一种J亚群禽白血病免疫胶体金抗体检测试纸条

摘要

本发明提供了一种J亚群禽白血病免疫胶体金抗体检测试纸条，其中最主要的是采用了原核表达后纯化的J亚群禽白血病病毒表面蛋白偶联免疫胶体金，利用该胶体金可以快速检测血清中的J亚群禽白血病抗体，进而为鸡群J亚群禽白血病精准快速诊断提供技术保障。通过Western Blot检测表达的gp85蛋白能够与JE9单抗和抗HIS标签抗体发生特异性反应，表明具有良好的特异性。

说明书

技术领域

本发明涉及预防兽医学检验领域，具体涉及了一种J亚群禽白血病免疫胶 体金抗体检测试纸条。

背景技术

J亚群禽白血病是由J亚群禽白血病病毒（ALV-J）引起的一种肿瘤性疾病， 临床上主要以髓细胞性白血病多见，研究发现J亚群禽白血病毒还能诱发淋巴 细胞性白血病、成髓细胞性白血病、成红细胞性白血病等多种肿瘤性疾病。J亚 群禽白血病已经从最初的感染肉鸡到现在的感染蛋鸡、火鸡及地方鸡品种。近 几年，禽白血病的流行呈现高感染率、高发病率，早期感染普遍、发病日龄明 显提前，混合感染促使病毒重组频率增高，宿主范围扩展、肿瘤趋于多样化等 新特点。目前，与J亚群白血病密切相关的血管瘤病在蛋种鸡群及商品蛋鸡群 中的爆发，给养禽业造成了巨大的损失。基于其病毒特性，一直未有行之有效 的疫苗、药物防治此病。国外通过净化控制本病的发生。由于净化周期长、成 本高，在我国目前还未能有效实施，只能通过淘汰感染鸡只进行大群净化，快 速精准检测J亚群禽白血病的感染对于净化控制J亚群禽白血病具有极其重要 的意义。

（1）ALV-J表面蛋白（SU）的生物学功能

ALV-J属于反转录病毒。病毒囊膜蛋白可分为由gp85基因编码的表面蛋白 （surface protein,SU）和gp37基因编码的跨膜蛋白（transm-embrane protein， TM），二者在一起形成二聚体，病毒囊膜蛋白决定亚群的特异性。SU含有病毒--- 受体决定簇，负责识别靶细胞膜上的特异性受体，TM负责介导病毒与细胞的融 合过程。SU刺激机体产生的中和抗体具有亚群特异性。ALV-J表面蛋白的核酸 序列与其它ALV亚群同源性只有40%。ALV-J囊膜蛋白的SU可特异性识别J亚 群禽白血病毒刺激机体产生的中和抗体，对于J亚群禽白血病的诊断具有重要 意义。

（2）J亚群禽白血病诊断方法研究现状

对于J亚群禽白血病的诊断方法国内外都有过许多报道，主要为病毒分离 与鉴定、免疫学检测方法、核酸分子检测方法。病毒的分离与鉴定耗费时间过 长且只适用于实验室诊断；免疫学检测方法如间接免疫荧光、ELISA方法等都需 要一定的专业知识和设备，不适用于养殖场的现场检测；核酸分子检测方法如 PCR等容易受到假阳性、假阴性及抗原变异的干扰，且上述检测方法均建立在实 验室基础上并需要专业操作人员操作。因此研制快速精准并易于操作携带的J 亚群禽白血病免疫胶体金抗体检测试纸条，对于我国鸡群J亚型禽白血病的净 化防制具有重要的现实意义。

发明内容

针对现有存在的上述问题，本发明提供了一种J亚群禽白血病免疫胶体金 抗体检测试纸条，其中最主要的是采用了原核表达后纯化的J亚群禽白血病病 毒表面蛋白偶联免疫胶体金，利用该胶体金可以快速检测血清中的J亚群禽白 血病抗体，进而为鸡群J亚群禽白血病精准快速诊断提供技术保障。通过Western  Blot检测表达的gp85蛋白能够与JE9单抗和抗HIS标签抗体发生特异性反应， 表明具有良好的特异性。

本发明所采用的具体技术方案是：

通过比对临床病例，特别是混合肿瘤、单纯髓细胞瘤、血管瘤、纤维肉瘤、 组织肉瘤、成红细胞瘤、肾瘤等病例，通过抗体及PCR检测确定ALV-J感染，DF-1 细胞培养并分离病毒，比对分析各病毒表面蛋白的关键保守基因序列，最终确 定采用ALV-J gp85基因片段，并根据上述表面蛋白的关键保守基因序列设计引 物扩增保守序列，最终原核表达的SU蛋白制备试纸条，所获得的试纸条可以完 全实现J亚群禽白血病的精准诊断。

其具体过程如下：

根据现有的ALV-J设计特异性引物，所述的正向引物为 5’-GCGGATCCATCAAGAACGGAACAACACG-3’，含BamHⅠ酶切位点，其基因序列如 SEQ ID NO.2所示；反向引物为5’-GCGCGCAAGCTTGTCCCCACAAATCAAGAAAATA-3’, 含Hind III酶切位点，其基因序列如SEQ ID NO.3所示。

利用上述一对引物以J亚群禽白血病病毒的DNA为模版进行PCR扩增，其 中优选采用NXO1O1(ALV-J,DQ115805.1)的DNA为模板；

PCR反应条件为：95℃5min，充分变性后进入循环体系：95℃40s，65℃ 1min，72℃1min，循环35次后72℃延伸10min。

扩增产物测序，其基因序列如SEQ ID NO.1所示；

利用该基因片段连接pET30a载体，得到了重组载体pET30a—gp85重组质 粒，使用1mmoL IPTG诱导表达得到带有HIS标签的融合蛋白His-gp85，进而利 用该蛋白与胶体金偶联后涂布于硝酸纤维素膜上，制成试纸条采用间接法测抗 体。

本发明的这种试纸条适用于大规模批量生产，易于操作携带，可快速诊断J 亚群禽白血病，检测时间只需5分钟，一个中等养殖规模的鸡场，从制备血清 到检测，只需在二十分钟内即可快速确定其鸡群J亚群禽白血病的感染状态， 对于我国J亚群禽白血病及时发现和适时净化具有重要意义，且特异性强可以 完全实现J亚群禽白血病的精准诊断。

与现有技术相比，如“J亚群禽白血病抗体快速检测试纸卡及其应用”，其 所用鼠抗鸡IgGFc片段单克隆抗体较多抗具有良好的特异性，但只能针对某一 特定的抗原决定簇，用途单一；

而我们所用的多克隆抗体所使用的是SU蛋白，含有多个抗原位点，能够与 不同的抗原决定簇进行结合，因而更加准确的检测到血清中的抗体从而确定鸡 群的感染状况，较之现有的检测试纸能够更加有效准确的检测出鸡群感染状况

本发明所获得的试纸条具体结构如下：

一种J亚群禽白血病免疫胶体金抗体检测试纸条，包括支撑层和吸附层， 吸附层固定在支撑层上，吸附层从测试端依次为样品吸附纤维层、金标SU蛋白 纤维层、纤维素膜层及吸水材料层。在所述的纤维素膜层中部有一条包被J亚 群禽白血病SU蛋白的检测线和一条包被SU蛋白兔多克隆抗体的质控线，所述 的纤维素膜层一端嵌入金标SU蛋白纤维层，另一端嵌入吸水材料层中。

其中，所述的支撑层用不吸水的硬质塑料条制成；

所述的测试端的样品吸附纤维层用玻璃纤维制成；

所述的金标SU蛋白纤维层吸附有胶体金标记的高纯度的SU蛋白；

所述的纤维素膜层用硝酸纤维素膜制成；

所述的吸水材料层用吸水纸制成；

所述的SU蛋白兔多克隆抗体为采用常规技术，利用多克隆抗体制备技术将 SU蛋白免疫新西兰大白兔获得，为现有技术，在此不再赘述。

上述的各种材料均为市购。

本发明所述胶体金试纸条的制备方法如下：具体步骤：

1）在纤维素膜层的不同位置上分别包被SU蛋白和SU蛋白的多克隆抗体， 分别形成检测线和质控线；具体步骤为：将包被浓度为2mg/ml的SU蛋白溶液 按2ul/cm的速度喷于检测层上作为检测线，将包被浓度为2mg/ml的SU蛋白多 克隆抗体按2ul/cm的速度喷于检测线下方的检测层上作为质控线，37℃下干燥 30min，从而制备得到检测线和质控线；

其中所述的2mg/ml的SU蛋白溶液用pH为7.5，0.02M的PBS缓冲液稀释 获得的；

2）金标抗体纤维层的制备，具体步骤为：以柠檬酸钠还原法制备金溶液， 即在100ml沸腾的0.02wt%氯金酸水溶液中加入1ml的1wt%柠檬酸三钠溶液， 可获得直径在45nm左右的胶体金；

通过直接混合的方式以0.2mol/L的K2CO3溶液调节上述获得的胶体金pH至 7.0-8.5，以1：1000的标记比例将待标记的SU蛋白加入到上述调整pH之后的 胶体金中，标记20min后，再向上述标记后的胶体金溶液中加入10wt%的 PEG10000水溶液；至PEG10000的终浓度为0.1wt%，4℃、3000rpm离心30min， 除去未结合的胶体金颗粒，4℃、13000rpm离心30min，弃上清液，获得初步纯 化的金标抗体；

其中所采用的10wt%的PEG10000水溶液是利用市售的PEG10000，用双蒸水 把它稀释成10wt%的水溶液获得的；之后利用上述获得的10wt%的PEG10000溶 液加入到标记后的胶体金溶液中，利用胶体金溶液对其进行稀释，使PEG10000 的最终浓度变成0.1wt%即可；

按2mg/ml为1：100的的比例用含0.1-2wt%BSA的0.001-0.2mol/L磷酸盐 缓冲液稀释胶体金标记的SU蛋白，将上述稀释后的金标抗体液按50ul/cm²的速 度喷于玻璃纤维素膜中，4℃低温真空干燥；

3）采用现有工艺和设备组装支撑层、纤维素膜层、金标SU蛋白纤维层、 吸水材料层和样品吸附纤维层既得目标试纸条。

综上所述，采用本发明的这种J亚群禽白血病免疫胶体金抗体检测试纸条， 其中最主要的是采用了原核表达后纯化的J亚群禽白血病病毒表面蛋白偶联免 疫胶体金，利用该胶体金可以快速检测血清中的J亚群禽白血病抗体，进而为 鸡群J亚群禽白血病精准快速诊断提供技术保障。通过Western Blot检测表达 的gp85蛋白能够与JE9单抗和抗HIS标签抗体发生特异性反应，表明具有良好 的特异性，具有广泛的推广和应用价值。

附图说明

图1为PCR扩增ALV-J gp85基因片段电泳图，

途中M为DL2500marker;1为ALV-J gp85基因片段;

图2为pET30a-gp85重组质粒酶切鉴定结果电泳图；

图中M为DL5000marker；1为使用BamH I和Hind III酶切pET30a-gp85 后获得的片段；

图3为pET30a-gp85重组质粒在BL21中诱导表达电泳图谱；

图中M为170KD protein marker；1为加入IPTG0h后;2为加入IPTG1h 后;3为加入IPTG2h后;4为加入IPTG3h后；

图4为SU蛋白纯化后的SDS-PAGE分析结果图，

图中M为170KD protein marker;1为SU蛋白纯化产物；

图5Western blot法检测SU蛋白，

图中M为170KD protein marker;1为杂蛋白；2为目的蛋白；

图6ALV-J抗体检测试纸条检测结果示意图，

上方为阴性血清样品检测结果呈阴性，下方为阳性血清样品检测结果呈阳 性。

具体实施方式

本实施例中所采用的具体试剂和仪器为：

（1）主要试剂

HRP酶标二抗为博奥森生物有限公司产品；

TMB单组份底物显色溶液，DAB显色试剂盒为天根公司产品；

Taq聚合酶，限制性内切酶HindⅢ、BamH I、T4连接酶、dNTP、DNA Marker 为大连宝生物有限公司产品；

PCR产物纯化试剂盒、质粒抽提试剂盒为OMEGA公司产品；

蛋白预染Marker为北京全式金生物技术有限公司产品；

胰蛋白胨（Tryptone）及酵母抽提物（Yeast Extract）为Oxiod公司产品；

其余试剂为国产分析纯试剂。

（2）主要仪器

PCR仪、分光光度计为Eppendorf公司产品；

低温高速离心机为湖北湘仪公司产品；

凝胶成像系统为北京君意公司产品；

酶标仪为Thermo公司产品；

恒温摇床为上海申能博彩公司产品；

恒温培养箱、超净工作台为上海博迅公司产品；

电泳仪、SDS-PAGE电泳槽、Western-blot膜转印装置为北京六一公司产品；

细胞超声波粉碎机为宁波新芝生物有限公司产品。

除上述列出内容外，本发明为提及的部分均采用现有技术。

实施例1ALV-J gp85基因的克隆及测序

根据现有ALV-J前病毒基因组DNA gp85囊膜蛋白基因设计引物，正向引物 为5’-GCGGATCCATCAAGAACGGAACAACACG-3’，含BamHⅠ酶切位点（下划线部分） 其基因序列如SEQ ID NO.2所示；反向引物为 5’-GCGCGCAAGCTTGTCCCCACAAATCAAGAAAATA-3’,含Hind III酶切位点（下划线 部分），其基因序列如SEQ ID NO.3所示。

利用上述一对引物以J亚群禽白血病病毒的DNA为模版进行PCR扩增，其 中所选择的J亚群禽白血病病毒为NX0101(ALV-J,DQ115805.1)；

PCR反应条件为：95℃5min，充分变性后进入循环体系：95℃40s，65℃ 1min，72℃1min，循环35次后72℃延伸10min。

将PCR产物于1%琼脂糖凝胶中电泳，结果见图1，获得了504bp的片段。

扩增的片段采用常规方法连接于PTZ57R/T克隆载体进行基因测序，将对应 的氨基酸序列与近三年我国分离得到的16株不同肿瘤型ALV-J氨基酸保守序列 进行分析比对：与其中9株的同源性高于98%，最低同源性也可达87%，确保所 制备的gp85蛋白可与我国ALV-J流行毒株感染鸡只产生抗原抗体反应。

将pET30a和连接了目的基因的PTZ57R/T克隆载体分别用限制性内切酶 BamHⅠ和Hind III进行双酶切10min，按照胶回收试剂盒说明书的要求分别回 收大片段和目的基因片段；

将上述获得的目标物22℃过夜连接，其中连接体系为:pET30a载体0.5μl， gp85基因片段1μl，dH2O20μl，T4DNA连接酶1μl，10x buffer2.5μl， 总体积共25μl，获得连接产物pET30a—gp85重组质粒。

将连接产物pET30a—gp85重组质粒按照常规方法转入CaCl2制备的感受态 细菌BL21中，涂布于含有卡那霉素的LB平板中，37℃过夜生长，次日挑取单 菌落，摇菌，提取质粒进行双酶切鉴定后送去测序，确认其中具有如SEQ ID NO.3 所示的序列，可见获得的gp85保守基因504bp的片段已经成功克隆入pET30a —gp85重组质粒中。

实施例2gp85蛋白的表达和纯化

将测序后含有重组质粒的阳性BL21菌接种于含Kan(终浓度为10μg/ml)的 LB液体培养基中（市购常规培养基，其中含有1%(w/v)Tryptone，0.5%（w/v) Yeast Extract，1%(w/v)NaCl，0.1mg/ml Kanamycin)，37℃振荡(200rpm)， 培养至OD600=1.0，加入浓度为500mMol的IPTG至整个培养基中IPTG的终浓度 为1mmol/L，37℃继续培养3h，同时设未诱导的重组质粒转化BL21菌作为对照。

经SDS-PAGE分析显示，检测步骤如下：收集培养的工程菌菌液，5000rpm， 离心5min，弃上清，沉淀按照100ml初始培养基加入标准PBS3ml的比例，向沉 淀中加入标准的PBS获得重悬液，沉淀重悬后分装与5ml离心管中每管3ml。将 离心管置于冰水混合物的烧杯内，用超声破菌仪超声破菌，120W，工作1s，间 歇2s，超声2个循环；将超声破菌液转入50ml离心管中，配平，放入高速冷却 离心机中，8000rpm，4℃，离心10min，然后用SDS-PAGE电泳检测；结果上清 中无蛋白（未显示），蛋白存在于沉淀中，说明目的蛋白gp85以包涵体形式表 达，如图3所示，目的SU蛋白大小约为18KD；

SU蛋白的纯化步骤如下：

将上述离心获得的沉淀用9倍体积的洗涤液I重悬沉淀，静置5min后， 8000rpm，5min弃上清。用9倍体积的洗涤液II重悬沉淀，静置5min后，8000rpm， 5min，弃上清，保留沉淀。用9倍体积的洗涤液III重悬沉淀，静置5min后， 8000rpm，5min，弃上清，保留沉淀。按100ml菌液加8ml溶解液，4℃过夜。 8000rpm，离心5min。取上清，即为纯化蛋白。

包涵体纯化所述试剂配制方法：

（1）细菌重悬液(250ml):PBS(NaCl2g,KCl0.05g,Na₂HPO₄0.36g KH₂PO₄0.06g),1mm/L EDTA.

（3）溶液I（250ml）：500mmol/L Tris-Cl（pH=6.0），50mmol/L NaCl， 50mmol/L EDTA

（3）溶液II（250ml）：溶液I，1M尿素

（4）溶液III（250ml）：溶液I，2M尿素

（5）包涵体溶解液（250ml）：溶液I，4M尿素

SDS-PAGE法与Western Blot法检测纯化后的蛋白（附图4和5）。得到的 蛋白经过Bradford法测定蛋白含量，稀释到0.5mg/mL来分装-80℃保存备用。

上述使用的SDS-PAGE法为常规方法，未提及的试剂为常规方法规定使用的 试剂，其具体操作步骤如下：

1）将玻璃板洗干净，用夹子固定，垂直放置，配置12%分离胶，快速注入 到两玻璃板之间，胶上部加蒸馏水封口，以保持胶面平整。待分离胶凝固后， 倒去分离胶表面的蒸馏水，用滤纸吸去残留水。注入浓缩胶，快速插入梳子， 并注意防止气泡的产生；

2）取纯化后的SU蛋白加入15-20μl4x SDS上样buffer，煮沸10min；

3）往电泳槽加入1×Tris-甘氨酸缓冲液，待浓缩胶凝固，小心拔掉梳子， 用缓冲液冲洗加样孔，用微量进样器上样，10μl/孔，正确连接电泳槽正负极， 打开电源。120V电压电泳，电泳至溴酚蓝到达胶的底部时停止电泳；

4）染色：取下凝胶，用蒸馏水冲洗，放入考马斯亮蓝染色液中，染色4h 以上；

5)脱色：将凝胶放入脱色液中，置于摇床上脱色，期间更换3次以上脱色 液，待凝胶蓝色背景全部脱去停止，将凝胶放入蒸馏水中终止脱色；拍照保存， 如图4所示，出现了大小约为18KD的目的SU蛋白条带；

6）剪一张与Western Blot凝胶大小相同的NC膜，用去离子水浸透，同时 将与凝胶大小相同的两张滤纸及纤维垫用转印缓冲液浸透；

7）按三明治法安装转印装置，即负极夹-纤维垫-滤纸-凝胶-NC膜-滤纸- 纤维垫-正极夹，使NC膜位于转印的正极面，凝胶位于负极面，其间无任何气 泡间隙。将转印装置放入转移电泳仪中，加入转移缓冲液，140mA电泳2h。

8）转印结束后，将转移后的NC膜用去离子水漂洗一遍，将NC膜浸泡于封 闭液中，4℃封闭过夜；

9）用PBST洗涤NC膜三遍，每次10min；

10）使用免疫小鼠阳性血清为一抗，NC膜与一抗37℃反应1h，用PBST洗 膜三次，10min/次；

11）NC膜置于过HRP标记的羊抗鼠IgG中，37℃反应1h，用PBST洗膜三 次，10min/次；

12）使用DAB显色试剂盒避光显色；此时应密切观察显色过程，并在较浅 本底且达到适当显色强度时流水终止显色；拍照保存，如图5所示，出现了大 小约为18KD的目的SU蛋白条带。

实施例3gp85蛋白的活性检测

使用上述纯化得到的His-gp85蛋白包被ELISA板，使用酶联免疫吸附试验 检测该蛋白的生物学活性。以IDEXX公司生产的ALV-J抗体检测试剂盒检测为 阳性的鸡血清为阳性对照，健康SPF鸡血清为阴性对照，HRP标记羊抗鼠IgG酶 标二抗按说明书使用。结果显示阳性对照与阴性对照的OD值比值大于2.1，说 明该蛋白有良好的生物学活性和抗原性。

ELISA具体步骤如下：

1）包被：取纯化的重组SU蛋白，以生理盐水稀释至最佳浓度，包被反应 板，100μl/孔，4℃过夜；

2）洗涤：甩去酶标板中的包被液，用PBST（PBS，0.05%Tween-20）加满 各孔，摇床震荡3min，弃去PBST，洗涤3次，3min/次，拍干；

3)封闭：各孔加入封闭液（3%脱脂乳），350μl/孔，置37℃培养箱孵育 0.5h，洗涤3次，3min/次，拍干；

4)加样：将待待检血清按梯度稀释后加入包被板，100μl/孔，同时设立 阴阳性血清对照；置37℃培养箱孵育1h，洗涤3次，3min/次，拍干；

5)用封闭液将HRP羊抗鼠IgG酶标二抗按1:5000稀释，100μl/孔，置37℃ 培养箱孵育1h，洗涤3次，3min/次，拍干；

6)显色：使用TMB单组份显色试剂盒（TIANGEN公司产品）按100μl/孔 加入包被板，室温下避光显色20min加终止液，2M H2SO4终止显色；

7)用酶联免疫检测仪测其在波长450nm检测各个孔的OD值，阴性对照OD450 值为N，阳性对照OD450值为P。若P/N>2.1判为阳性。

实施例4J亚群禽白血病免疫胶体金抗体检测试纸条的制备

1）在纤维素膜层的不同位置上分别包被SU蛋白和SU蛋白的多克隆抗体， 分别形成检测线和质控线；具体步骤为：将包被浓度为2mg/ml的SU蛋白溶液 按2ul/cm的速度喷于检测层上作为检测线，将包被浓度为2mg/ml的SU蛋白多 克隆抗体按2ul/cm的速度喷于检测线下方的检测层上作为质控线，37℃下干燥 30min，从而制备得到检测线和质控线；

其中所述的2mg/ml的SU蛋白溶液用pH为7.5，0.02M的PBS缓冲液稀释 获得的；

2）金标抗体纤维层的制备，具体步骤为：以柠檬酸钠还原法制备金溶液， 即在100ml沸腾的0.02wt%氯金酸水溶液中加入1ml的1wt%柠檬酸三钠溶液， 可获得直径在45nm左右的胶体金；

通过直接混合的方式以0.2mol/L的K2CO3溶液调节上述获得的胶体金pH至 7.0-8.5，以1：1000的标记比例将待标记的SU蛋白加入到上述调整pH之后的 胶体金中，标记20min后，再向上述标记后的胶体金溶液中加入10wt%的 PEG10000水溶液；至PEG10000的终浓度为0.1wt%，4℃、3000rpm离心30min， 除去未结合的胶体金颗粒，4℃、13000rpm离心30min，弃上清液，获得初步纯 化的金标抗体；

其中所采用的10wt%的PEG10000水溶液是利用市售的PEG10000，用双蒸水 把它稀释成10wt%的水溶液获得的；之后利用上述获得的10wt%的PEG10000溶 液加入到标记后的胶体金溶液中，利用胶体金溶液对其进行稀释，使PEG10000 的最终浓度变成0.1wt%即可；

按2mg/ml为1：100的的比例用含0.1-2wt%BSA的0.001-0.2mol/L磷酸盐 缓冲液稀释胶体金标记的SU蛋白，将上述稀释后的金标抗体液按50ul/cm²的速 度喷于玻璃纤维素膜中，4℃低温真空干燥；

3）采用现有工艺和设备组装支撑层、纤维素膜层、金标SU蛋白纤维层、 吸水材料层和样品吸附纤维层既得目标试纸条。

试验例1

2013年10月山东省潍坊市某养鸡场发生以病鸡主要表现为困倦、虚弱、鸡 冠肉髯苍白、并有消瘦脱水等症状的传染病，经山东农业大学实验室显微镜图 片和PCR方法检查诊断为J亚群禽白血病感染；

发明人采集鸡场病鸡的血清，利用本发明实施例4制备的试纸条逐条进行 检测，检测结果均为阳性，与经山东农业大学实验室显微镜图片和PCR方法检 查诊断完全一致，证明本发明所提供的试纸条不需要任何的设备，就可以进行 临床样本的检测，且特异性强，操作简便、快速，结果显示直观、准确，能广 泛应用于基层对于J亚群禽白血病的检测。

试验例2

2013年11月新泰市某养鸡场发生以病鸡鸡冠肉髯苍白、消瘦、脱水、腹部 膨大、可触摸到肿大的肝脏为主要特征的疾病，经山东农业大学实验室PCR检 测为J亚群禽白血病。

发明人采集活鸡的血清样本，利用本发明实施例4制备的试纸条逐条进行 检测，检测结果均为阳性，与经山东农业大学实验室PCR方法检查诊断完全一 致，证明本发明所提供的试纸条不需要任何的设备，就可以进行临床样本的检 测，且特异性强，操作简便、快速，结果显示直观、准确，能广泛应用于基层 对于J亚群禽白血病的检测。