大鼠用复方麻醉剂及其制备方法

摘要

本发明公开了一种大鼠用复方麻醉剂及其制备方法，属于动物复方麻醉剂的制备和应用领域。本发明首先公开了一种大鼠用复方麻醉剂，包括：右旋美托咪啶、咪达唑仑、羟考酮、缓冲液以及注射用水。本发明还公开了一种大鼠动物用复方麻醉剂的制备方法，将上述各成份溶于注射用水中，稀释，过滤，灌封于安瓿瓶内，灭菌，即得。本发明公开的大鼠用复方麻醉剂麻醉诱导迅速，麻醉维持时间长，镇痛、镇静效果良好，苏醒平稳，对大鼠的主要生理生化指标影响均在其生理耐受范围内，操作简单，可用于大鼠复杂或时间长的手术。

说明书

技术领域

本发明涉及一种复方麻醉剂，尤其涉及一种大鼠用复方麻醉剂及其制备方法，属于鼠类动物复方麻醉剂的制备和应用领域。>

背景技术

在动物实验中，选择适宜、安全、有效的麻醉方法是实验安全性及数据可靠性的重要基础。大鼠常用于药物营养代谢、内分泌、行为学、老年病学、肿瘤、感染性疾病、心血管疾病等方面的研究及手术模型的制备，而麻醉方法的不当可能引起鼠类动物机体的一系列病理生理变化，甚至致其死亡，影响整个实验的结果。>

目前国内常用的大鼠麻醉制剂有水合氯醛、乌拉坦、戊巴比妥、氯胺酮、速眠新等。水合氯醛是短效麻醉剂，10％水合氯醛的相对安全范围较小，麻醉深度较浅，肌肉松弛及镇痛效果不佳，一般不能用于复杂和耗时较长的手术过程中，单独使用时死亡率相对较高，且常需要追加剂量。乌拉坦为长效麻醉剂，在麻醉深度达外科手术要求时，对呼吸和循环无明显的抑制作用，但此药毒性大，有研究表明20％乌拉坦麻醉能使大鼠红细胞聚集性增加，故不宜用于血液流变学的相关实验，已证实乌拉坦对大鼠的血液有显著影响，本身有致癌性，故在实验动物的全身麻醉中不推荐使用该类麻醉药。戊巴比妥钠麻醉维持时间2h左右，但对视觉电生理的各种波形影响较大，同时腹腔注射对动物机体心血管、神经系统具有一定的抑制作用，机体损害较大。氯胺酮为短效麻醉剂，120mg/kg腹腔注射大鼠，麻醉维持时间仅45min左右，适用范围窄。虽然速眠新可通过控制剂量来调节麻醉维持时间，但麻醉过程中对大鼠视网膜电图的b波影响较大。>

大鼠的吸入性麻醉虽然在麻醉深度上实现了有效控制，但使用时需要通过专用麻醉设备，配以专一的吸入麻醉挥发罐。不仅手续十分繁琐，而且设备和药品十分昂贵，增加麻醉费用，目前在国内大多数实验室很难推广应用。>

目前动物麻醉发展趋势是平衡麻醉，也就是多种药物联合应用，不但可以比较好的控制麻醉深度，达到手术的需要，还可以减少单种药物的用量，减少药物蓄积，减轻药物浓度过大导致的副作用。因此，针对各种注射麻醉药物的作用特点，配制动物专用复方制剂是平衡麻醉的主要发展趋势。另外，由于动物具有野性和非驯化性，操作烦琐难免造成人畜损伤。因此，急需能一针奏效的复方麻醉剂。而最具发展前景的是平衡麻醉复方麻醉剂的研究，是动物医学麻醉领域内新的生长点，目前已有产品用于犬、鹿等动物的麻醉过程中。>

现有大鼠麻醉和保定仍然停留在上述单一药物的使用、剂量的探讨及几种药物的相互比较阶段，亟需一种新的复方麻醉制剂，解决现有的大鼠 麻醉剂在镇静、镇痛、诱导时间、麻醉维持时间等方面存在的不足以及大鼠应激性过大引起的心率过快、血压过高等突出问题。>

发明内容

本发明的目的之一是提供一种大鼠用复方麻醉剂；>

本发明的目的之二是提供一种大鼠用复方麻醉剂的制备方法。>

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：>

本发明首先提供了一种大鼠用复方麻醉剂，包括：右旋美托咪啶、咪达唑仑、羟考酮、缓冲液及注射用水；>

其中，所述的缓冲液优选为pH7.0的磷酸盐缓冲液。>

本发明首先将应用于动物的多种具有麻醉效果的组分进行随机组合，通过对大鼠麻醉的对比试验，综合分析各种组合的麻醉诱导期、麻醉期、苏醒期、镇静、镇痛、肌松效果以及呼吸、脉搏、体温等生理指标；通过大量的筛选实验结果发现，由右旋美托咪啶、咪达唑仑和羟考酮组成的复方制剂的麻醉效果明显优于其它各种组合的麻醉效果。因此，本发明确定了以右旋美托咪啶、咪达唑仑和羟考酮作为大鼠用的复方麻醉制剂的主要组分。>

右旋美托咪啶是一种新型高选择性α₂肾上腺素能受体激动剂，其激活蓝斑核α₂受体，而蓝斑核是脑内α₂A受体最密集的区域，是大脑内负责调解觉醒与睡眠的关键部位，因而产生自然非动眼睡眠(NREM)，发挥镇静、抗焦虑作用。而右旋美托咪啶对呼吸抑制轻微，其代谢受肾功能影响小，代谢产物没有活性。右旋美托咪啶有中度的镇痛作用，同时其具有的镇静、减少应激反应、与阿片类药物的协同作用等，可以减少围术期阿片类药物的用量。快速给予负荷剂量的1μg/kg右旋美托咪啶，直接激活血管平滑肌内的α₂A受体，产生血管收缩，可引起短暂的高血压，反射性地降低心率。右旋美托咪啶可迅速加深全身麻醉，麻醉速度加快，有其特异性拮抗药，便于调节全身麻醉深度，可控性好于大多数全身麻醉药。咪达唑仑麻醉诱导后，心率变异性(HRV)各成分均降低，血浆中去甲肾上腺素(NA)的浓度明显降低，在针对其应激性与右旋美托咪啶具有较好的协同作用。静注咪达唑仑可导致血压下降，直接抑制心肌、扩张外周血管及影响自主神经。右旋美托咪啶对心率、血压的影响也较明显。二者在减缓麻醉期实验动物心率的影响中具有协同作用。羟考酮是从生物碱蒂巴因(Thebaine)中提取的半合成阿片类药物，作为强效镇痛药在临床上应用已有80多年的历史。由于羟考酮生物利用度高，给药途径多，因而在医学临床上应用广泛，在动物麻醉方面很少使用该药。>

在确定了以右旋美托咪啶、咪达唑仑和羟考酮作为大鼠用复方麻醉制剂的主要组分的基础上，本发明对右旋美托咪啶、咪达唑仑和羟考酮的用量以及复方麻醉剂的缓冲盐体系进行进一步的优化和筛选。>

本发明对右旋美托咪啶、咪达唑仑和羟考酮的用量筛选获得麻醉效果 较好的3个用量组合，作为组方1、2和3。>

其中，组方1中各组分及含量为：每100mL所述复方麻醉剂中，右旋美托咪啶的含量为15mg，咪达唑仑的含量为135mg，羟考酮的含量为6.5mg。>

组方2中各组分及含量为：每100mL所述复方麻醉剂中，右旋美托咪啶的含量为15mg，咪达唑仑的含量为145mg，羟考酮的含量为7.5mg。>

组方3中各组分及含量为：每100mL所述复方麻醉剂中，右旋美托咪啶的含量为15mg，咪达唑仑的含量为135mg，羟考酮的含量为7mg。>

实验结果发现，虽然组方3在镇静和肌松方面与组方1和2没有明显的差别，但在镇痛效果方面组方3显著优于组方1和2。由此确定最佳处方为组方3，即每100mL所述复方麻醉剂中，右旋美托咪啶的含量为15mg，咪达唑仑的含量为135mg，羟考酮的含量为7mg。>

因此，为了达到更佳的麻醉效果，每100mL所述复方麻醉剂中，各组分的含量优选为：每100mL复方麻醉剂中，右旋美托咪啶15mg，咪达唑仑135mg，羟考酮7mg；或者每100mL复方麻醉剂中，各组分的含量为：右旋美托咪啶15mg，咪达唑仑135mg，羟考酮6.5mg；或者每100mL复方麻醉剂中，各组分的含量为：右旋美托咪啶15mg，咪达唑仑145mg，羟考酮7.5mg。>

在配制复方麻醉剂时，采用不同缓冲盐体系，其麻醉效果(包括镇静、肌松、镇痛等)存在较大的差异，本发明优化、筛选了不同的缓冲液，最终发现，采用pH7.0的磷酸盐缓冲液配制的麻醉剂在镇静、肌松或镇痛等麻醉效果上要明显优于其它的缓冲液。因此，本发明采用pH7.0的磷酸盐缓冲液配制复方麻醉剂；其中，所述的pH7.0的磷酸盐缓冲液包括：磷酸二氢钾和氢氧化钠；优选的，每100mL复方麻醉剂中：磷酸二氢钾的含量为680mg，氢氧化钠的含量为116.4mg。>

本发明还对是否加入阿托品及加入时间进行了实验，结果发现，与复方麻醉剂的主要组分同时注射阿托品后可增强麻醉过程中的镇痛效果，还可以有效地改善复方麻醉制剂对大鼠心率和血压的不良影响。最终确定阿托品和复方麻醉剂的主要组分同时加入，剂量为0.14mg/kg，即每100mL复方麻醉剂中阿托品的含量为14mg。>

阿托品属于节后抗胆碱药，阻断毒蕈碱型受体，有研究表明阿托品可以使烟碱对心率增加的作用有所降低，其原因可能是阿托品阻断了烟碱刺激心脏交感神经末梢释放乙酰胆碱。本发明选用阿托品作为辅助药，是因为该药对动脉压影响极微小，对心率的影响也远较肾上腺素缓和。它最明显的作用是对心率的影响，此作用有时表现为“双相反应”，即给药后最初可出现短暂的心率减慢，然后心率增速。其增速作用与原来的心率水平呈负相关，利用此作用来缓和右旋美托咪啶对心率降低幅度，起到保护动物机体的作用。>

其中，本发明中所述的鼠类动物优选为大鼠。>

本发明提供了一种制备所述鼠类动物用复方麻醉剂的方法，该方法包括：将右旋美托咪啶、咪达唑仑、羟考酮、缓冲液溶于注射用水中，稀释，过滤，灭菌，即得。>

本发明还提供了一种制备所述鼠类动物用复方麻醉剂的方法，该方法包括：将右旋美托咪啶、咪达唑仑、羟考酮、阿托品、缓冲液依次溶于注射用水中，稀释，过滤，灌封于安瓿瓶内，灭菌，即得。>

本发明的动物用复方麻醉剂能够应用于动物尤其是大鼠的制动和麻醉。>

本发明的动物用复方麻醉剂与现有的动物麻醉剂相比具有以下优点：>

1、麻醉诱导时间为6.35±2.28min，麻醉维持时间为130.23±57.22min，苏醒时间为33.28±17.05min。显示本复方麻醉剂麻醉诱导迅速平稳，麻醉维持时间长，苏醒平稳，无异常表现(兴奋、复睡等)。>

2、对主要生理参数的影响：注射本复方麻醉剂对正常体温有一定影响，表现为注射后体温开始下降并持续维持低温状态。心率在注药后7.5min时与基础值相比，显著降低，使用阿托品可以有效缓解心率的过度降低和心律不齐等。呼吸频率注药后呈轻微下降趋势，单因素方差分析差异不显著，持续到麻醉120min后基本恢复正常水平。血氧饱和度表现为初期下降，到注药后20min降至最低，后逐渐恢复并接近正常水平，整个麻醉过程中血氧饱和度均在93％以上。血压在注药后开始升高，到10min以后维持高血压状态，40min后逐渐降低，80min后血压与0min差异性均不显著(p>0.05)。注射本复方麻醉剂对主要生理指标影响在其生理耐受范围内。>

3、对肝肾功能的影响：ALT、AST、ALP、TBIL、BUN、CREA、CHOL等反映肝肾功能的主要生化指标，在麻醉过程中未发生显著的变化(p>0.05)。>

4、操作简单，腹腔注射，用于快速诱导麻醉；麻醉维持时间较长，镇痛、镇静效果良好，可用于复杂或时间长的手术，苏醒时间较快。>

附图说明

图1为三种处理下心率平均数随时间变化趋势；纵轴代表心率(次/min)，横轴代表时间点(min)。>

图2为三种不同处理下平均动脉压(MAP随时间变化趋势；纵轴代表血压变化，横轴代表时间点(min)。>

图3为阿托品不同剂量下收缩压平均数随时间变化趋势；纵轴代表血压变化，横轴代表时间点(min)。>

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随 着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。>

实施例1 复方麻醉剂的制备>

复方麻醉剂中各组分及含量为：每100mL复方麻醉剂中各组分的含量为右旋美托咪啶15mg，咪达唑仑135mg，羟考酮7mg，磷酸二氢钾680mg，氢氧化钠116.4mg，余量为注射用水。>

复方麻醉剂的制备方法，包括以下步骤：将右旋美托咪啶、咪达唑仑、羟考酮、磷酸二氢钾、氢氧化钠依次溶于注射用水中，再加入注射用水稀释，过滤，灌封于安瓿瓶内，经高压灭菌，即得。>

实施例2 复方麻醉剂的制备>

复方麻醉剂中各组分及含量为：每100mL复方麻醉剂中各组分的含量为右旋美托咪啶15mg，咪达唑仑135mg，羟考酮7mg，阿托品14mg，磷酸二氢钾680mg，氢氧化钠116.4mg，余量为注射用水。>

复方麻醉剂的制备方法，包括以下步骤：将右旋美托咪啶、咪达唑仑、羟考酮、阿托品、磷酸二氢钾、氢氧化钠依次溶于注射用水中，再加入注射用水稀释，过滤，灌封于安瓿瓶内，经高压灭菌，即得。>

实施例3 复方麻醉剂的制备>

复方麻醉剂中各组分及含量为：每100mL复方麻醉剂中各组分的含量为右旋美托咪啶15mg，咪达唑仑135mg，羟考酮6.5mg，余量为注射用水。>

复方麻醉剂的制备方法，包括以下步骤：将右旋美托咪啶、咪达唑仑、羟考酮依次溶于注射用水中，再加入注射用水稀释，过滤，灌封于安瓿瓶内，经高压灭菌，即得。>

实验动物>

SD大鼠180只，2-2.5月龄，雌雄各半，体重258±23g，由黑龙江省中医药大学实验动物中心提供，在同一条件下饲养4周进行试验，整个试验过程中饲养管理条件保持一致。>

SJL品系小白鼠60只，1月龄，雌性，体重22±3g，由哈尔滨医科大学实验动物中心提供，同一条件下饲养2周后进行实验。>

白兔4只，1月龄，雌雄不限，体重分别为1.8kg和2.1kg，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，同一条件下饲养2周后进行实验。>

实验例1复方麻醉剂的组分及用量筛选实验>

一、复方麻醉剂的药物种类初步筛选实验>

(一)实验方法>

1.镇静效果监测及评价标准>

大鼠麻醉后，分别观察用药后5min、10min、20min和30min时的镇静效果。观察眨眼、耳动、躯体动、头颈动、尾动。>

对声音刺激反应明显，如给药前，记“+”；对声音刺激反应迟钝，记“±”；对声音刺激无反应，记“－”。>

评分方法：“+”计0分，“±”计1分，“－”计2分。>

2.镇痛效果监测及评价标准>

主要通过针刺鼻唇部、躯干、四肢上部、爪部、尾部进行评价。>

针刺各部疼痛反应明显，记“+”；疼痛反应迟钝，记“±”；疼痛反应消失，记“－”。>

评分方法：“+”计0分，“±”计1分，“－”计2分。>

3.肌松效果监测及评价标准>

观察头颈部、尾、四肢、咬肌和腹壁肌肉松弛程度。>

用镊子夹尾提起时如出现回头和转身反应、四肢出现明显滑动，刺激四肢尚能爬行，记“+”；夹尾提起时出现转头、同时四肢轻度滑动，记“±”；无回头和转身反应，记“－”。>

夹耳提起时如尾可弯曲至水平位置或上翘时，记“+”；如尾出现弯曲反应，记“±”；尾自然下垂，记“－”。>

用镊子夹住耳朵提起，如四肢出现挣扎，记“+”；四肢轻度滑动，记“±”；四肢自然下垂，记“－”。>

夹耳提起时如后腹部无明显变化，记“+”；后腹部略有膨大松弛，记“±”；后腹部明显膨大松弛，记“－”。>

咬肌松弛轻拉上、下颌，口腔可顺利打开，记“+”；口腔可打开，但很快可恢复者，记“±”；不能够打开或打开后立即恢复者，记“－”。>

评分方法：“+”计0分，“±”计1分，“－”计2分。>

(二)实验结果>

表1中的实验结果为20min时(此时麻醉效果较为稳定)每组中所有试验动物的得分总和(单项最高分值为20只×10分＝200分)。>

表1 注药后20min大鼠麻醉效果观察(n＝20)>

通过表1先优选出右旋美托咪啶作为主药进入下一步试验。>

表2 注药后20min大鼠麻醉效果观察(n＝20)>

通过表2可以看出右旋美托咪啶+芬太尼和右旋美托咪啶+羟考酮的效果最好，但是综合分析药物的成本、成瘾性、毒副作用及药物管制程度等因素，则选出右旋美托咪啶+羟考酮进入下一步实验。>

表3 注药后20min大鼠麻醉效果观察(n＝20)>

通过表3可以看出右旋美托咪啶+芬太尼+咪达唑仑效果最好，特别是在镇痛方面效果尤佳，因此选出右旋美托咪啶+羟考酮+咪达唑仑作为复方麻醉剂的主要成分。>

通过对大鼠麻醉的对比试验，综合分析各种组合的麻醉诱导期、麻醉期、苏醒期，镇静、镇痛、肌松效果以及呼吸、脉搏、体温等生理指标，发现由右旋美托咪啶、咪达唑仑和羟考酮组成的复方制剂明显优于其他各种组合，因此暂定以右旋美托咪啶、咪达唑仑和羟考酮作为复方麻醉制剂的主要成分。>

二、复方麻醉剂各组分的用量比例探索实验>

(一)药物剂量初步筛选实验方法>

(1)不同药物ED₅₀的测定>

实验设计按等比级数安排药物剂量，使相邻两剂量对数差为0.05。实验从估计最可能接近ED₅₀的剂量开始，通过预实验反复探索，发现可能接近ED₅₀的剂量，然后将各组方药液稀释至15mL，保证中间给药剂量在0.010～0.015mL/g范围内，保证ip给药剂量在要求范围之内。实验过程中按照序贯法原则一只一只地进行，当一只大鼠出现阳性反应(翻正反射消失)则下一只大鼠就用低一级的剂量，相反，当出现阴性反应时则用高一级的剂量。从第一次反应符号改变时开始统计实验动物数(部分结果见表4)。>

(2)不同组方LD₅₀的测定>

组合方剂LD₅₀的测定方法与ED₅₀的测定大致相同，区别在于测定LD₅₀所观察的阳性指标为死亡。>

表4 不同药物ED₅₀和LD₅₀的测定>

(3)麻醉效果评分方法>

具体实验方法参见上述“复方麻醉剂的药物种类初步筛选实验”中的实验方法。>

(二)实验结果>

由表4的测定方法确定右旋美托咪啶、咪达唑仑和羟考酮三种药物ED₅₀为0.18mg/kg、1.00mg/kg、0.07mg/kg。以此作为药物组合水平1，之后增加20％和40％的使用剂量，并分别按三因素三水平测定各种组合的麻醉效果，具体结果见表5和表6。>

表5 因素水平表>

表6 小白鼠麻醉效果评分(三种药物复合注射后20min进行评分，n＝20)>

注：数据比较肩标不同大写字母表示差异显著(P＜0.05)；肩标相同大写字母表示差异不显著(P＞0.05)。>

用由右旋美托咪啶、咪达唑仑和羟考酮组成的不同组合对大鼠进行腹腔注射，观察生物反射、镇静、镇痛、肌松等情况，对不同组合的麻醉作用进行综合分析和评价，初步筛选出以右旋美托咪啶、咪达唑仑、羟考酮作为复方制剂的组分，并且拟定三者初步用药量为0.20mg/kg、1.4mg/kg、0.07mg/kg。>

三、正交试验>

按照三因素三水平正交试验设计原则并结合预试验中麻醉效果的观察进行设计。复方麻醉制剂中的3个因素为右旋美托咪啶、咪达唑仑、羟考酮，3个水平为高、中、低(表7)。根据正交表L9(3³)将小白鼠随机分为9个试验组，根据统计学标准和药理设计中的样本选择原则，每个试验组选择小白鼠30只，腹腔注射0.01mL/g，根据正交表分析各药物组分对麻醉效果的影响。>

表7 因素水平表>

小白鼠麻醉后30min内翻正反射消失达1min以上者判定为阳性。>

由表8可知：右旋美托咪啶在低剂量时效果优于中、高剂量；咪达唑仑在低剂量时效果优于高、中剂量；羟考酮在中剂量时效果优于高、低剂量。比较分析实验结果，确定最佳组合为：右旋美托咪啶0.15mg/kg，咪达唑仑1.35mg/kg，羟考酮0.07mg/kg。>

表8 小白鼠正交实验结果(n＝30)>

注：*表示每列三水平单药效果中最大值，E1、E2、E3为该药低、中、高水平的药效之和。>

选择表8中的翻正反射效果最好的实验组别1、组别3分别作为组方1和组方2，将最佳组合(右旋美托咪啶0.15mg/kg，咪达唑仑1.35mg/kg，羟考酮0.07mg/kg)作为组方3进入下一步正交决定性验证实验。>

四、正交决定性验证实验>

1 实验方法>

将实验动物SD大鼠随机分为3组，即组别1、组别2和组别3；每组20只；组别1、组别2和组别3分别用按组方1配制的复方麻醉剂1、按组方2配制的复方麻醉剂2和按组方3配制的复方麻醉剂3进行麻醉(给药的用量、途径和时间等完全相同)，分别观察各组大鼠麻醉给药后的镇静、镇痛、松肌效果。>

其中，组别1采用的复方麻醉剂1的组成为：每100mL所述复方麻醉剂中，右旋美托咪啶的含量为15mg，咪达唑仑的含量为135mg，羟考酮的含量为6.5mg；>

组别2采用的复方麻醉剂2的组成为：每100mL所述复方麻醉剂中，右旋美托咪啶的含量为15mg，咪达唑仑的含量为145mg，羟考酮的含量为7.5mg；>

组别3采用的复方麻醉剂3的组成为：每100mL所述复方麻醉剂中，右旋美托咪啶的含量为15mg，咪达唑仑的含量为135mg，羟考酮的含量为7mg。>

2 实验结果>

实验结果见表9；从表9的实验数据可以看出，虽然按组方3配制的复方麻醉剂3在镇静和肌松方面与按组方1和2配制的复方麻醉剂没有特别显著的差别，但在镇痛方面，按组方3配制的复方麻醉剂3要显著优于按组方1和2配制的复方麻醉剂1和2，组方3比组方1和组方2分别高出了16.8％和16.3％。由此确定最佳处方为组方3。组方3各组分及含量为：每100mL所述复方麻醉剂中，右旋美托咪啶的含量为15mg，咪达唑仑的含量为135mg，羟考酮的含量为7mg。>

表9 大鼠麻醉效果观察(n＝20)>

实验例2 复方麻醉剂的缓冲盐体系筛选实验>

1、实验方法>

1.1 实验分组、含缓冲盐复方麻醉剂的配制>

DZ组：灭菌生理盐水1000ml。>

JS组(枸橼酸盐缓冲液pH6.2)：取2.1％枸橼酸水溶液，用50％氢氧化钠溶液调节pH值至6.2，即得。>

枸橼酸--磷酸氢二钠缓冲液(pH4.0)。>

甲液：取枸橼酸21g或无水枸橼酸19.2g加水使溶解成1000ml，置冰箱内保存。>

乙液：取磷酸氢二钠71.63g，加水使溶解成1000ml。取上述甲液61.45ml与乙液38.55ml混合摇匀，即得。>

BL组(巴比妥-氯化钠缓冲液pH7.8)：取巴比妥钠10.1g，加氯化钠7.4g及水适量溶解，另取明胶1g加水适量，加热溶解后并入上述溶液中。然后用0.2mol/L盐酸溶液调节PH值至7.8，再加水稀释至1000ml，即得。>

LS组(磷酸盐缓冲液，pH7.0)：取磷酸二氢钾6.8g加0.1mol/L氢氧化钠溶液291ml，用水稀释至1000ml，即得。>

用注射用水和上述缓冲盐体系配制复方麻醉剂。>

复方麻醉剂各组分及含量为：每100mL复方麻醉剂中各组分的含量为右旋美托咪啶15mg，咪达唑仑135mg，羟考酮7mg。>

复方麻醉剂的制备方法，包括以下步骤：将右旋美托咪啶、咪达唑仑、羟考酮依次溶于缓冲盐体系中，充分振荡混匀，再加入注射用水稀释，过滤，灌封于安瓿瓶内，高压灭菌，既得。避光保存于4℃。>

将40只小白鼠随机均分为4组，即DZ、LS、JS和BL组，每组腹腔注射相 应组缓冲盐体系配制的复方麻醉剂0.01mL/g，之后进入麻醉效果监测实验。>

1.2 小白鼠的麻醉效果监测>

1.2.1 镇静效果监测>

小白鼠麻醉后，分别观察用药后5min、15min、30min和60min时的镇静效果。观察眨眼、耳动、躯体动、头颈动、四肢及尾动。>

1.2.2 镇痛效果监测>

小白鼠麻醉后，观察用药后5min、15min、30min和60min时的镇痛效果。主要通过针刺鼻唇部、躯干、四肢上部、爪部、尾部进行评价。>

1.2.3 肌松效果监测>

小白鼠麻醉后，观察用药后5min、15min、30min和60min时的肌松效果。观察头颈部、尾、四肢、咬肌和腹壁肌肉松弛程度。>

镇静效果、镇痛效果和肌松效果评价标准同实验例1中正交决定性验证实验。>

小白鼠麻醉后30min内翻正反射消失达1min以上者判定为阳性，根据以上标准进行评价，参考镇静、镇痛和肌松效果的均衡性进行麻醉效果的综合评定。>

1.3 刺激性试验>

1.3.1 肌注刺激性试验>

取健康白兔4只，分别于一侧股四头肌处，注入各组注射用水或缓冲盐体系作为溶剂配制的复方麻醉剂lmL，另一侧相应部位同法注入等体积灭菌生理盐水作为对照。48h后，放血处死白兔，解剖后取出股四头肌，纵向切开，观察注射部位的肌肉束刺激反应，并按表4换算成相应的反应分值。>

表10 肌注刺激性试验判定标准>

1.3.2 滴眼刺激性试验>

取健康白兔4只，保定，检查两眼，无异常者可用于试验。轻轻打开上、下眼睑，将各组药液和生理盐水各2滴分别滴入到左、右眼结膜囊中，两眼滴入药量应相等，然后轻合眼睑约2～3s，以防药液流出影响试验结果。观察两侧眼给药与生理盐水后10、20、30、60、90和120min时眼结膜的变化。>

2、实验结果>

2.1 小白鼠的麻醉效果监测>

小白鼠的麻醉效果结果见表11，表12，表13和表14，可以看出，在麻醉前期(注药后5min)、麻醉中期(注药后15min和30min)，LS组小白鼠 麻醉效果最好，镇静、肌松、镇痛效果明显优于其他三组(P＜0.05)。在麻醉后期(注药后60min)，LS组的镇静、镇痛效果明显优于其他三组(P＜0.05)。>

表11 小白鼠注药5min后麻醉效果的观察(n＝10)>

注：组间比较，数据肩标字母不同表示差异显著(P＜0.05)。>

表12 小白鼠注药15min后麻醉效果的观察(n＝10)>

注：统计分析标记同表9。>

表13 小白鼠注药30min后麻醉效果的观察(n＝10)>

注：统计分析标记同表9。>

表14 小白鼠注药60min后麻醉效果的观察(n＝10)>

注：统计分析标记同表9。>

2.2 刺激性试验>

肌注刺激性试验结果显示，四组注药点与对侧生理盐水注射点无差异，注药点肌肉色泽正常，4只家兔的反应分值均被评为0分。说明不同缓冲盐体系的复方麻醉剂符合规定标准，可供肌肉注射。>

滴眼刺激性试验结果显示，四组点眼后，只有JS和BL组10min时，眼结膜呈现轻度潮红，有流泪倾向。25min时，球结膜开始出现潮红、充血，并表现轻度羞明、流泪现象。至40min时，潮红已消退，眼结膜色泽基本上恢复至用药前状态，未见其它异常。LS组和对照DZ组则在整个观察期内，未见球结膜有异常变化。>

综合以上结果，确定最佳缓冲盐体系为LS组(磷酸盐缓冲液，pH7.0)，作为缓冲体系配制复方麻醉剂。>

实验例3 本发明复方麻醉剂对大鼠的麻醉效果观察>

1、供试麻醉剂>

复方麻醉剂包括：右旋美托咪啶，咪达唑仑，羟考酮，磷酸二氢钾，氢氧化钠及注射用水；各组分的含量为：每100mL复方麻醉剂中各组分的含量为右旋美托咪啶15mg，咪达唑仑135mg，羟考酮7mg，磷酸二氢钾680mg，氢氧化钠116.4mg，余量为注射用水。>

复方麻醉剂的制备方法，包括以下步骤：将右旋美托咪啶、咪达唑仑、羟考酮、磷酸二氢钾、氢氧化钠依次溶于注射用水中，再加入注射用水稀释，过滤，灌封于安瓿瓶内，高压灭菌，既得。>

2、实验方法及结果>

2.1 麻醉方法>

称量大鼠体重。放入血压固定器待其适应后，用尾套法测取其基础生理指标如心率(HR)、平均动脉压(MBP)等。将大鼠放入固定器待其安静后测量其基础生理指标包括呼吸频率(RR)、动脉血氧饱和度(SpO₂)、体温(T)等。之后按1mL/kg剂量腹腔注射复方麻醉剂，监测麻醉时期、镇静、镇痛及肌松效果。采取加热法测取大鼠无创血压，连接好AD Instruments多导生理监测仪和MP150型16通道生理信号仪进行心率、心电波形、血氧饱和度、体温、呼吸频率等指标连续监测，实验过程中注意适时加热和保温。>

分别于不同时间点通过心脏采集静脉血0.5mL，放置1h后，1500rpm离心10min，分离无乳糜和溶血的血清至EP管。AU5800系列全自动生化分析仪测量其谷丙转氨酶ALT(U/L)、谷草转氨酶AST(U/L)、碱性磷酸酶ALP(U/L)、总胆红素TBIL(mg/L)、尿素氮BUN(mg/L)、肌酐CREA(mg/L)、总胆固醇CHOL(mg/L)等反应肝肾功能的主要生化指标。>

2.2 麻醉时期的监测>

麻醉诱导期为6.35±2.28min，麻醉维持时间为130.23±57.22min，苏醒时间为33.28±17.05min，苏醒平稳，无异常表现(兴奋、复睡等)。>

2.3 麻醉效果(镇痛、镇静、肌松)监测>

按实验例1中正交决定性验证实验中的评价标准进行评分，麻醉效果得分为各项得分之和(表15)。>

表15 大鼠麻醉效果得分表(n＝10)>

注：肩标大写字母不同代表差异显著，P＜0.05。>

2.4 生理功能监测>

注射复方麻醉剂对大鼠正常体温有一定影响，表现为注射后体温开始下降并持续维持低温状态。心率在注药后7.5min时与基础值相比，显著降低。呼吸频率注药后呈轻微下降趋势，单因素方差分析差异不显著，持续到麻醉120min后基本恢复正常水平。血氧饱和度表现为初期下降，到注药后20min降至最低，后逐渐恢复并接近正常水平，整个麻醉过程中血氧饱和度均在93％以上。血压在注药后开始升高，到10min以后维持高血压状态，40min后逐渐降低，麻醉后15min-80min血压与0min差异显著(p＜0.05)，80min后差异性均不显著(p>0.05)，见表16。>

表16 麻醉后大鼠的各项生理参数变化(n＝10)>

注：与0min比较，*代表差异显著，P＜0.05。>

2.5 肝肾功能监测>

复方麻醉剂对大鼠肝肾功能无明显的影响，具体结果见表17。>

表17 麻醉后大鼠肝肾功能指标变化(n＝10)>

注：与0h比较，*代表差异显著，P＜0.05。>

以上结果显示，本复方麻醉剂麻醉诱导迅速平稳，麻醉维持时间长，苏醒平稳，无异常表现(兴奋、复睡等)。麻醉效果好，镇痛、镇静效果良好，对主要的生理指标影响在其生理耐受范围内，对大鼠肝肾功能无明显的影响。>

实验例4 添加阿托品实验>

在复方麻醉制剂的主要组分和比例确定的基础上，对是否加入阿托品和阿托品加入时间进行试验。>

复方麻醉剂包括：右旋美托咪啶，咪达唑仑，羟考酮，磷酸二氢钾，氢氧化钠及注射用水；各组分的含量为：每100mL复方麻醉剂中各组分的含量为右旋美托咪啶15mg，咪达唑仑135mg，羟考酮7mg，磷酸二氢钾680mg，氢氧化钠116.4mg，余量为注射用水。>

取SD大鼠24只随机均分为A、B、C三组，之后按1mL/kg剂量腹腔注射复方麻醉剂，其中A组为无阿托品；B组为提前15min注射阿托品(0.14mg/kg)；C组为与复方麻醉剂同时注射阿托品(0.14mg/kg)。>

实验结果发现，与复方麻醉剂的主要组分同时注射阿托品后可增强麻醉过程中的镇痛效果(表18)，还可以有效地改善复方麻醉制剂对大鼠心率(表19、表20、图1)和血压(表21、表22、图2)的不良影响，尤其是缓和复方麻醉剂对心率降低幅度。同时注射阿托品后，麻醉诱导时间和苏醒时间较无阿托品组、提前15min注射阿托品组无明显差异(表23)。最终确定阿托品和复方麻醉剂的主要组分同时加入，剂量为0.14mg/kg，即每100mL复方麻醉剂中，阿托品的含量为14mg。>

由心率随时间的变化趋势可知，同时加阿托品的心率稳定性优于其他两组，因此进一步在阿托品同时给药的情况下，对阿托品加入剂量进行探讨。参考犬麻醉时阿托品的用量和预实验结果，确定使用剂量变化梯度后进行试验。结果显示阿托品在用药15min后，血压升高显著(表24)。>

表18 大鼠麻醉效果观察(n＝8)>

表19 基础心率的监测结果(n＝8)>

表20 三种不同处理下心率变化情况(n＝8)>

注：*表示与基础心率有差异，表中相同字母表示同一时间条件下，二者差异不显著，不同字母表示差异显著，显著水平为0.05。>

表21 基础血压的监测结果(n＝8)>

表22 三种不同处理下平均动脉压(MAP)监测结果(n＝8)>

注：*表示与基础血压有差异，表中相同字母表示同一时间条件下，二者差异不显著，不同字母表示差异显著，显著水平为0.05。>

表23 三种不同处理下诱导时间和苏醒时间(n＝8)>

表24 阿托品不同剂量下收缩压和舒张压平均数随时间变化表(n＝8)>