一种盐渍化-石油-重金属复合污染土壤质量的微生物指标评价方法

摘要

本发明涉及盐渍化-石油-重金属复合污染土壤质量的微生物指标评价方法，步骤包括：选定微生物指标评价因子、确定微生物指标评价因子的权重、计算微生物指标评价因子的评价指数和确定土壤环境质量级别。本发明对于在不同的土壤条件下大多数盐渍化-石油-重金属复合污染类型土壤都可准确测定。该测定方法经济、简单、可操作性强；所选微生物评价因子背景值或对照值也易于测定；所选微生物评价因子对盐渍化-石油-重金属复合污染足够灵敏和可靠,同时也较其他评价因子更加稳定。

说明书

技术领域

本发明涉及一种盐渍化-石油-重金属复合污染土壤质量的微生物指标评价方法，属于环境质量评价技术领域。 

背景技术

传统土壤评价方法比如单项指数评价法只是对土壤中的某一污染物的污染程度进行评价,这一种指数在目前环境各要素评价中应用较广泛,该方法的优点是以土壤环境质量标准作为基础,目标较明确,但其仅仅针对土壤中重金属单元素进行评价,不能反映土壤污染的综合状况；模糊数学综合评价法将土壤污染问题按照不同分级标准,通过建立隶属函数在闭区间(0,1)内连续取值来进行评价的方法,该方法有效地解决了土壤污染级别的模糊边界问题,但该方法仅仅考虑了污染物浓度超标的情况,未考虑污染物本身的毒性作用；人工神经网络模型缺乏严密理论体系的指导,应用效果也取决于使用者的经验,往往需要经过大量费力耗时的实验摸索才能确定合适的神经网络模型、算法及参数设置,因此神经网络的建立是应用中的一大难题。 

土壤微生物是构成土壤微生态环境的重要组成部分。由于石油、重金属在土壤中的难降解性,使微生物生物量大大降低,破坏了微生物群落结构的稳定性,最重要的是大大降低了微生物相关酶的活性,严重抑制微生物的生长和代谢,这也影响到土壤的质量和植物的生长,以致影响到人类的健康。而微生物活动是土壤基础呼吸的主要来源,是土壤中数量最多的生物类群,也是土壤的形成推动者,它在一定程度上决定着土壤的基本性质,对土壤的肥力、营养元素的迁移、转化有重要作用,而且对污染物的分解、净化也起一定作用。同时它的变化能及早地预测土壤养分及环境质量的变化,也反映土壤的污染状况,它对石油、重金属胁迫的生物反应远比动植物都敏感。经研究表明，土壤呼吸作用强度、过氧化氢酶、脲酶及微生物量碳对盐渍化-石油-重金属复合污染的土壤环境很敏感,呈现出显著地相关性，这些指标活性的大小可以作为评价盐渍化-石油-重金属复合污染土壤环境质量的重要指标。 

目前，通过微生物的各种指标评价盐渍化-石油-重金属复合污染土壤的质量未见报道。 

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种盐渍化-石油-重金属复合污染土壤质量的微生物指标评价方法。 

本发明的技术方案如下： 

一种盐渍化-石油-重金属复合污染土壤质量的微生物指标评价方法，步骤如下： 

（1）选定微生物指标评价因子 

以土壤的呼吸作用强度、过氧化氢酶活性、脲酶活性和微生物量碳作为评价因子； 

（2）确定微生物指标评价因子的权重（W_i） 

确定土壤的呼吸作用强度、过氧化氢酶活性、脲酶活性和微生物量碳的权重分别为0.121、0.423、0.281、0.175； 

（3）计算微生物指标评价因子的评价指数（P_i） 

分别将待测土壤和对照土壤置于花盆中，于20～28℃，光照强度为5000lx，恒温光照培养40～50天；整个培养过程中土壤湿度保持在土壤最大持水质量的50%～60%；培养完成后测定待测土壤和对照土壤的呼吸作用强度、过氧化氢酶活性、脲酶活性和微生物量碳； 

所述的对照土壤的含盐量≤0.3%，镍含量≤60mg.kg^-1、镉含量≤0.25mg.kg^-1、钒含量≤130mg.kg^-1，石油烃总量含量≤100mg.kg^-1； 

按公式计算评价指数P_i； 

（4）确定土壤环境质量级别 

按公式计算评价指标值PI，公式中：P_i、W_i分别为评价因子的评价指数和权重； 

当PI＞0.86时，土壤质量为清洁， 

当0.68<PI≤0.86时，土壤质量为尚清洁， 

当0.43<PI≤0.68时，土壤质量为轻度污染， 

当PI≤0.43时，土壤环境质量为严重污染。 

根据本发明，步骤（3）中待测土壤和对照土壤的呼吸作用强度、过氧化氢酶活性、脲酶活性和微生物量碳的测量可按现有技术。 

优选的，呼吸作用强度的测量方法为氢氧化钠吸收法，步骤为： 

在密闭容器内放置20克待测土壤和0.1mol/L的NaOH溶液，作为测量样，于28℃恒温培养24小时；然后取出NaOH溶液，以酚酞为指示剂，用0.1mol.l^-1HCl溶液滴定；求出测量样的CO₂释放质量； 

同时，另取同样的密闭容器，仅放置0.1mol/L的NaOH溶液，作为空白样，于28℃恒温放置24小时；然后取出NaOH溶液，以酚酞为指示剂，用0.1mol.l^-1HCl溶液滴定，粉红色第一次褪去且30秒不变色作为滴定终点；求出空白样的CO₂释放质量； 

CO₂释放质量=△V×0.1×44/2mg.d^-1，△V指0.1mol.l^-1HCl溶液的滴定体积差； 

呼吸作用强度（mg.kg^-1.d^-1）=（测量样的CO₂释放质量—空白样的CO₂释放质量）×50，换算为每千克土壤每天释放出的二氧化碳毫克数； 

按上述方法再测量求出对照土壤的呼吸作用强度。 

根据本发明，优选的，步骤（3）中过氧化氢酶活性的测量方法为高锰酸钾滴定法，步骤为： 

称取5g待测土壤于100ml三角瓶中，作为测量样，加入0.5ml甲苯，摇匀，置于4℃冰箱中30min后立刻加入25ml3wt%过氧化氢水溶液；摇匀，置于4℃冰箱中30min后迅速加入25ml2mol/L的硫酸，摇匀，过滤；取1ml滤液，加入4ml1mol/L的硫酸，用0.1mol/L的高锰酸钾滴定，滴定终点为滴入高锰酸钾后溶液变紫色且30秒不褪色，求出测量样滴定终点时的高锰酸钾消耗体积； 

不加入待测土壤，作为空白样，重复上述操作；求出空白样滴定终点时的高锰酸钾消耗体积； 

过氧化氢酶活性=（空白样滴定终点时的高锰酸钾消耗体积—测量样滴定终点时的高锰酸钾消耗体积）×2/5，单位：ml(0.1mol/L KMnO₄)/(h·g)； 

按上述方法再求出对照土壤的过氧化氢酶活性。 

根据本发明，优选的，步骤（3）中脲酶活性的测量方法为苯酚钠-次氯酸钠比色法，步骤为： 

将1ml含有0.1mg氮的标准液（称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml）作为氮工作液，分别吸取氮工作液0、1、3、5、7、9、11、13ml于50ml容量瓶中，补加蒸馏水至20ml，加入4ml1.35mol/L的苯酚钠溶液和3ml活性氯的浓度为0.9wt%的次氯酸钠溶液，摇匀，20min后显蓝色，蒸馏水定容；1h内在分光光度计上于578nm波长处比色；然后以氮工作液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线； 

称取5g待测土壤于50ml三角瓶中，作为测量样，加1ml甲苯，摇匀，15min后加10ml10wt%尿素溶液和20ml pH6.7的柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃恒温箱中培养24小时；培养结束后过滤，取1ml滤液加入到50ml容量瓶中，加入4ml1.35mol/L的苯酚钠溶液和3ml活性氯的浓度为0.9wt%的次氯酸钠溶液，摇匀，20min后显蓝色，蒸馏水定容；1h内在分光光度计与578nm波长处比色，根据标准曲线得到测量样中的氮工作液浓度； 

不加入待测土壤，作为空白样，重复上述操作；根据标准曲线得到空白样中的氮工作液浓度； 

不加入10wt%尿素溶液，作为无基质样，重复上述操作；根据标准曲线得到无基质样中的氮工作液浓度； 

脲酶活性=（测量样中的氮工作液浓度—空白样中的氮工作液浓度—无基质样中的氮工作液浓度）×50×n/5，n为分取倍数=浸出液体积／吸取滤液体积，单位：mg.g^-1.d^-1； 

按上述方法再求出对照土壤的脲酶活性； 

所述的pH6.7的柠檬酸盐缓冲溶液的配制可为将184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾溶于蒸馏水，用1mol/L NaOH将pH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。 

根据本发明，优选的，步骤（3）中微生物量碳的测量方法为氯仿熏蒸法，步骤为： 

称取待测土壤10g于25ml小烧杯中，置于真空干燥器中，同时内放一装有用50ml氯仿的小烧杯，用3号真空泵油密封；将密封好的真空干燥器连到真空泵上，抽真空至氯仿沸腾1-2分钟；然后用Shimadzu TOC500测定待测土壤提取液有机碳含量即为微生物量碳； 

按上述方法测定对照土壤的微生物量碳。 

本发明所述的盐渍化-石油-重金属复合污染土壤是指，0.3%≤盐渍化≤1.0%，100mg.kg^-1≤石油烃含量≤2000mg.kg^-1，60mg.kg^-1≤重金属中镍含量≤200mg.kg^-1、0.25mg.kg^-1≤镉含量≤20mg.kg^-1、130mg.kg^-1≤钒含量≤250mg.kg^-1的复合污染土壤。 

按照本发明方法确定的土壤质量为清洁的土壤低于背景值，土壤质量为尚清洁的土壤优于农田土壤质量标准，土壤质量为轻度污染的土壤略优于居住/公园区土壤环境标准，土壤质量为严重污染的土壤未达到工业和商业用地质量标准。 

本发明通过室内盆栽试验研究了盐渍化-石油-重金属复合污染对土壤微生物相关生理指标的影响，根据不同指标对复合污染程度的敏感性大小，筛选出土壤呼吸作用强度、过氧化氢酶活性、脲酶活性和微生物量碳作为评价因子。微生物不同的生理指标对石油-重金属复合污染的毒性响应敏感性是截然不同的，本发明根据所选指标的敏感性大小，运用层次分析法分别确定土壤呼吸作用强度、过氧化氢酶、脲酶及微生物量碳等指标的权重为：0.121、0.423、0.281、0.175。 

本发明的有益效果是： 

本发明运用微生物相关生理指标评价土壤污染程度具有很多优点和广阔的应用前景，尤其是在盐渍化-石油-重金属复合污染土壤中优点更加突出。主要有以下优势： 

1、对于在不同的土壤条件下大多数盐渍化-石油-重金属复合污染类型土壤都可准确测定。 

2、由于要分析的土壤样品数量一般较大,该测定方法经济、简单、可操作性强。 

3、本发明所选微生物评价因子背景值或对照值也易于测定。 

4、本发明所选微生物评价因子对盐渍化-石油-重金属复合污染足够灵敏和可靠,同时也较其他评价因子更加稳定。 

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步说明，但不限于此。 

实施例1、东营孤岛地区盐渍化-石油-重金属复合污染土壤质量的微生物评价，待测土壤取自山东省东营市孤岛地区（取样点一），步骤如下： 

（1）选定微生物指标评价因子 

以土壤的呼吸作用强度、过氧化氢酶活性、脲酶活性和微生物量碳作为评价因子； 

（2）确定微生物指标评价因子的权重（W_i） 

确定土壤的呼吸作用强度、过氧化氢酶活性、脲酶活性和微生物量碳的权重分别为0.121、0.423、0.281、0.175； 

（3）计算微生物指标评价因子的评价指数（P_i） 

分别将待测土壤和对照土壤置于花盆中，每盆装500g，于25℃，5000xl光照强度，恒温光照培养40天；整个培养过程中土壤湿度保持在土壤最大持水质量的50%～60%；培养完成后测定待测土壤和对照土壤的呼吸作用强度、过氧化氢酶活性、脲酶活性和微生物量碳； 

所述的对照土壤的含盐量≤0.3%，镍含量≤60mg.kg^-1、镉含量≤0.25mg.kg^-1、钒含量≤130mg.kg^-1，石油烃总量含量≤100mg.kg^-1； 

所述的呼吸作用强度的测量步骤为： 

在密闭容器内放置20克待测土壤和0.1mol/L的NaOH溶液，作为测量样，于28℃恒温培养24小时；然后取出NaOH溶液，以酚酞为指示剂，用0.1mol.l^-1HCl溶液滴定；求出测量样的CO₂释放质量； 

同时，另取同样的密闭容器，仅放置0.1mol/L的NaOH溶液，作为空白样，于28℃恒温放置24小时；然后取出NaOH溶液，以酚酞为指示剂，用0.1mol.l^-1HCl溶液滴定，粉红色第一次褪去且30秒不变色作为滴定终点；求出空白样的CO₂释放质量； 

CO₂释放质量=△V×0.1×44/2mg.d^-1，△V指0.1mol.l^-1HCl溶液的滴定体积差； 

呼吸作用强度（mg.kg^-1.d^-1）=（测量样的CO₂释放质量—空白样的CO₂释放质量）×50，换算为每千克土壤每天释放出的二氧化碳毫克数； 

按上述方法再求出对照土壤的呼吸作用强度； 

所述的过氧化氢酶活性的测量步骤为： 

称取5g待测土壤于100ml三角瓶中，作为测量样，加入0.5ml甲苯，摇匀，置于4℃冰箱中30min后立刻加入25ml3wt%过氧化氢水溶液；摇匀，置于4℃冰箱中30min后迅速加入25ml2mol/L的硫酸，摇匀，过滤；取1ml滤液，加入4ml1mol/L的硫酸，用0.1mol/L的高锰酸钾滴定，滴定终点为滴入高锰酸钾后溶液变紫色且30秒不褪色，求出测量样滴定终点时的高锰酸钾消耗体积； 

不加入待测土壤，作为空白样，重复上述操作；求出空白样滴定终点时的高锰酸钾消耗体积； 

过氧化氢酶活性=（空白样滴定终点时的高锰酸钾消耗体积—测量样滴定终点时的高锰酸钾消耗体积）×2/5，单位：ml(0.1mol/L KMnO4)/(h·g)； 

按上述方法再求出对照土壤的过氧化氢酶活性； 

所述的脲酶活性的测量步骤为： 

将1ml含有0.1mg氮的标准液（称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml）作为氮工作液，分别吸取氮工作液0、1、3、5、7、9、11、13ml于50ml容量瓶中，补加蒸馏水至20ml，加入4ml1.35mol/L的苯酚钠溶液和3ml活性氯的浓度为0.9wt%的次氯酸钠溶液，摇匀，20min后显蓝色，蒸馏水定容；1h内在分光光度计上于578nm波长处比色；然后以氮工作液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线； 

称取5g待测土壤于50ml三角瓶中，作为测量样，加1ml甲苯，摇匀，15min后加10ml10wt%尿素溶液和20ml pH6.7的柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃恒温箱中培养24小时；培养结束后过滤，取1ml滤液加入到50ml容量瓶中，加入4ml1.35mol/L的苯酚钠溶液和3ml活性氯的浓度为0.9wt%的次氯酸钠溶液，摇匀，20min后显蓝色，蒸馏水定容；1h内在分光光度计与578nm波长处比色，根据标准曲线得到测量样中的氮工作液浓度； 

不加入待测土壤，作为空白样，重复上述操作；根据标准曲线得到空白样中的氮工作液浓度； 

不加入10wt%尿素溶液，作为无基质样，重复上述操作；根据标准曲线得到无基质样中的氮工作液浓度； 

脲酶活性=（测量样中的氮工作液浓度—空白样中的氮工作液浓度—无基质样中的氮工作液浓度）×50×n/5，n为分取倍数=浸出液体积／吸取滤液体积，单位：mg.g^-1.d^-1； 

所述的pH6.7的柠檬酸盐缓冲溶液的配制为将184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾溶于蒸馏水，用1mol/L NaOH将pH调至6.7，用水稀释定容至1000ml； 

按上述方法再求出对照土壤的脲酶活性； 

所述的微生物量碳的测量步骤为： 

称取待测土壤10g于25ml小烧杯中，置于真空干燥器中，同时内放一装有用50ml氯仿的小烧杯，用3号真空泵油密封；将密封好的真空干燥器连到真空泵上，抽真空至氯仿沸腾1-2分钟；然后用Shimadzu TOC500测定待测土壤提取液有机碳含量即为微生物量碳； 

按上述方法测定对照土壤的微生物量碳； 

按公式计算评价指数P_i；结果如表1所示； 

表1 

（4）确定土壤环境质量级别 

按公式计算评价指标值PI，公式中：P_i、W_i分别为评价因子的评价指数和权重； 

当PI＞0.86时，土壤质量为清洁， 

当0.68<PI≤0.86时，土壤质量为尚清洁， 

当0.43<PI≤0.68时，土壤质量为轻度污染， 

当PI≤0.43时，土壤环境质量为严重污染； 

本实施例土壤的评价指标值为：PI=P₁×W₁+P₂×W₂+P₃×W₃+P₄×W₄=0.58×0.121+0.62×0.423+0.74×0.281+0.43×0.175=0.616 

因为0.43<PI≤0.68，所以东营孤岛地区（取样点一）盐渍化-石油-重金属复合污染土壤质量为轻度污染。 

实施例2、东营孤岛地区盐渍化-石油-重金属复合污染土壤质量的微生物评价，待测土壤取自山东省东营市孤岛地区（取样点二），步骤如下： 

（1）选定微生物指标评价因子 

以土壤的呼吸作用强度、过氧化氢酶活性、脲酶活性和微生物量碳作为评价因子； 

（2）确定微生物指标评价因子的权重（W_i） 

确定土壤的呼吸作用强度、过氧化氢酶活性、脲酶活性和微生物量碳的权重分别为0.121、0.423、0.281、0.175； 

（3）计算微生物指标评价因子的评价指数（P_i） 

分别将待测土壤和对照土壤置于花盆中，每盆装500g，于28℃，5000xl光照强度，恒温光照培养50天；整个培养过程中土壤湿度保持在土壤最大持水质量的50%～60%；培养完成后测定待测土壤和对照土壤的呼吸作用强度、过氧化氢酶活性、脲酶活性和微生物量碳； 

所述的对照土壤的含盐量≤0.3%，镍含量≤60mg.kg^-1、镉含量≤0.25mg.kg^-1、钒含量≤130mg.kg^-1，石油烃总量含量≤100mg.kg^-1； 

所述的待测土壤和对照土壤的呼吸作用强度、过氧化氢酶活性、脲酶活性和微生物量碳的测量方法同实施例1； 

按公式计算评价指数P_i；结果如表2所示； 

表2 

（4）确定土壤环境质量级别 

按公式计算评价指标值PI，公式中：P_i、W_i分别为评价因子的评价指数和权重； 

当PI＞0.86时，土壤质量为清洁， 

当0.68<PI≤0.86时，土壤质量为尚清洁， 

当0.43<PI≤0.68时，土壤质量为轻度污染， 

当PI≤0.43时，土壤环境质量为严重污染； 

本实施例土壤的评价指标值为：PI=P₁×W₁+P₂×W₂+P₃×W₃+P₄×W₄=0.34×0.121+0.47×0.423+0.42×0.281+0.63×0.175=0.468 

因为0.43<PI≤0.68，所以东营孤岛地区（取样点二）盐渍化-石油-重金属复合污染土壤质量为轻度污染。