用于检测rs7597593位点和rs1344706位点的核苷酸的物质的新用途

摘要

本发明公开了用于检测ZNF804A基因中的rs7597593位点和rs1344706位点的核苷酸的物质的新用途。本发明要求保护用于检测rs7597593位点核苷酸的物质和用于检测rs1344706位点的核苷酸的物质在制备用于评估海洛因成瘾风险性的试剂盒中的应用。将rs7597593位点和rs1344706位点的联合基因型分为风险基因型、中间基因型和保护基因型。基于rs7597593位点和rs1344706位点的联合基因型，风险基因型的受试者海洛因成瘾风险性高，保护基因型的受试者海洛因成瘾风险性低。本发明有助于预防海洛因成瘾疾病、对海洛因成瘾者疾病进程的预测及评估、对海洛因成瘾者进行有效的干预、开发新的针对海洛因成瘾者的药物，具有重大的应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及用于检测ZNF804A基因中的rs7597593位点和 rs1344706位点的核苷酸的物质的新用途，具体来说为用于检测ZNF804A基因中的 rs7597593位点和rs1344706位点的核苷酸的物质在制备用于评估海洛因成瘾风险性 和/或海洛因成瘾者的冲动抉择行为损害程度以和/或海洛因成瘾者大脑左侧感觉运动 皮层的灰质体积的试剂盒的新用途。

背景技术

物质成瘾也称物质依赖，是指长期滥用某种物质后，心理上与躯体上产生的一种 强烈而不能克制的寻觅该种物质的状态，以期体验重复使用该物质所产生的欣快感， 同时避免戒断所引起的躯体不适。物质成瘾性疾病是一种反复发作的以强迫性觅药和 摄药行为主要特征的慢性复发性脑病。

物质成瘾者行为学异常主要表现为学习记忆能力下降、冲动控制能力受损和认知 能力下降等形式。这些行为改变是物质成瘾者接触成瘾性物质和发生复吸的直接原因。 冲动性表现为缺乏前瞻性考虑、不计后果地进行一些不恰当或冒险的行为。研究中发 现，物质成瘾者表现出更高的冲动性。冲动性高低与成瘾物质的使用量、渴求程度以 及戒断症状严重性呈正相关。高冲动性被认为是导致复吸的一个关键因素。研究表明， 高冲动性预示着可卡因成瘾者戒断后复吸几率更高。对物质成瘾者的冲动性研究有多 种角度，比如冲动性选择(impulsive choice)、行为去抑制(response inhibition) 和思维冲动(reflection impulsivity)等。对冲动性的评估有多种方法，其中冲动 抉择指的是在各种选择中进行决断，以期达到最优化的能力。爱荷华赌博试验(Iowa  Gambling Task,IGT)是一种对冲动抉择能力进行定量评估的方法。在试验中，受试 在不确定结果的条件下需要权衡奖赏和惩罚的大小，并作出最优选择。对阿片类、酒 精、可卡因、大麻类等物质成瘾性疾病的研究表明，物质成瘾者的冲动抉择行为受损 (冲动抉择能力降低)，并且冲动抉择行为损害程度与药物成瘾复吸行为密切相关。

此外，物质成瘾者脑影像也会发生改变，主要包括脑解剖结构的改变、脑区活动 和神经递质的改变以及基于各种任务的脑区激活情况改变。研究表明，被滥用的物质 具有神经毒性，可造成神经细胞形态和结构的改变，进而影响其功能。这种形态，结 构和功能的损害可能是慢性，永久性和不可逆转的。目前从脑解剖结构变化角度开展 的成像研究主要集中在两个方面：一是测量脑灰质白质的体积大小；二是用扩散张量 成像技术对神经纤维进行追踪。其中，用voxel based morphometry(VBM)方法测量脑 灰白质体积改变实现了同一标准探测脑内是否具有因为灰质缺失所带来的特定部位的 萎缩。已有研究表明，物质成瘾者多个脑区均存在灰质密度异常。

物质成瘾性疾病是多种遗传因素与环境因素共同作用而导致的一种复杂的脑疾 病。遗传因素与物质成瘾性疾病的易感性密切相关。Tsuang等人对物质成瘾者的双生 子的研究中发现，遗传因素是造成个体对成瘾性物质易感性不同的主要原因。已有研 究证明，海洛因成瘾者的行为学及影像学异常是可受遗传因素调节的。遗传因素能影 响成瘾疾病的各个阶段，与物质成瘾性疾病相关的许多重要基因的遗传多态性改变能 够影响个体对物质成瘾的易感性、耐受性、机体功能及复吸。

阿片类物质成瘾，特别是海洛因成瘾是我国最早开始流行，也是流行最严重的成 瘾种类。根据2014年的中国禁毒报告，中国阿片类成瘾者目前已达到133万，占全国 所有药物成瘾总人数的53.6％，是我国成瘾人群的大多数。找到预示海洛因成瘾疾病 易感性及成瘾后行为学损害程度的生物学靶标，对预防海洛因成瘾疾病的发生和提高 复吸治疗成功率，具有重要意义。

ZNF804A蛋白即锌指蛋白804A(zinc finger protein804A)。ZNF804A基因位 于染色体2q32.1，大小为341kb。目前，ZNF804A基因的确切功能尚不清楚。ZNF804A 基因在人脑内广泛表达，尤其在未发育完全的海马和皮质，在成年的小脑内也有大量 表达。

发明内容

本发明的目的是提供用于检测ZNF804A基因中的rs7597593位点和rs1344706位 点的核苷酸的物质的新用途。

rs7597593位点存在A/G多态，rs1344706位点存在A/C多态，将rs7597593位点 和rs1344706位点的联合基因型分为风险基因型(AA_rs7597593-AA_rs1344706、AA_rs7597593-AC_rs1344706、 AG_rs7597593-AA_rs1344706)、中间基因型(AA_rs7597593-CC_rs1344706、GG_rs7597593-AA_rs1344706、AG_rs7597593-AC_rs1344706) 和保护基因型(AG_rs7597593-CC_rs1344706、GG_rs7597593-AC_rs1344706、GG_rs7597593-CC_rs1344706)。

本发明要求保护用于检测rs7597593位点核苷酸的物质和用于检测rs1344706位 点的核苷酸的物质在制备用于评估海洛因成瘾风险性的试剂盒中的应用。基于 rs7597593位点和rs1344706位点的联合基因型，如果受试者为风险基因型 (AA_rs7597593-AA_rs1344706、AA_rs7597593-AC_rs1344706、AG_rs7597593-AA_rs1344706)、其海洛因成瘾风险性高，如 果受试者为保护基因型(AG_rs7597593-CC_rs1344706、GG_rs7597593-AC_rs1344706、GG_rs7597593-CC_rs1344706)、其海 洛因成瘾风险性低。

本发明还保护用于检测rs7597593位点核苷酸的物质和用于检测rs1344706位点 的核苷酸的物质在制备用于评估海洛因成瘾者的冲动抉择行为损害程度的试剂盒中的 应用。基于rs7597593位点和rs1344706位点的联合基因型，如果受试者为风险基因 型(AA_rs7597593-AA_rs1344706、AA_rs7597593-AC_rs1344706、AG_rs7597593-AA_rs1344706)、其冲动决策行为的损害程 度高，如果受试者为保护基因型(AG_rs7597593-CC_rs1344706、GG_rs7597593-AC_rs1344706、GG_rs7597593-CC_rs1344706)、 其冲动决策行为的损害程度低。冲动决策行为的损害程度高具体体现为受试者的IGT 得分结果为-10以下。冲动决策行为的损害程度低具体体现为受试者的IGT得分结果 为-5以上。

本发明还保护用于检测rs7597593位点核苷酸的物质和用于检测rs1344706位点 的核苷酸的物质在制备用于评估海洛因成瘾者的大脑左侧感觉运动皮层的灰质体积的 试剂盒中的应用。基于rs7597593位点和rs1344706位点的联合基因型，如果受试者 为风险基因型(AA_rs7597593-AA_rs1344706、AA_rs7597593-AC_rs1344706、AG_rs7597593-AA_rs1344706)、其大脑左侧感 觉运动皮层的灰质体积高，如果受试者为保护基因型(AG_rs7597593-CC_rs1344706、 GG_rs7597593-AC_rs1344706、GG_rs7597593-CC_rs1344706)、其大脑左侧感觉运动皮层的灰质体低。大脑左侧 感觉运动皮层的灰质体积高具体体现为受试者大脑左侧感觉运动皮层的灰质体积大于 正常受试者或具有统计学意义的正常受试者的平均值。大脑左侧感觉运动皮层的灰质 体低具体体现为受试者大脑左侧感觉运动皮层的灰质体积为正常受试者或具有统计学 意义的正常受试者的平均值以下。

本发明还保护一种用于评估海洛因成瘾风险性的试剂盒，包括用于检测 rs7597593位点核苷酸的物质和用于检测rs1344706位点的核苷酸的物质。基于 rs7597593位点和rs1344706位点的联合基因型，如果受试者为风险基因型 (AA_rs7597593-AA_rs1344706、AA_rs7597593-AC_rs1344706、AG_rs7597593-AA_rs1344706)、其海洛因成瘾风险性高，如 果受试者为保护基因型(AG_rs7597593-CC_rs1344706、GG_rs7597593-AC_rs1344706、GG_rs7597593-CC_rs1344706)、其海 洛因成瘾风险性低。

本发明还保护一种用于评估海洛因成瘾后的冲动抉择行为损害度的试剂盒，包括 用于检测rs7597593位点核苷酸的物质和用于检测rs1344706位点的核苷酸的物质。 基于rs7597593位点和rs1344706位点的联合基因型，如果受试者为风险基因型 (AA_rs7597593-AA_rs1344706、AA_rs7597593-AC_rs1344706、AG_rs7597593-AA_rs1344706)、其冲动决策行为的损害程度 高，如果受试者为保护基因型(AG_rs7597593-CC_rs1344706、GG_rs7597593-AC_rs1344706、GG_rs7597593-CC_rs1344706)、 其冲动决策行为的损害程度低。冲动决策行为的损害程度高具体体现为受试者的IGT 得分结果为-10以下。冲动决策行为的损害程度低具体体现为受试者的IGT得分结果 为-5以上。

本发明还保护一种用于评估海洛因成瘾后的大脑左侧感觉运动皮层的灰质体积的 试剂盒，包括用于检测rs7597593位点核苷酸的物质和用于检测rs1344706位点的核 苷酸的物质。基于rs7597593位点和rs1344706位点的联合基因型，如果受试者为风 险基因型(AA_rs7597593-AA_rs1344706、AA_rs7597593-AC_rs1344706、AG_rs7597593-AA_rs1344706)、其大脑左侧感觉运 动皮层的灰质体积高，如果受试者为保护基因型(AG_rs7597593-CC_rs1344706、GG_rs7597593-AC_rs1344706、 GG_rs7597593-CC_rs1344706)、其大脑左侧感觉运动皮层的灰质体低。大脑左侧感觉运动皮层的灰 质体积高具体体现为受试者大脑左侧感觉运动皮层的灰质体积大于正常受试者或具有 统计学意义的正常受试者的平均值。大脑左侧感觉运动皮层的灰质体低具体体现为受 试者大脑左侧感觉运动皮层的灰质体积为正常受试者或具有统计学意义的正常受试者 的平均值以下。以上任一所述用于检测rs7597593位点核苷酸的物质为序列表的序列 1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成的引物对。

以上任一所述用于检测rs1344706位点的核苷酸的物质为序列表的序列3所示的 单链DNA分子和序列表的序列4所示的单链DNA分子组成的引物对。

以上任一所述rs7597593位点位于ZNF804A基因中，具体来说为序列表的序列5 所示的双链DNA分子自5’末端第501位核苷酸。

以上任一所述rs1344706位点位于ZNF804A基因中，具体来说为序列表的序列6 所示的双链DNA分子自5’末端第465位核苷酸。

本发明还保护一种引物组，由引物对甲和引物对乙组成；所述引物对甲为序列表 的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成的引物对； 所述引物对乙为序列表的序列3所示的单链DNA分子和序列表的序列4所示的单链DNA 分子组成的引物对。

本发明有助于预防海洛因成瘾疾病，有助于对海洛因成瘾者进行有效的干预，有 助于开发新的针对海洛因成瘾者的药物，具有重大的应用价值。

附图说明

图1为保护基因型、中间基因型和风险基因型受试者的IGT得分结果(实施例2 中的结果图)。

图2为保护基因型、中间基因型和风险基因型受试者的大脑左侧感觉运动皮层灰 质体积的结果(实施例3中的结果图)。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。

海洛因成瘾者来源于戒毒中心，均为知情同意的志愿者。入选标准：(1)汉族， 其父母均为中国南方人(南方即长江以南)；(2)符合美国精神疾病诊断与统计手册第 四版(DSM-Ⅳ)阿片类物质成瘾诊断标准，吸食海洛因，静脉注射给药，除海洛因外 没有滥用其它成瘾性物质(如大麻、甲基苯丙胺类物质、氯胺酮等)。排除标准：(1) 重大疾病史(如心血管疾病，内分泌疾病，肿瘤疾病，自身免疫疾病等)；(2)有过精 神疾病史。

正常受试者通过广告、电话等方法招募，均为知情同意的志愿者。入选标准：(1) 汉族，其父母均为中国南方人(南方即长江以南)；(2)无成瘾性物质使用史。排除标 准：(1)重大疾病史(如心血管疾病，内分泌疾病，肿瘤疾病，自身免疫疾病等)；(2) 有过精神疾病史。

rs7597593-upper(序列表的序列1)：5’-ATGTCTATGGAAATAATAAG-3’；

rs7597593-lower(序列表的序列2)：5’-TACCAATTCTCGGGCAATAC-3’。

rs1344706-upper(序列表的序列3)：5’-TCAAAGCCTTATCTCTTCAC-3’；

rs1344706-lower(序列表的序列4)：5’-CCAGATAGATATCCAAGAAG-3’。

实施例1、检测受试者rs7597593位点的核苷酸、rs1344706位点的核苷酸、获得 受试者群体基于rs7597593位点和rs1344706位点的联合基因型

1、提取受试者的外周静脉血的基因组DNA。

2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，采用rs7597593-upper和rs7597593-lower 组成的特异引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

3、将步骤2的PCR扩增产物进行测序，从而获知受试者基于rs7597593位点的基 因型。测序结果表明，PCR扩增产物均为ZNF804A基因中的靶序列，不存在其它非特 异性扩增，即对于所述特异引物对来说，人基因组中不存在其它可以扩增的靶点，特 异性良好。

4、以步骤1提取的基因组DNA为模板，采用rs1344706-upper和rs1344706-lower 组成的特异引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

5、将步骤4的PCR扩增产物进行测序，从而获知受试者基于rs1344706位点的基 因型。测序结果表明，PCR扩增产物均为ZNF804A基因中的靶序列，不存在其它非特 异性扩增，即对于所述特异引物对来说，人基因组中不存在其它可以扩增的靶点，特 异性良好。

两个不同群体(海洛因成瘾者群体和正常受试者群体)中：rs7597593位点存在 A/G多态，等位基因A的分布频率见表1；rs1344706位点存在A/C多态，等位基因A 的分布频率见表1。分布频率统计结果经过Bonferroni矫正。

表1两个不同群体中rs7597593位点和rs1344706位点等位基因A的分布频率

等位基因A的分布频率显示，rs7597593位点和rs1344706位点是海洛因成瘾疾 病的遗传易感位点，rs7597593位点中A为风险等位基因，rs1344706位点中A基因为 风险等位基因。

基于上述分析，将rs7597593位点和rs1344706位点的联合基因型分为风险基因 型(rs7597593位点和rs1344706位点共计四个等位基因，如果其中3个为A或4个 为A，即为风险基因型，具体包括如下几个联合基因型：AA_rs7597593-AA_rs1344706、 AA_rs7597593-AC_rs1344706、AG_rs7597593-AA_rs1344706)、中间基因型(rs7597593位点和rs1344706位 点共计四个等位基因，如果其中2个为A，即为中间基因型，具体包括如下几个联合 基因型：AA_rs7597593-CC_rs1344706、GG_rs7597593-AA_rs1344706、AG_rs7597593-AC_rs1344706)和保护基因型(rs7597593 位点和rs1344706位点共计四个等位基因，如果其中1个为A或0个为A，即为保护 基因型，具体包括如下几个联合基因型：AG_rs7597593-CC_rs1344706、GG_rs7597593-AC_rs1344706、 GG_rs7597593-CC_rs1344706)。

海洛因成瘾者群体、正常受试者群体基于rs7597593位点和rs1344706位点的联 合基因型分布结果见表2。

表2联合基因型分布结果

海洛因成瘾者群体的个体总数为1032名，其中风险基因型个体为284名(占个体 总数的百分率为27.5％)，中间基因型个体为392名(占个体总数的百分率为37.9％)， 保护基因型个体为356名(占个体总数的百分率为34.5％)。正常受试者群体的个体总 数为2861名，其中风险基因型个体为659名(占个体总数的百分率为23.1％)，中间 基因型个体为1074名(占个体总数的百分率为37.6％)，保护基因型个体为1128名(占 个体总数的百分率为39.5％)。海洛因成瘾者群体和正常受试者群体之间，X²＝11.18， p＝0.004。

结果表明，rs7597593位点和rs1344706位点的联合基因型的分布在海洛因成瘾 者群体和正常受试者群体之间差异显著，海洛因成瘾者群体中风险基因型个体占个体 总数的百分率显著高于正常受试者群体中风险基因型个体占个体总数的百分率，正常 受试者群体中保护基因型个体占个体总数的百分率显著高于海洛因成瘾者群体中保护 基因型个体占个体总数的百分率。

实施例2、爱德华赌博试验(Iowa Gambling Task,IGT)

采用IGT经典纸牌方法，共有四组牌(A、B、C、D)，每组牌有40张，按一定规律 叠放。其中A组和B组是代表高风险的牌，得分高，失分更高，选择这两组牌越多， 最后总分越低；C组和D组是低风险性的牌，得分低，失分也更少，选择这两组牌越 多，最后总分越高。受试者在事先不知道每一张牌的得分的情况下，以使自己所得总 分最大化为原则，按照指导语每次从四组牌中任意选择1张，共选够100张停止。最 后以选择低风险的C和D组牌总数减去高风险的A和B组牌的总数((C+D)-(A+B)) 的结果代表受试者的冲动决策能力，分值越低，代表受试冲动性越高。

按照实施例1的方法检测受试者基于rs7597593位点和rs1344706位点的联合基 因型，分布结果见表3。

表3联合基因型分布结果

海洛因成瘾者群体中，风险基因型个体的平均IGT得分结果为-14.08±3.05，中 间基因型个体的平均IGT得分结果为-9.54±3.07，保护基因型个体的平均IGT得分 结果为-0.47±4.1。正常受试者群体中，风险基因型个体的平均IGT得分结果为7.96 ±4.49，中间基因型个体的平均IGT得分结果为-0.05±4.12，保护基因型个体的平均 IGT得分结果为-1.66±3.25。

结果比较见图1。与正常受试者相比，海洛因成瘾者的冲动抉择能力显著降低。 在海洛因成瘾者群体中IGT的得分由高至低依次为：保护基因型、中间基因型、风险 基因型。在正常受试者群体中不存在上述相关性。

实施例3、联合基因型对受试者的脑影像改变

在广东省中山市中医院影像科使用磁共振扫描仪对受试者进行头部扫描。用配套 的泡沫垫固定受试者头部，用橡皮塞塞住双耳以减少噪音干扰，整个扫描过程中受试 者保持静息状态，安静仰卧，闭上双眼。共进行2个不同的MR序列(3D-T1；T2)的扫 描，每个序列重复一遍。首先完成定位像的扫描，然后进行轴位3D-T1扰相梯度回波 序列(SPGR)扫描，扫描参数为：层厚＝1毫米，重复时间(TR)＝7.816毫秒，回波时间(TE)＝ 2.984毫秒，反转时间＝450ms，反转角＝13°，矩阵＝256×256，视野(FOV)＝256×256mm²， 平均次数＝2。扫描过程中2名影像科医生负责扫描图像的观察，以确定图像无运动伪 影，观察T2像，以排除脑部肿瘤等异常情况。

结构MRI图像数据使用FSL(FMRIB Software Library)中基于体素的形态学分析 (voxel-based morphometry，VBM)的工具包FSL-VBM完成。使用脑组织提取工具 Brain Extraction Tool(BET)去除颅骨等非脑组织的影像数据。应用脑组织分割工具 FAST对上一步得到的结构像进行组织分割。用仿射变换工具FLIRT和变形场校正的非线 性配准工具FNIRT将分割得到的灰质图像配准到MNI-152标准空间。将所得到的所有受 试标准空间下的灰质图像进行平均，得到自定义标准模板，然后将每个的受试者的影 像图像重新配准到该自定义模板上。配准得到的图像再除以变形场的Jacobian矩阵， 以校正配准过程中局部缩放所造成的影响。随后，用3mm半高全宽(FWHM)的高斯核对 图像进行平滑处理。

使用体素水平的一般线性模型(GLM)对图像数据进行基于置换检验的非参数检验。 采用双因素方差分析(ANOVA)检验海洛因成瘾和基因型对灰质体积的影响。统计显著 的阈值设定为p<0.01和团块大小>134voxels，对应于校正后的p<0.05。该校正是在 组平均灰质模板(阈值为0.2)上通过AFNI软件(AlphaSim program. http://afni.nih.gov/afni/docpdf/AlphaSim.pdf)中用蒙特卡洛模拟方法得到的。

参加MRI扫描的受试者均为右利手，并且排除对MRI扫描存在禁忌症(如体内有 重金属或患有幽闭恐惧症)的受试者。

按照实施例1的方法检测受试者基于rs7597593位点和rs1344706位点的联合基 因型，分布结果见表4。

表4联合基因型分布结果

脑影像结果见表5和图2。

表5联合基因型与受试者的脑影像改变的关联分析

海洛因成瘾者群体中，不同联合基因型个体左侧感觉运动皮层(包括左侧中央前 回和左侧中央后回)的脑灰质体积具有显著性差异，海洛因成瘾者群体中，脑灰质体 积由少到多依次为保护基因型、中间基因型和风险基因型。在正常受试者群体中不存 在上述相关性。