物用人CCL20或其免疫原性部分免 疫，如上所述。在植物中制造抗体的方法描述于，例如，美国专利No. 6,046,037和5,959,177。
在一些实施方式中，非-人转基因动物或植物通过由标准转基因技 术将一种或更多编码本发明的抗-CCL20抗体或部分的核酸分子导入 动物或植物来产生。见Hogan和美国专利No.6,417,429，见上。在特 定实施方式中，用于制造转基因动物的转基因细胞可为胚胎干细胞或 体细胞或受精卵。在一些实施方式中，非-人转基因动物或植物是嵌合 的，非嵌合的杂合子，或非嵌合的纯合子。见，例如，Hogan等人， Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual 2nd ed.， Cold Spring Harbor Press(1999)；Jackson et al.，Mouse Genetics and Transgenics：A Practical Approach，Oxford University Press(2000)； and Pinkert，Transgenic Animal Technology：A Laboratory Handbook，Academic Press(1999)。在一些实施方式中，非-人转基 因动物或植物通过靶向编码目标重链和/或轻链的构建体而具有靶向 的破坏和取代。在特定实施方式中，转基因动物或植物包含及表达编 码特异性结合人CCL20的重和轻链的核酸分子。抗-CCL20抗体或部 分可在任何非-人转基因动物或植物中制造。在特定实施方式中，非- 人动物是小鼠，大鼠，绵羊，猪，山羊，牛或马。非-人转基因动物可 在血，乳，尿，唾液，泪，粘液和其他体液中表达编码的多肽。
本发明的抗体和其抗原结合部分在中和下列细胞中CCL20-诱导 的化学吸引中有用，例如，CCR6+细胞诸如未成熟的树突细胞(DC)， 效应子/记忆T-细胞，及B细胞。抗体和部分可由此在治疗各种疾病 和病情诸如发炎，自身免疫疾病，及癌中有用。可用本发明的抗体或 抗原-结合部分治疗的疾病和病情的例包括，无限制地，Grave氏病， 白癜风，甲状腺功能亢进，类风湿性关节炎，银屑病，特应性皮炎， 接触性皮炎，克罗恩病，炎性肠疾病，B细胞恶性肿瘤，乳腺腺癌， 慢性肝炎，接触性皮炎，成胶质细胞瘤，肝细胞癌，子宫颈的人乳头 瘤病毒感染，蕈样真菌病，胰腺腺癌，牙周疾病，甲状腺乳头癌，掌 跖脓疱病，与斑丘疹相关的病情，大疱性表皮松解，斑秃，多发性硬 化，多发性肌炎，皮肌炎，Behcet氏病，急性泛发性发疹性脓疱病， 血管炎，青少年特发性关节炎，结节病，支气管哮喘，过敏性鼻炎， 肾同种异体移植排斥，移植物抗宿主病，肝同种异体移植排斥，慢性 阻塞性肺部疾病，囊性纤维化，肾小球肾炎，呼吸道合胞体病毒感染， 多发性骨髓瘤和郎格尔汉斯细胞组织细胞增多症。在一些实施方式中， 本发明提供治疗任何CCR6-关联的病情的方法。
因此，本发明提供通过给有需求的受试者施用有效量的本发明的 抗体或部分治疗发炎，自身免疫疾病，或癌的方法。在一些实施方式 中，受试者是人患者具有自身免疫疾病，癌，和/或发炎或处于具有自 身免疫疾病，癌，和/或发炎的风险。在一些实施方式中，预防性地施 用抗体或部分以预防发炎，自身免疫疾病，或癌的发作或复发。
可将本发明的抗体和其抗原结合部分单独或在联合治疗中结合另 一剂施用于个体(例如，人)。抗体或部分可在另外的剂施用之前， 作为混合物，独立地但同时，或随后施用。在一些实施方式中，另外 的剂选自下组包括，但不限于：免疫-刺激性细胞因子抑制物(例如，抗 -TNF-αMAbs)，免疫细胞消除物(例如，抗-CD20 MAbs)，辅助分 子阻断剂(例如.阿巴西普)，风湿性疾病的疾病-修饰剂(例如，非- 甾体抗-炎性药物(NSAID)，甲氨喋呤，视黄酸，及维生素D3类似 物)，及免疫抑制剂(例如，钙神经素抑制物)。在一些实施方式中， 另外的剂选自下组包括，但不限于：甾体剂，免疫调节剂，生长抑制 剂，常规免疫治疗剂，细胞因子或细胞因子拮抗剂，和/或生长因子或 生长因子拮抗剂。在一些实施方式中，抗-CCL20抗体治疗可与护理 癌标准治疗诸如化学治疗，手术或辐射，或与另一靶向的治疗诸如抗 -VEGF抗体治疗结合使用。在一些实施方式中，抗-CCL20抗体治疗 可结合预防性方案使用。在一实施方式中，可结合本发明的抗体施用 合成肽模拟物。在另一实施方式中，可结合本发明的抗体或部分施用 激素治疗。
在一实施方式中，本发明的抗体或抗原-结合部分单独或组合抗- 炎性剂施用。可随本发明的抗体施用的抗-炎性剂包括，但不限于，皮 质类固醇(例如倍他米松，布地奈德，可的松，地塞米松，氢化可的松， 甲泼尼龙，泼尼松龙，泼尼松和曲安西龙)，非类固醇类抗-炎性药物 (例如，巴柳氮，塞来考昔，双氯芬酸，二氟尼柳，依托度酸，非诺洛 芬，夫洛非宁，氟比洛芬，布洛芬，吲哚美辛，酮洛芬，甲氯芬那酸， 甲芬那酸，美洛昔康，萘丁美酮，萘普生，奥沙拉秦，奥沙普秦，保 泰松，吡罗昔康，双水杨酯，舒林酸，替诺昔康，噻洛芬酸，及托美 丁)，以及醋氨酚，抗组胺药，氨基芳基羧酸衍生物，芳基乙酸衍生 物，芳基丁酸衍生物，芳基羧酸，芳基丙酸衍生物，吡唑，吡唑酮， 水杨酸衍生物(例如sulfasalazone及氨水杨酸)，噻嗪羧酰胺，e-乙 酰胺基己酸，S-腺苷基甲硫氨酸，3-氨基-4-羟基丁酸，阿米西群，苄 达酸，苄达明，布可隆，联苯吡胺，地他唑，依莫法宗，愈创薁，萘 丁美酮，尼美舒利，奥古蛋白，奥沙西罗，瑞尼托林，哌立索唑，哌 福肟，普罗喹宗，普罗沙唑和替尼达普。
可组合本发明的抗体施用的常规非特异性免疫抑制剂包括，但不 限于，甾，环孢菌素，环孢菌素类似物，环磷酰胺甲基泼尼松，泼尼 松，硫唑嘌呤，FK-506，15-脱氧精胍菌素，那他珠单抗和通过抑制应 答T细胞的功能起作用的其他免疫抑制剂。
在一些实施方式中，本发明的抗体或抗原-结合部分组合免疫抑制 剂施用。可随本发明的抗体施用的免疫抑制剂制备物包括，但不限于， ORTHOCLONETM(OKT3)， SANDIMMUNETM/NEORALTM/SANGDYATM(cyclosporin)， PROGRAFTM(他克莫司)，CELLCEPTTM(麦考酚酯)，硫唑嘌呤， 糖皮质类固醇，AVONEXTM(干扰素-β1A)，及RAPAMUNETM(西 罗莫司)。在一实施方式中，免疫抑制剂可用于防止器官或骨髓移植 排斥。
在一些实施方式中，本发明的抗体或抗原-结合部分组合化学治疗 剂施用。可随本发明的抗体施用的化学治疗剂包括，但不限于，抗生 素衍生物(例如，多柔比星，博来霉素，柔红霉素和更生霉素)；抗雌 激素药(例如，他莫昔芬)；抗代谢剂(例如，氟尿嘧啶，5-FU，氟尿 苷，干扰素α-2b，谷氨酸，普卡霉素，巯嘌呤和6-硫代鸟嘌呤)；细胞 毒性剂(例如，卡莫司汀，BCNU，洛莫司汀，CCNU，胞嘧啶阿拉伯糖 苷，环磷酰胺，雌莫司汀，羟基脲，丙卡巴肼，丝裂霉素，白消安，顺 式-铂和硫酸长春新碱)；激素(例如，甲羟孕酮，磷酸雌莫司汀钠，乙 炔基雌二醇，雌二醇，肾上腺素，乙酸甲地孕酮，甲睾酮，二磷酸己烯 雌酚，氯烯雌醚和睾内酯)；氮芥衍生物(例如，美法仑，苯丁酸氮芥， 氮芥(氮芥)和噻替派)；甾和组合(例如，倍他米松磷酸钠)；及 其他(例如，达卡巴嗪，天冬酰胺酶，米托坦，硫酸长春新碱，硫酸长 春碱，利妥昔单抗和依托泊苷)。
在一些实施方式中，本发明的抗体或抗原-结合部分组合TNF拮 抗剂施用。可随本发明的抗体或抗原-结合部分施用的TNF拮抗剂包 括，但不限于，英利昔单抗(REMICADETM)，阿达木单抗 (HUMIRATM)，培化舍珠单抗(CIMZIATM)，戈利木单抗 (SIMPONITM)，依那西普(ENBRELTM)，黄嘌呤衍生的(例如己 酮可可碱)和安非他酮(WELLBURTINTM，ZYBANTM)。
在一些实施方式中，本发明的抗体或抗原-结合部分施用单独或组 合一个或更多静脉内免疫球蛋白制备。可随本发明的抗体或部分施用 的静脉内免疫球蛋白制备物包括但不限于GAMMARTM， IVEEGAMTM，SANDOGLOBULINTM，GAMMAGARD S/DTM，及 GAMIMUNETM。在一些实施方式中，在移植治疗(例如，骨髓移植物) 中本发明的抗体或抗原-结合部分组合静脉内免疫球蛋白制备物施用。
在一些实施方式中，本发明的抗体或抗原-结合部分组合细胞因子 或细胞因子拮抗剂施用。在一些实施方式中，本发明的抗体或抗原- 结合部分可随任何细胞因子或细胞因子拮抗剂施用，包括但不限于 IL2，IL3，IL4，IL5，IL6，IL7，IL10，IL12，IL13，IL15，抗-CD40， CD40L，IFN-γ和其TNF-α或任何拮抗剂。在一些实施方式中，本发 明的抗体或抗原-结合部分可随任何白细胞介素或白细胞介素拮抗剂 施用，包括但不限于IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6， IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，IL-16， IL-17，IL-18，IL-19，IL-20和其IL-21或任何拮抗剂。
在一些实施方式中，本发明的抗体或抗原-结合部分组合一个或更 多趋化因子或趋化因子拮抗剂施用。在特定实施方式中，本发明的抗 体或抗原-结合部分组合选自下列的α(CxC)趋化因子施用：γ-干扰素诱 导性蛋白-10(γIP-10)，白细胞介素-8(IL-8)，血小板因素-4(PF4)， 嗜中性粒细胞活化蛋白(NAP-2)，GRO-α，GRO-β，GRO-γ，嗜中 性粒细胞-活化肽(ENA-78)，粒细胞化学吸引物蛋白-2(GCP-2)， 及源于间质细胞的因素-1(SDF-1，或前-B细胞刺激性因子(PBSF))； 和/或组合选自下列的β(CC)趋化因子施用：RANTES(在活化中调控， 正常T表达及分泌)，巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)，巨噬细胞 炎性蛋白-1β(MIP-1β)，单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)，单核细 胞趋化蛋白-2(MCP-2)，单核细胞趋化蛋白-3(MCP-3)，单核细 胞趋化蛋白-4(MCP-4)巨噬细胞炎性蛋白-1γ(MIP-1γ)，巨噬细 胞炎性蛋白-3α(MIP-3α)，巨噬细胞炎性蛋白-3β(MIP-3β)，巨 噬细胞炎性蛋白-4(MIP-4/DC-CK-1/PARC)，嗜酸性粒细胞趋化因 子，Exodus和I-309；和/或γ(C)趋化因子，淋巴细胞趋化蛋白；或其 任何拮抗剂。
在一些实施方式中，本发明的抗体或抗原-结合部分随趋化因子 β-8，趋化因子β-1和/或巨噬细胞炎性蛋白-4，或其任何拮抗剂施用。 在优选的实施方式中，本发明的抗体或抗原-结合部分随趋化因子β-8 或其拮抗剂施用。
在一些实施方式中，本发明的抗体或抗原-结合部分组合IL-4拮 抗剂施用。可随本发明的抗体和抗体组合物施用的IL-4拮抗剂包括， 但不限于：可溶性IL-4受体多肽，多聚体形式的可溶性IL-4受体多 肽，不转导由IL-4引发的生物学信号地结合IL-4受体的抗-IL-4受体 抗体，阻断IL-4与一个或更多IL-4受体结合的抗-IL4抗体，及结合 IL-4受体但不转导由IL-4引发的生物学信号的IL-4的突变蛋白。优 选地，根据此方法采用的抗-IL4抗体是单克隆抗体；也可采用其抗原 结合部分。
在一些实施方式中，本发明的抗体或抗原-结合部分组合TNF家 族成员，或其拮抗剂施用。在一些实施方式中，本发明的抗体或抗原- 结合部分组合下列剂施用，包括，但不限于，可溶性形式的TNF-α， 淋巴毒素-α(LT-α，也被称为TNF-β)，LT-β(见于复合物异源三聚 体LT-α2-β)，OPGL，FasL，CD27L，CD30L，CD40L，4-1BBL， DcR3，OX40L，TNF-γ(国际公开号WO 96/14328)，AIM-I(国际 公开号WO 97/33899)，endokine-α(国际公开号WO 98/07880)， OPG，neutrokine-α(国际公开号WO 98/18921)，OX40，神经生长 因子(NGF)，可溶性形式的Fas，CD30，CD27，CD404-IBB，TR2 (国际公开号WO 96/34095)，DR3(国际公开号WO 97/33904)， DR4(国际公开号WO 98/32856)，TR5(国际公开号WO 98/30693)， TR6(国际公开号WO 98/30694)，TR7(国际公开号WO 98/41629)， TRANK，TR9(国际公开号WO 98/56892)，TR10(国际公开号WO 98/54202)，312C2(国际公开号WO 98/06842)，TR12和可溶性形 成CD154，CD70和CD153；或其任何拮抗剂。
如本文所用，术语″治疗有效量″指称会某种程度减轻或预防治疗 的病症的一种或更多症状的治疗剂的施用的量。用于治疗疾病的抗 -CCL20抗体或其抗原结合部分的有效量是辅助治疗的受试者达到一 种或更多期望的临床终点的量。
在一些实施方式中，为最小化免疫原性，人源化的抗体或部分用 于在本发明的治疗性方法和组合物中治疗人患者。在重复的施用不是 必需的情况中，在一些实施方式中，给人患者施用本发明的小鼠或嵌 合抗体或部分也可为适当的。
在一些实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合部分可用于治疗 已之前用，例如，免疫-刺激性细胞因子抑制物(例如，抗-TNF-α MAbs)，免疫细胞消除物(例如，抗-CD20MAbs)和/或辅助分子阻 断剂(例如.阿巴西普)治疗的个体。在一些实施方式中，抗体或部 分用于治疗发展了主要非-应答或对这些其他治疗的应答速度逐渐降 低的患者。
本发明的抗体或其抗原结合部分可以单个单元剂量或多剂量在由 卫生保健提供者认为适当的任何时间点施用。剂量可通过本领域知道 的方法确定和可依赖于，例如，个体龄，灵敏度，耐受性和总体健康 幸福。可就本发明的抗体和部分适宜地采用本领域中接受的任何施用 方法，包括但不必然限于肠胃外(例如，静脉内，动脉内，肌内，鞘内， 腹膜内，皮下注射)，口腔(例如，饮食)，局部，局部，吸入(例 如，支气管内，鼻内或口腔吸入，鼻内滴)，或直肠，依赖于治疗的疾 病或病情。在一实施方式中，抗体或部分肠胃外施用。
制剂会根据选择的施用途径改变(例如，溶液，乳剂)。包含待 施用的抗体或部分的适当的组合物可在生理学可接受的媒质或载体中 制备。组合物可包含多剂量或是单个单元剂量组合物。对于溶液或乳 剂，适合的载体包括，例如，水性或酒精/水溶液，乳剂或悬浮液，包 括盐水及缓冲的培养基。肠胃外媒质可包括氯化钠溶液，Ringer氏右 旋糖，右旋糖和氯化钠，乳酸Ringer氏或不挥发油。静脉内媒质可包 括各种添加剂，防腐剂或流体，营养或电解质补加物(见，通常， Remington’s Pharmaceutical Sciences，17th Edition，Mack Publishing Co.，PA，1985)。为吸入，化合物可溶解及装载进用于施用的适合的 分注器(例如，喷雾器，雾化器或加压的气雾剂分注器)。
可调节剂量方案以提供最佳所需应答。在特定实施方式中，可施 用单次推注，可经时施用几个分开的剂量，或如由治疗状况的急迫程 度指示，剂量可按比例减少或增加。为施用容易和剂量均一性以剂量 单元形式配制肠胃外组合物是尤其有利的。剂量单元形式，如本文所 用，指称用于待治疗的患者/受试者的适合作为单元剂型的物理学独立 单元；各单元含有计算为与需要的药学载体关联产生期望的治疗效果 的预定量的活性化合物。本发明的剂量单元形式的规格通常决定于和 直接依赖于(a)治疗剂的独特性质和待达到的特定治疗或预防效应， 及(b)为个体中灵敏治疗而配合该活性化合物的领域中固有的限制。
由此，本领域技术人员会同意，基于本文提供的公开，根据治疗 领域熟知的方法调整剂量和施剂方案。即，可容易建立最大容许的剂 量，及也可测定给患者提供可检测的治疗性益处的有效量，施用各剂 的时间需求可给患者提供可检测的治疗性益处。因此，虽然在本文例 示特定剂量和施用方案，这些例对在实践本发明中可给患者提供的剂 量和施用方案无任何限制。
需注意，剂量值可随待缓和的病情的类型和严重性改变，及可包 括单或多剂量。还需明白，对于任何特定受试者，特定剂量方案应根 据个体需求和施用或监督组合物施用的人的专业判断经时调整，及本 文所述的剂量范围仅是例示及未旨在限制要求保护的组合物的范围或 实践。而且，用本发明的组合物的剂量方案可基于各种因素，包括疾 病类型，龄，重量，性别，患者的医疗病情，病情严重性，施用途径， 及采用的特定抗体。由此，剂量方案可广泛改变，但可使用标准方法 常规确定。例如，剂量可基于药代动力学或药效学参数调整，其可包 括临床效应诸如毒性效应和/或实验室值。本发明由此包括如由本领域 技术人员测定的患者内剂量-升高。确定适当的剂量和方案的方法为关 联领域所熟知和会理解为一旦提供本文公开的教导，就包括在本领域 技术人员的技能范围之内。
在一些实施方式中，为给人受试者施用，本发明的抗体或抗体部 分的总每月剂量在0.5～1200mg/患者范围内，当然，依赖于施用模式。 在特定实施方式中，静脉内每月剂量需要约1～1000mg/患者。总每月 剂量可以单或分开的剂量施用和可，根据医师的考虑，落在本文给出 的典型范围之外。
在特定实施方式中，本发明的抗体或抗体部分的治疗或预防性地 有效量的范围是1～1000mg/kg/患者/月。在一实施方式中，本发明的 抗体或其部分可以约1-200或1～150mg/患者/月施用。在特定实施方 式中，抗体或部分以1，2，3，4，5，6，7，8，9或10mg/kg/患者每 月注射1，2，3，4，5，6，7，8，9或10次施用。在特定实施方式中， 抗体或部分以1～5mg/kg/患者每月注射1或2次施用。
本发明的抗体和其抗原结合部分在研究和诊断中应用的各种过程 也是有用的。在一些实施方式中，抗体和部分用于检测，分离和/或纯 化人CCL20或其变体(例如，由亲和纯化或其他适合的方法诸如流式 细胞术，例如，用于细胞，诸如淋巴细胞，在悬浮液中)及研究人CCL20 结构(例如，构象)和功能。为体外应用，其中不关心抗体的免疫原 性，除了人源化的抗体之外，本发明的小鼠和嵌合抗体和其抗原结合 部分会是有用的。
本发明的抗体或其抗原结合部分可用于诊断性应用(例如，体外， 离体)。在一些实施方式中，本发明的人源化的抗体或部分用于检测 和/或测量样品中人CCL20的水平。在特定实施方式中，样品包含， 例如，表达人CCL20的细胞或组织，和/或带有人CCL20的体液诸如 炎性渗出物，血，血清和/或肠流体。样品可从本文所述的个体得到和 抗体或部分可在适合的免疫学方法中使用以检测和/或测量人CCL20 表达，包括方法诸如流式细胞术(例如，对于悬浮液中的细胞诸如淋 巴细胞)，酶联免疫吸附测定(ELISA)，包括化学发光测定，放射 免疫测定和免疫组织学。
在一实施方式中，检测样品中人CCL20的方法包括使样品与本 发明的抗体或部分在适合于抗体或部分与人CCL20特异性结合及检 测形成的抗体-CCL20复合物的条件下接触。在一实施方式中，本文 所述的抗体或部分可用于就人CCL20反应性和/或表达(例如，免疫组 织学地)分析正常对比发炎的组织(例如，来自人)以检测人CCL20 的增加的表达(例如，在影响的组织)和选自但不限于下列的一个或 更多病症之间的关联：Grave氏病，白癜风，甲状腺功能亢进，类风 湿性关节炎，银屑病，特应性皮炎，接触性皮炎，克罗恩病，炎性肠 疾病，B细胞恶性肿瘤，乳腺腺癌，慢性肝炎，接触性皮炎，成胶质 细胞瘤，肝细胞癌，子宫颈的人乳头瘤病毒感染，蕈样真菌病，胰腺 腺癌，牙周疾病，甲状腺乳头癌，掌跖脓疱病，与斑丘疹相关的病情， 大疱性表皮松解，斑秃，多发性硬化，多发性肌炎，皮肌炎，Behcet 氏病，急性泛发性发疹性脓疱病，血管炎，青少年特发性关节炎，结 节病，支气管哮喘，过敏性鼻炎，肾同种异体移植排斥，移植物抗宿 主病，肝同种异体移植排斥，慢性阻塞性肺部疾病，囊性纤维化，肾 小球肾炎，呼吸道合胞体病毒感染，多发性骨髓瘤，郎格尔汉斯细胞 组织细胞增多症，或其他病情。由此，本发明的抗体允许评定正常及 发炎的组织中人CCL20存在的免疫学方法，由此可评定疾病，例如， 炎性和/或免疫疾病治疗中抗-人CCL20的存在，疾病前进和/或疾病治 疗的功效。
本发明的方法和技术通常根据本领域熟知的常规方法实施及如描 述于贯穿本说明书引用及讨论的各种一般的和更特定参考文献中，除 非另外指示。见，例如，Sambrook J.&Russell D.Molecular Cloning： A Laboratory Manual，3rd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor，N.Y.(2000)；Ausubel et al.，Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology，Wiley，John&Sons，Inc.(2002)； Harlow and Lane Using Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1998)； and Coligan et al.，Short Protocols in Protein Science，Wiley，John& Sons，Inc.(2003)。酶促反应和纯化技术根据生产商的说明书实施， 如本领域通常实现的或如在本文描述。关联，及本文所述的分析化学， 合成有机化学，及医药和药学化学的实验室过程和技术使用的命名法 是本领域熟知的及通常使用的那些。
除非另外定义，本文所用的全部技术和科学术语具有由本发明所 属的本领域普通技术人员通常明白的相同的含义。例示方法和材料在 以下描述，尽管类似或相当于本文所述的那些的方法和材料也可用于 本发明的实践或测试。本文提及的全部出版物和其他参考文献通过引 用以它们的整体合并。在冲突的情况中，以本说明书，包括定义为准。 尽管在本文引用许多文献，此引用不构成准许任何这些文献形成本领 域中公知常识的部分。贯穿此说明书和权利要求，词汇“包含 (comprise)”，或变异诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)” 会理解为暗示包括陈述的整体或整体组，但不排除任何其他整体或整 体组。材料，方法和例仅是例证性的及不旨在限制。
为了为更好地理解本发明，提供下列实施例。这些例仅是例证目 的及不解释为以任何方式限制本发明的范围。
【实施例】
【实施例1：自身免疫/炎性病症中CCL20的参与】
为了获得CCL20涉及自身免疫和炎性病情的证据，我们研究了 II型胶原-诱导的关节炎(CIA)小鼠类风湿性关节炎(RA)模型中 敲除CCL20受体CCR6的效应。将CCR6野生型小鼠，CCR6+/-(杂 合)小鼠，及CCR6-/-(纯合)敲除小鼠(各n＝10)用在完全弗氏佐 剂(Chondrex，#7001)中乳化的牛II型胶原(150μg/小鼠)在尾根免 疫。3周后，在尾根施用相同的量的不完全的佐剂中的牛II型胶原乳 剂的追加注射。我们如描述于Griswold等人，关节炎&风湿病 31(11)：1406-1412(1988)对各小鼠爪中关节炎症状的严重性进行了分 级。简言之，我们基于涉及的关节数及红斑及肿胀程度对肘或膝远端 的骨端关节损伤在0～4的尺度上进行了分级。关节炎分值计算为各动 物的全部4爪的分值的和。CCR6野生型动物发展关节炎，而CCR6-/-动物显示对疾病的强抗性(图1)。有趣的是，CCR6+/-动物也呈现的 一些水平的抗性，指示未需要CCL20功能的总废除来抵抗关节炎表 型。
此外，我们在CD3-阳性T-细胞或F4/80-阳性巨噬细胞的存在下 免疫组织化学地分析了小鼠的后爪。在第43天，将小鼠收获及将它们 的后爪在福尔马林中固定。然后将爪切片及放置在载玻片上。在爪样 品脱钙之后，将载玻片用抗-CD3(#N1580，DAKO)和F4/80抗体(克 隆CI：A3-1，AbD Serotec)免疫组织化学地染色。染色强度由2个独 立观察者通过用Aperio仪器(Aperio Technologies)扫描样品来评分。 评分尺度如下：0，正常；1，全部爪轻染色或在一指强染色；2，在多 指中等染色；3，在多指强染色或全部中等染色；4，全部指和爪强染 色。浸润CIA-诱导的损伤的T细胞(图2)和巨噬细胞(图3)数在 CCR6+/-及CCR6-/-小鼠中均强烈减少。
我们也在二硝基氟苯(DNFB)-诱导的过敏性接触性皮炎小鼠模型 中研究了敲除CCR6的效应。将各6只小鼠的2组(CCR6野生型小 鼠1组和1组CCR6缺陷)通过在剃净的腹上将25μl的0.4％DNFB 溶液(在4∶1丙酮∶橄榄油中)刷连续2天(第0和1天)来致敏。在 第5天，将小鼠通过将20μl的0.1％DNFB(在4∶1丙酮∶橄榄油中) 应用到一只耳的一侧来再攻击。作为水肿的指标，在DNFB攻击之前 及在第5天在最后攻击之后24小时通过使用厚度测量仪测量耳厚度。 CCR6缺陷小鼠展示了在用DNFB处理之后几乎无增加的耳厚度，指 示针对DNFB-诱导的接触超敏反应的抗性(图4)。
这些数据支持自身免疫/炎性病症中CCR6和CCL20的作用。
【实施例2：由仓鼠抗-小鼠CCL202F5-5MAb的CCL20-诱导的 趋化性的抑制】
为了进一步探索CCL20作为潜在治疗靶的作用，我们使用仓鼠 抗-小鼠CCL20抗体(2F5-5)实施了实验。我们首先表征了2F5-5 MAb 结合小鼠，人和恒河猴CCL20的能力。各物种的可溶性CCL20-分泌 的碱性磷酸酶(SEAP)抗原如下制备。将编码人，短尾猴，恒河猴， 大鼠和小鼠的CCL20的cDNA扩增及亚克隆进自Invitrogen购买的 pcDNA3.1(+)dSalI SEAP载体，其含有SEAP cDNA及其SalI位点 已删除(pcDNA 3.1(+)；SEAP cDNA源于pSEAP-增强子载体， Clontech)。将表达载体转染进人胚胎肾细胞系HEK293EBNA (HEK293E，Invitrogen)。在转染前日用补充10％胚胎牛血清的 DMEM(Invitrogen)接种HEK293E细胞。在转染日，将培养基用 OPTI-MEM II血清游离的培养基(Invitrogen)取代。通过使用转变 LT1(TAKARA Bio Inc.，志贺，日本)根据生产商的流程转染表达载 体。在以5％CO2和37℃进行3天的温育之后，收获培养上清液。各 培养物中CCL20-SEAP的浓度通过使用大EscAPe SEAP化学发光试 剂盒2.0(Clontech)测量。
我们然后实施了表面等离子体共振(BiacoreTM)结合研究以测量 2F5-5MAb与小鼠，人，恒河猴和短尾猴CCL20-SEAP抗原的结合。 使用标准NHS/EDC胺偶联过程将抗-SEAP(单克隆抗-小鼠胎盘碱性 磷酸酶，Thermo Scientific，Cat#MAI-19354，Lot#KL12748M)固定 在CM5传感器芯片(GE Healthcare)上。将SEAP-标记的小鼠CCL20 (上清液中100nM，ID735，Lot#091130)用含有0.005％吐温-20的 TBS-P稀释至5nM及捕获在CM5传感器芯片上。将TBS-P中的 0.2nM～80nM稀释的仓鼠抗-小鼠CCL20(2F5-5，Lot#060215， 2mg/ml)以30μl/min的流速注射到传感器芯片上。将仓鼠抗-小鼠 CCL20与小鼠CCL20的结合和解离分别监测4min和16min。在注射 之间使用10mM甘氨酸，pH2.25再生芯片表面。通过减去仓鼠抗-小 鼠CCL20注射到参照细胞，无捕获的小鼠CCL20和TBS-P注射到捕 获的小鼠CCL20上，由此双参考感观图。通过使用BIAevaluation软 件(GE Healthcare，3.2版)中的1∶1 Langmuir结合模型分析感观图。 在此测定中，2F5-5 MAb以32pM的亲和性结合小鼠CCL20，但不结 合于人，恒河猴或短尾猴CCL20(表1)。
表1：CCL20直系同原物中的2F5-5MAb结合亲和力
为了测试2F5-5 Mab对CCL20功能的效应，我们使用体外趋化 性测定评价了其针对小鼠CCL20的中和活性。将CCR6转导的 B300.19细胞和重组小鼠CCL20(1nM)加入转孔培养板。4小时后， 由荧光-活化的细胞分选(FACS)对迁移进更低室的细胞计数。2F5-5 MAb以1μg/ml完全抑制趋化性，估计的IC50值是0.04μg/ml(0.27nM) (图5)。相反，对照仓鼠抗体(10μg/ml)未抑制趋化性(100％对 照；数据未显示)。
【实施例3：小鼠抗-CCL20 MAbs的人源化】
为了获得针对人CCL20的单克隆抗体，我们产生了一组小鼠抗- 人CCL20抗体。用弗氏完全佐剂(Mitsubishi-Kagaku Yatron， RM606-1)乳化的重组人CCL20(R&D，#360-MP-025/CF，17.5μg/头) 皮下注射进小鼠足垫。然后每3天施用2次连续注射。在最终免疫之 后3天，将动物处死及将腹股沟淋巴-节细胞与P3U1骨髓瘤细胞以 2∶1～10∶1比在50％聚乙二醇的存在下融合。然后在96-孔塑料板中培 养细胞。
夹层ELISA用于初步筛选。将96-孔板用多克隆抗-人IgG抗体 (Jackson，#709-005-149，PBS(-)中2μg/ml)包被。于4℃过夜温育 后，将孔用1×阻断-Ace(Dainippon Sumitomo Pharma，UK-B80)于 室温阻断1小时。孔然后用0.02％吐温20/PBS(-)洗涤，之后将0.02％ 吐温20/PBS(-)中的1nM人CCL20-hIgG Fc嵌合体蛋白添加到孔 (50μl/孔)。在于室温温育1小时之后，如上述进行3次另外的洗涤。 然后将自各杂交瘤的培养上清液用0.02％吐温20/PBS(-)中的20％ FBS和200μg/ml人IgG(Mitsubishi Welpharma)稀释2倍，添加到 孔，及于室温温育1小时。在3次进一步洗涤之后，将孔与缀合了辣 根过氧化物酶的抗-小鼠IgG抗体(Jackson，#715-035-150，用0.02％ 吐温20/PBS(-)稀释5000倍)于室温温育1小时。然后将孔洗涤3 次及在TMBZ(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)溶液中温育15～30分钟。然 后添加等同体积的2M H2SO4以停止反应，及在450nm处由ARVO (PerkinElmer)进行光密度读数。夹层ELISA鉴定了24个阳性孔。
我们然后作为二级筛选实施了趋化性测定。趋化性测定在转孔培 养板(MultiScreen孔隙5μm，Millipore，#MAMIC 5S10)中实施。首 先，将在趋化性缓冲剂(在RPMI1640(Invitrogen)中0.5％BSA，0.5％ FBS，20mM HEPES(pH7.4)，50μM 2-巯基乙醇)中的50μl/孔的 300ng/ml重组人CCL20(R&D，#360-MP-025/CF)在更低板孔中与 自杂交瘤的100μl/孔的培养上清液于室温预温育30分钟(最终CCL20 浓度100ng/ml)。在30分钟之后，将用人CCR6(SEQ ID NO：104) (2×105细胞/75μl)转染的B300.19细胞应用于上孔及在5％CO2温育 器中于37℃温育4小时。温育后，自更低孔收获150μl及用50μl的 4％PFA/PBS(-)固定。将30μl的各样品应用于FACSCantoII细胞 分析仪(BD Biosciences)以计数迁移的细胞。中和活性见于4孔。
我们然后使用了标准有限稀释以自4阳性孔获得杂交瘤克隆。我 们使用体外趋化性测定确认了自各克隆的上清液的中和活性。由这些 克隆产生的小鼠抗-人CCL20单克隆抗体中的3种(抗体36F7C10(表 2)，42G5B10(表3)，及40～1C10B9(表4))展示了针对人CCL20 的中和活性。
表2：36F7C10的氨基酸和核苷酸序列
表3：42G5B10的氨基酸和核苷酸序列
表4：40-1C10B9的氨基酸和核苷酸序列
然后使用36F7C10，42G5B10和40-1C10B9小鼠抗体产生人源化 的抗体重和轻链。人源化方法涉及将根据Kabat编号由Kabat和/或 Chothia定义方法鉴定的小鼠互补决定区(CDR)移植进代表与CDR 所来源的原小鼠序列最佳框架匹配的人重和轻链种系序列(图6A～ C；加粗表示小鼠抗体和人种系序列之间不同的残基；加下划线及加 粗表示移植的小鼠CDR；斜体及加粗表示用对应小鼠抗体残基取代 的框架残基；及加下划线，斜体表示及加粗表示用对应人种系残基取 代的CDR残基)。通过使用IgBlast数据库，根据描述于Altschul等 人，Nucl.Acids Res.25：3389-3402(1997)的方法鉴定框架匹配。为 了衍生替代性的人源化的链形式，我们使用的2种方法：(1)3D建 模技术，预测在框架之内与CDR残基相互作用的关键鼠残基，及2) 序列比对，鉴定紧邻规范CDR序列的鼠残基。
将人源化的序列构建入表达载体及转染进哺乳动物细胞系(例如， HEK293E细胞(Invitrogen))用于抗体产生。然后在功能和生理化 学测定中表征由此过程获得的抗体。
【实施例4：展示人源化的抗-人CCL20 Abs的中和活性的体外 趋化性测定】
我们通过使用CCR6-转导的B300.19细胞实施体外趋化性测定鉴 定了活跃地中和人CCL20配体的人源化的抗体。确定IC50，IC90和 IC95值之后(图7A～C)，IC95表中展示减小的值的抗体被认为具有 显著中和活性(图7C)。在产生的14种人源化的重链和26种人源化 的轻链中，我们测试了41种组合。这些组合中的8种显示显著地中和 趋化性。这8种人源化的抗体如以下所列：
●36LK3/36HKK3
●36LK3/42HKK1
●36LK3/42HKK2
●36LK3/42HKK3
●36LK3/36HC2
●36LK3/36HC3
●36LC3/36HKK3
●36LC3/36HC2
人源化的重链HC2，HC3，36HKK3，42HKK1，42HKK2和 42HKK3，及人源化的轻链LC3和LK3的氨基酸和核苷酸序列显示 于表5～12。由这些重和轻链利用的人种系基因编码的氨基酸序列显 示于表13。
表5：人源化的抗-人CCL20抗体重链36HC2(″HC2″)的氨基 酸和核苷酸序列
表6：人源化的抗-人CCL20抗体重链36HC3(″HC3″)的氨基 酸和核苷酸序列
表7：人源化的抗-人CCL20抗体重链36HKK3的氨基酸和核苷 酸序列
表8：人源化的抗-人CCL20抗体重链42HKK1的氨基酸和核苷 酸序列
表9：人源化的抗-人CCL20抗体重链42HKK2的氨基酸和核苷 酸序列
表10：人源化的抗-人CCL20抗体重链42HKK3的氨基酸和核苷 酸序列
表11：人源化的抗-人CCL20抗体轻链LC3的氨基酸和核苷酸序 列
表12：人源化的抗-人CCL20抗体轻链LK3的氨基酸和核苷酸 序列
表13：由人种系基因编码的氨基酸序列
基于评估结果，我们选择了36LK3/36HC2(“HC2/LK3”)和 36LC3/36HC2(“HC2/LC3”)用于进一步研究。对这2种抗体，体外 趋化性测定与亲本小鼠克隆36F7C10和其嵌合形式(包含人Fc部分) 平行实施。在此测定中，我们采用了上层接种B300.19 CCR6+细胞的 和下层接种重组人CCL20配体的转孔培养板。将重组人CCL20(10nM 最终，R&D SYSTEMS)与人源化的抗-CCL20抗体于室温预温育。在 30min之后，将人CCR6-转导的鼠前-B细胞(B300.19，由东京大学的 Dr.H.川崎提供)应用于上层和使趋化性于37℃发展4小时。在温育 末，FACS用于测量迁移的细胞。然后计算对于HC2/LK3和 HC2/LC350％，90％和95％抑制性浓度(分别IC50，IC90和IC95)(表 14)。相比亲本小鼠MAb，全部人源化的抗体均未失中和活性，及 IC50值计算为约1nM。
表14：趋化性测定中HC2/LK3和HC2/LC3针对人CCL20的中 和活性(以nM)
用HC2/LK3抗体的代表性的试验的剂量应答显示于图8A～C。 描绘3次独立实验。
我们还使用代替CCR6-转导的人工细胞而使用新鲜分离的人外 周血单核细胞的经内皮迁移(TEM)测定确认了HC2/LK3和HC2/LC3 的中和活性。因为熟知CD3+CD4+CD45RO+记忆T细胞和CD19+B 细胞用CCR6-阳性细胞富集，我们在HC2/LK3和HC2/LC3抗体，以 及亲本小鼠抗体36F7C10的存在或缺失下测量了这些群的迁移的细 胞数。两种人源化的抗体(图9B和C)展示了与36F7C10可比较的 细胞迁移的剂量依赖性抑制(图9A)，提供它们的中和活性的进一步 证据。
【实施例5：人源化的抗-人CCL20 MAbs与人CCL20的结合】
为了由表面等离子体共振(BiacoreTM)测量人源化的抗体 HC2/LC3和HC2/LK3的结合亲和力，我们自瞬时-转染的HEK293F 细胞的条件培养基表达及纯化了抗体，及使用HBS-EP作为电泳缓冲 液将抗体捕获到用抗-人Fc单克隆抗体包被的CM5芯片上。我们然后 将人CCL20蛋白(R&D Systems)的几种稀释(100，20，4，0.8，0.16 和0nM)注射到包被的芯片表面，及观察了结合的CCL20的解离达 20分钟(图10A和B)。我们将结合数据全局性地拟合1∶1 Langmuir 模型。结果显示于表15及表示2次独立实验的平均值。在原代人细胞 中CCL20和其受体，CCR6之间的亲和性，已报道为500pM(Liao 等人，J.Immunol.168(10)：4871-4880(2002))；这些数据展示HC2/LC3 和HC2/LK3抗体对CCL20的亲和性相比CCR6对CCL20的亲和性 大致高10倍。
表15：本发明的人源化的抗-CCL20抗体的SPR结果
【实施例6：人源化的抗-人CCL20MAbs与趋化因子旁系同原物 的交叉反应性】
我们通过分析它们针对趋化因子组(表16)的交叉反应性使用酶 联免疫吸附测定(ELISA)就它们对人CCL20的特异性检查了 HC2/LK3和HC2/LC3。
表16：ELISA检定中使用的重组人趋化因子
用PBS(-)中的1μg/ml的重组人趋化因子包被96-孔板的孔。于 4℃过夜温育后，将孔用1×阻断-Ace(Dainippon Sumitomo Pharma， UK-B80)于室温阻断1小时。在用0.02％吐温20/PBS(-)洗涤两次 之后，我们将0.02％吐温20/PBS(-)中的50μl的10μg/ml纯化的 36F7C10，嵌合36F710，HC2/LK3或HC2/LC3添加到各孔。将孔于 室温温育1小时及如在实施例3中描述洗涤3次。然后添加缀合了辣 根过氧化物酶(HRP)的抗-小鼠IgG抗体(Jackson，#715-035-150，对 于36F7C10)或缀合了HRP的抗-人IgG Fcγ片段(Jackson， #109-035-098，用于嵌合及人源化的mAbs)(用0.02％吐温20/PBS(-) 稀释5000倍)和将孔于室温温育1小时。在洗涤5次之后，将TMBZ (3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)溶液(1％，在N，N-二甲基甲酰胺中)加入 孔及温育15～30分钟。反应通过添加等同体积的2M H2SO4停止溶液 来停止，及在450nm处由ARVO(PerkinElmer)对光密度进行读数。 如图11B所示，相比组中其他趋化因子，HC2/LK3和HC2/LC3特异 性结合人CCL20。
在这些测定中，尽管HC2/LK3针对结合板的人CCL20是反应性 的，其呈现相比小鼠36F7C10或嵌合36F7C10-hFc抗体欠有力(图 11A)。但是，HC2/LK3在ELISA测定中显示针对经His-标签锚定 的CCL20的明显和强结合(图11C)，其允许全部CCL20部分暴露 于溶剂。此可指示，HC2/LK3的CCL20表位以第1检定形式埋藏或 闭塞进用于使CCL20结合平板表面的过程中。为了避免此可能的伪 像，我们采用了游离的CCL20应用到捕获到传感器芯片上的MAbs 的BiacoreTM分析。在BiacoreTM测定中，HC2/LK3和HC2/LC3显示 与36F7C10-hFc嵌合抗体可比较的强CCL20结合(图11D)。而且， 在图11B中观察到的针对CXCL4的小反应发现在BiacoreTM测定中是 可忽略的(图11D)。
由Dereeper等人(Nucleic Acids Res.1(36)：W465-469(2008)) 的种系发生分析指示，CCL16是在序列上最接近CCL20的趋化因子， 尽管CCL20和CCL16之间的百分率同一性小于37.5％(包含成熟 CCL20肽的70个氨基酸中仅56个的同源性(SIM-Alignment Tool for protein sequences，Swiss Institute of Bioinformatics))(图12)。 我们使用BiacoreTM分析来测试是否HC2/LK3和HC2/LC3与CCL16 交叉-反应。单克隆小鼠抗-人Fc以25μl/min的流速用含有0.2mg/mL BSA的HBS-EP缓冲剂固定在CM5芯片的全部4个流动池上。随后， 将50μl的含0.2mg/ml BSA的HBS-EP缓冲剂中的嵌合，HC2/LC3 或HC2/LK3抗体的1μg/ml溶液分别注射到流动池2，3和4。然后将 150μl的含0.2mg/ml BSA的HBS-EP缓冲剂中的CCL20或CCL16 的100nM溶液(或缓冲剂单独)以40μl/min的流速注射到全部4个 流动池。之后解离20min。将流动池1(抗-人Fc抗体单独)用作全部 流动池的参照。
在这些条件下，将结合嵌合(图13A)，HC2/LC3(图13B)， 及HC2/LK3(图13B)抗体的人CCL20捕获在具有类似强度的芯片 上。相反，当通过芯片运行人CCL16时未检测到显著结合，指示尽 管CCL16是在序列上与CCL20最接近的趋化因子，CCL20和CCL16 不具有足够的同源性(＜37％，如上所述)以允许人源化的抗-CCL20 抗体与CCL16交叉-反应。
这些数据指示，HC2/LK3和HC2/LC3相比其他趋化因子特异于 人CCL20。
【实施例7：人源化的抗-人CCL20 MAbs与物种直系同原物的交 叉反应性】
我们然后测定了HC2/LC3和HC2/LK3 MAbs与自其他物种的 CCL20的交叉反应性。在CCL20直系同原物之中的氨基酸序列比对 (通过使用蛋白序列的SIM-比对工具(Swiss Institute of Bioinformatics)获得的)指示短尾猴/恒河猴和人CCL20之间的同一 性是86％，而小鼠和人CCL20之间的同源性是64％(图14；人 CCL20-SEQ ID NO：85；恒河猴CCL20-SEQ ID NO：86；短尾猴 CCL20-SEQ ID NO：87；部分小鼠CCL20-SEQ ID NO：88(整个小鼠 CCL20氨基酸序列可见于SEQ ID NO：102；残基1-27构成信号序列； 见表18))。
为了测试是否嵌合及人源化的抗体可结合于小鼠，短尾猴或恒河 猴短尾猴CCL20直系同原物，我们使用了ELISA测定，如图15中例 证。对于全部测试的CCL20直系同原物，将重组体分泌的碱性磷酸 酶(SEAP)-趋化因子融合蛋白如在实施例2中描述加工，表达及纯化。 将Nunc MaxiSorb平-底黑色平板用在50mM碳酸氢钠，pH9.4中的 1μg/ml小鼠抗-胎盘碱性磷酸酶抗体(Pierce，cat#MA1-19354)包被， 于4℃过夜。然后将板通过使用含吐温-20(PBST)含5％牛血清白蛋 白(BSA)的1×磷酸盐缓冲液于室温阻断2小时。将20nM SEAP-CCL20融合蛋白在Opti-MEM培养基(Invitrogen)中连续稀 释5倍。将嵌合及人源化的(HC2/LC3和HC2/LK3)抗体在含5％BSA 的1×PBST中稀释至1μg/ml，添加到板，及于室温温育1小时。然后 将板用含5％BSA的1×PBST洗涤3次。将山羊抗-人IgG+IgM(H+L) HRP缀合物(Jackson ImmunoResearch cat#109-035-127)稀释至 80ng/ml，添加到板，及于室温温育1小时。添加QuantaBlu荧光HRP 底物(Pierce cat#15169)用于在分子装置M5(激发325nm/发射 420nm)平板读数仪中通过测量荧光检测结合的抗体。
虽然仓鼠抗-小鼠CCL20抗体2F5-5MAb以50％64pM的有效剂 量(EC50)结合小鼠CCL20(数据未显示)，嵌合或人源化的抗-人 CCL20抗体在上述条件下均未可检测地结合小鼠CCL20或大鼠 CCL20。相反，嵌合及人源化的抗体有效结合人，恒河猴和短尾猴 CCL20(图16A～C，17A和B)。虽然对人和恒河猴CCL20的EC50呈现类似(例如，对于HC2/LC3是62和101pM，对短尾猴CCL20 的EC50对于HC2/LC3是340pM，对比人CCL20是5.4倍差异。对 于HC2/LK3见类似结果。此提示需要更大得多的浓度的抗体以达到 与和人或恒河猴CCL20结合相同的量的结合短尾猴CCL20。
【实施例8：人源化的抗-CCL20 MAbs与CCL20物种直系同原 物的交叉反应性的表面等离子体共振测定】
我们也使用了表面等离子体共振(BiacoreTM)分析测试是否 HC2/LC3和HC2/LK3可结合于小鼠，短尾猴或恒河猴短尾猴CCL20 直系同原物。将单克隆小鼠抗-人胎盘碱性磷酸酶以25μl/min的流速 固定在CM5芯片的全部4个流动池。将25μl的HBS-EP缓冲剂中的 人，恒河猴，短尾猴或小鼠CCL20-SEAP的2nM溶液注射到流动池 2，3或4。为抗体结合，将240μl的HBS-EP缓冲剂中的HC2/LC3， HC2/LK3或2F5-5MAb的0～80nM稀释物(或缓冲剂单独)以 50μl/min的流速注射到全部4个流动池。之后解离45min。将流动池 1(抗-SEAP单独)用作全部流动池的参照。用10mM甘氨酸在pH2.25 实施流动池的再生。由于对芯片的捕获容量的再生效应，自低至高浓 度依次实施抗体注射。通过使用1∶1Langmuir模型实施数据拟合。
在以上条件下，仓鼠抗-小鼠CCL20抗体2F5-5以4.9pM的(二 价)KD结合小鼠CCL20，但未显著地结合人，恒河猴或短尾猴CCL20。 相反，嵌合，HC2/LC3和HC2/LK3抗体有效结合人，恒河猴和短尾 猴CCL20(表17)。
测量的表观亲和性值在此测定中相比之前在实施例5中检测的更 高(例如在本测定中对于HC2/LC3是4.7pM，对比表3中的44pM) 由于使用的检定形式的二价(更高亲和性)性质(对比用于对于表15 中显示的数据的单价形式)。相比对于人CCL20，对于恒河猴和短尾 猴CCL20的KD值通常更高(3倍)，指示抗体更特异性结合人CCL20。 但是，与自实施例7的ELISA数据相反，我们观察到对于恒河猴和短 尾猴CCL20的结合亲和力之间无显著差异。
表17：由BiacoreTM评定结合于CCL20直系同原物的抗-CCL20 人源化的单克隆抗体
a：之前显示不结合mCCL20
b：自早先芯片的仓鼠抗-小鼠数据
【实施例9：小鼠Anti-人CCL20克隆36F7C10的表位定位】
为了测定小鼠抗-人CCL20单克隆抗体36F7C10结合的人CCL20 表位，我们使用了抗体结合保护由此保存表位的氘化的氢/氘交换方 法。如显示于图18A，我们在接近人CCL20的N-端在残基7～9，10～ 19和20～22观察到非常强扰动，其可能代表表位。在残基39～55， 56～67和61～70的接近C-端也观察到边缘保护。这些段可为表位外 周，或它们的呼吸运动可缀合于表位。在4个时间点显示各指示的氨 基酸的氘化水平：自顶部至底部，150，500，1,500和5,000s。
作为36F7C10的表位鉴定的区落入CCL20的N-端和环区之内， 其已知对于CCR6结合及信号传导关键(Malik等人，Acta Cryst F62：631～634(2006))(图18B)。源于36F7C10的嵌合及人源化的抗 体，尤其与36F7C10具有相同的重和轻链CDR1，CDR2和CDR3氨 基酸序列的抗体，或与36F7C10具有类似重和轻链CDR1，CDR2和 CDR3氨基酸序列的抗体(例如，相比36F7C10的CDR具有小于3，2 或1个氨基酸取代)预期结合相同的表位。此表位的鉴定可由此解释 36F7C10 MAb和源于其的嵌合及人源化的抗体中和CCL20活性的能 力。
【实施例10：人源化的抗-人CCL20抗体的体内趋化性测定】
为了测试是否HC2/LC3和HC2/LK3可体内抑制CCL20-诱导的 趋化性，我们利用了人CCL20可与小鼠CCR6(SEQ ID NO：106) 相互作用而诱导小鼠T细胞的趋化性的事实(图19)。我们使用了测 量小鼠T细胞向真皮内注射的人CCL20迁移的体内杂交体系统(图 20)。
将重组人CCL20(10ng/头)和媒质分别真皮内注射进测试小鼠 背部右和左侧剃净的皮肤(n＝3组)。然后将钙黄绿素-AM-标记的小 鼠脾T细胞(5×106细胞/小鼠)静脉内转移进尾静脉，同时将指示的 抗体以描述于图20的剂量注射进尾静脉。在1小时之后，通过使用立 体显微镜在真皮内注射位点对荧光阳性细胞计数。
HC2/LK3和HC2/LC3以与亲本小鼠抗体36F7C10和其嵌合形式 可比较的水平显著地抑制了向CCL20-注射的位点的细胞迁移。因为T 细胞的趋化性是炎性级联的关键步骤，此迁移的防止具有治疗自身免 疫和炎性病情的临床含义。
【实施例11：2F5-5 MAb对II型胶原-诱导的关节炎的效应】
为了进一步评价用于治疗指示的抗-CCL20抗体的使用，我们在 小鼠中使用仓鼠抗-小鼠2F5-5 MAb实施了进一步体内研究。首先， 我们评价了2F5-5在CIA小鼠(类风湿性关节炎的动物模型)中中和 CCL20-介导的趋化性的能力。CIA诱导基本上如在实施例1中描述。 在关节炎发展(关节炎评分1～3)之后，将小鼠随机化及用500μg/ 小鼠的2F5-5MAb或对照IgG抗体治疗。在两种情况中，将抗体每隔 一天静脉内施用。相比对照IgG，2F5-5MAb抑制了关节炎症状的进 一步发展(图21，22)。
我们也使用了X-射线评分来测定2F5-5 MAb对类风湿性关节炎 中常见的骨损伤的效应。评分如描述于Inoue等人，Agents Actions 39：187-194(1993)实施。简言之，基于骨质疏松症(O)，骨侵蚀(E)， 及新骨形成(N)的严重性根据X-射线像将CIA小鼠的各爪在0～3 的尺度上分级。使用的尺度是：0，无变化；1，轻微变化；2，中等变 化；及3，严重的变化。将各因素的分值相加而成骨损伤的累积X-射 线分值。相比用对照IgG治疗的小鼠，用2F5-5MAb治疗的小鼠在第 39天展示了显著地欠严重的X-射线分值(图23，24)。
我们通过分析几种生物标记使用ELISA确认了2F5-5 MAb治疗 对骨病理学的效应。将CIA小鼠免疫及用上述500μg的2F5-5或对照 IgG抗体治疗。在第2免疫之后第11或12天从小鼠制备血浆样品。 将软骨破坏的标记物，血清软骨寡聚体基质蛋白(COMP)，通过使 用动物COMP ELISA酶免疫测定试剂盒(AnaMar医疗)根据生产 商的使用说明(在本文通过引用合并)定量，除了动物血浆样品稀释 1∶20之外。因为将COMP预包被在板上，此是竞争ELISA，其中COMP 标准或含有COMP的血浆的添加导致OD450减小(图25A)。自样品 测定的原始数据显示于图25B和25C。由2F5～5MAb治疗而CIA小 鼠中COMP血清水平减少到几乎正常水平(图26)，展示2F5-5抑 制软骨破坏的能力。
因为破骨细胞的形成和分化负责RA-相关的骨质疏松症和侵蚀， 我们测量了核因子κB配体(RANKL)的破骨细胞诱导分子受体活化 物，及破骨细胞标记物诸如核因子κB(RANK)的受体活化物，酒石 酸盐抗性酸性磷酸酶(TRAP)，及组织蛋白酶K的水平作为关节炎 治疗的指标。我们由定量PCR使用自均质化的小鼠爪分离的总RNA 评价了这些标记物的mRNA表达水平。将爪在含有Trizol试剂 (Invitrogen，CA，USA)的组织裂解缓冲剂中浸没之后首先用均化器 均质化。在添加氯仿之后，将样品以14,000rpm于4℃离心15分钟以 将溶液分离为水性和有机相。将水相移出及向其添加异丙醇，之后是 以14,000rpm于4℃离心15分钟以获得RNA沉淀。将用无RNA酶 的水溶解的RNA沉淀用于RNAeasy小型试剂盒(QIAGEN，Valencia， CA，USA)以分离RNA及用DNA酶处理以移出任何DNA。从RNA 用RT反应试剂盒(RNA PCR试剂盒，TAKARA Bio，Inc.志贺，日 本)根据生产商的流程产生互补DNA(cDNA)。实施对各cDNA种 的定量实时PCR及与次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)的 持家基因的水平相比。以下正向及反向引物组用于PCR反应：
RANKL，5’-CATTTGCACACCTCACCATC-3’(SEQ ID NO： 89)及
5’-TCCGTTGCTTAACGTCATGT-3’(SEQ ID NO：90)；
RANK，5’-CGGCGTTTACTACAGGAAGG-3’(SEQ ID NO：91) 及
5’-TTCTTGCTGACTGGAGGTTG-3’(SEQ ID NO：92)；
TRAP，5’-GCTGGAAACCATGATCACCT-3’(SEQ ID NO：93) 及
5’-GGTAGTAAGGGCTGGGGAAG-3’(SEQ ID NO：94)；
组织蛋白酶K，5’-CAGTGTTGGTGGTGGGCTAT-3’(SEQ ID NO：95)及
5’-CCGAGCCAAGAGAGCATATC-3’(SEQ ID NO：96)；以及
HPRT，5’-CAGGCCAGACTTTGTTGGAT-3’(SEQ ID NO：97) 及
5’-TTGCGCTCATCTTAGGCTTT-3’(SEQ ID NO：98)。
全部引物通过使用基于网页的软件引物3(Whitehead Institute for Biomedical Research，Cambridge，MA，USA)设计以避免RNA的 非-特异性扩增。将含cDNA模板，引物，尿嘧啶DNA糖基化酶 (Invitrogen，CA，USA)和QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (QIAGEN，Valencia，CA，USA)的反应混合物用于在ABI PRISM 7700序列检测系统(Applied Biosystems，Foster，CA，USA)中的扩增 反应。表达水平由ABI PRISM 7700序列检测器软件自动定量。
在2F5-5MAb处理后，对于关节组织中的全部标记物抑制mRNA 水平(图27A和B；显示相比持家基因HPRT的表达水平的倍数变 化)，提供2F5-5体内抑制骨病理学的进一步证据。
【实施例12：2F5-5 MAb对葡萄糖-6-磷酸异构酶-诱导的关节炎 的效应】
我们测试了患葡萄糖-6-磷酸异构酶(G6PI)-诱导的关节炎的小鼠， 另一RA小鼠模型中2F5-5 MAb治疗的抗-关节炎效应。通过用在完 全弗氏佐剂中乳化的重组GST-G6PI(300μg/小鼠)真皮内致敏及在 DBA/1小鼠的尾根注射来诱导关节炎。在G6PI免疫之后6天及在关 节肿胀即将发作之前，将小鼠随机化及用500μg/小鼠的同种型-匹配的 抗体或2F5-5MAb治疗。将各小鼠的爪中关节炎症状的严重性如在实 施例1中之前描述分级。相比用同种型-匹配的抗体治疗的小鼠，用 2F5-5MAb治疗的小鼠呈现显著地更低关节炎分值，显示2F5-5相比 对照强烈抑制关节炎发展(图28)。
这些数据展示体内关节炎模型中抗-CCL20抗体处理的功效，及 提示抗-CCL20抗体的使用可有益于类风湿性关节炎的治疗。
【实施例13：2F5-5MAb对噁唑酮-诱导的特应性皮炎的效应】
我们然后评价了小鼠皮炎模型中2F5-5 MAb治疗的效应。在一模 型中，噁唑酮用于在倾向于发疾病的小鼠(NC/Nga株)中诱导特应 性皮炎。将小鼠腹部皮肤剃净及在第0，5和8天暴露于噁唑酮。在第 13天，选择显示皮炎迹象(评分2)的小鼠及用噁唑酮再次免疫。小 鼠然后在6只的组中随机化用于用2F5-5MAb或同种型-匹配的对照 IgG抗体(500μg/小鼠，每隔一天静脉内施用)处理。我们如下在盲研 究中检定了皮炎分值：各皮炎症状诸如干燥，尺度，红斑，渗出/结痂 和抓痕在0～3的尺度(0＝无，1＝轻微，2＝中等，3＝严重)上评分；然后 这些分值相加用于累积皮炎分值(如描述于Leung等人，J.Allergy Clin.Immunol.85(5)：927-933(1990))。我们通过在第13天～第18 天定量曲线下面积(“AUC”)来比较了2组之间的疾病阻遏量值。在 此皮炎模型中，2F5-5 MAb相比对照IgG诱导了疾病进展的统计学地 显著(p＜0.05)阻遏(图29)。
【实施例14：2F5-5 MAb对DNFB-诱导的过敏性接触性皮炎的 效应】
我们测试了二硝基氟苯(DNFB)-诱导的过敏性接触性皮炎，第2 小鼠皮炎模型中2F5-5 MAb治疗的效应。将小鼠分为6只的组及通过 在剃净的腹上刷25μl的DNFB溶液(丙酮∶橄榄油的4∶1溶液中的0.4％ DNFB)连续2天(第0和1天)来致敏。将1组用2F5-5 MAb处理， 而其他组用同种型-匹配的对照抗体(500μg/小鼠静脉内，在第0，2和 5天)处理。在第5天，通过将20μl的0.2％DNFB溶液(在4∶1丙 酮∶橄榄油中)应用到一只耳的一侧来再攻击小鼠。在第6天使用厚度 测量仪作为水肿的指标测量耳厚度。用2F5-5 MAb处理减少了耳厚 度，指示皮炎发展的成功的防止(图30)。
此说明书中引用的全部出版物，专利和专利申请本文通过引用并 入。尽管上述发明已在一些细节由例证方式和澄清理解的目的描述， 根据本发明的教导，制造特定变化和修饰而不离开随附的权利要求的 精神或范围对于本领域普通技术人员是显而易见的。
表18：人和小鼠CCL20和CCR6的氨基酸和核苷酸序列
表19：序列标识号
表20：人源化的和小鼠抗体序列
机译： -CCL20中和抗CCL20抗体
机译： 中和抗CCL20抗体
机译： 中和抗CCL20抗体
