一种参芪扶正注射液指纹图谱的建立方法

摘要

本发明提供一种参芪扶正注射液指纹图谱的建立方法，该方法包括采用超高压液相色谱质谱联用仪对参芪扶正注射液进行检测，其中色谱条件包括：色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18，2.1mm×100mm，1.8μm；流动相：流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液；采用梯度洗脱，洗脱程序如下：0~0.5min，流动相A为95%，流动相B为5%；0.5~10min，流动相A为95%~75%，流动相B为5%~25%；10~15min，流动相A为75%~45%，流动相B为25%~55%；15~18min，流动相A为45%~0%，流动相B为55%~100%；18~20min，流动相A为0%，流动相B为100%。

说明书

技术领域

本发明属于药物检测技术领域，具体涉及一种参芪扶正注射液指纹图 谱的建立方法。

背景技术

中药复方质量控制是制约中药现代化发展的关键问题之一。中医理论 强调中药的整体效应，重视在药效上的协同作用，以中药内一、二个有效 成分作为定性、定量指标远不能有效地控制和评价中药的质量，更难以反 映其安全性和有效性。中药复方是两味以上中药组合应用于疾病治疗的复 方制剂，其质量控制的难度较单味中药更甚。近年来，中药指纹图谱和特 征指纹图谱已广泛应用于质量控制，其中中药特征图谱系指从中药指纹图 谱中选取若干专属性强的色谱峰或色谱峰组合组成特征指纹图谱，通过特 征指纹峰的有无及变化来监控中药质量。在2010年版《中国药典》中， 特征指纹图谱已被应用于多种中药中间体成分的质量控制中。

超高效液相色谱技术（UHPLC）是色谱技术的一大突破，以超高速度、 超高灵敏度、超高分离度为优势，利用更小的色谱柱填料技术得到了更快、 更灵敏的检测效果，在国外被广泛利用于农残、药物代谢等方面，在国内 的应用也越来越普遍。

色谱质谱联用技术也是近年来发展迅速的一种高端分析技术，其中液 相色谱质谱联用技术（LC-MS）是继气相色谱质谱联用技术（GC-MS）广 泛应用后，逐渐被认识和接受的另一种联用技术，但由于仪器价格昂贵， 还未得到广泛应用。液质联用仪采用的离子化技术，不仅能解决一些无紫 外吸收成分的检测问题，如皂苷类成分，而且可以得到被离子化成分的精 确分子量，对于成分及其结构的鉴别和确认提供了数据支撑。

参芪扶正注射液是中药大输液，具有益气扶正的功效，用于肺脾气虚 引起的神疲乏力，少气懒言，自汗眩晕以及肺癌、胃癌见上述证候者的辅 助治疗，为国家中药保护品种，保护品种号：ZYB2072004073。其质量标 准中，【指纹图谱】项采用高效液相色谱-紫外检测器检测，有一定的局限 性，如占主要含量的皂苷类成分在紫外无吸收，通过增加高效液相色谱- 蒸发光散射检测器检测，可以对皂苷类成分进行监控，但样品前处理复杂， 分析时间也很长，均不能全面、快捷地对其主要成分进行监控，有待改进。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是弥补已有技术的不足，目的在于提供一 种参芪扶正注射液指纹图谱的建立方法。由此方法建立的指纹图谱可以作 为标准指纹图谱，能够应用于鉴别参芪扶正注射液。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一种参芪扶正注射液指纹图谱的建立方法，该方法包括采用超高压液相 色谱质谱联用仪，例如超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用仪对参芪 扶正注射液进行检测，其中色谱条件包括：

色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18，2.1mm×100mm，1.8μm；

流动相：流动相A为0.1%体积的甲酸水溶液，流动相B为0.1%体积的 甲酸乙腈溶液；

采用梯度洗脱，洗脱程序如下，其中流动相比例均为体积百分比：

0~0.5min，流动相A为95%，流动相B为5%；

0.5~10min，流动相A为95%~75%，流动相B为5%~25%；

10~15min，流动相A为75%~45%，流动相B为25%~55%；

15~18min，流动相A为45%~0%，流动相B为55%~100%。

18~20min，流动相A为0%，流动相B为100%。

优选地，所述色谱条件还包括：

流速为0.35ml/min；

柱温为40℃；

进样量为5μl。

优选地，上述参芪扶正注射液指纹图谱的建立方法中，质谱的条件包括：

离子源为ESI源，负离子方式检测；

雾化气压力：35psig；

干燥气温度：350℃；

干燥气流速：10L/min；

毛细管电压：3500V；

毛细管出口电压：135V。

优选地，上述参芪扶正注射液指纹图谱的建立方法还包括通过以下步 骤制备对照品溶液：取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品、黄芪甲苷对照品适量， 精密称定，加甲醇制成每ml各含毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.004mg、黄芪甲苷 0.006mg的溶液，即得。

优选地，上述参芪扶正注射液指纹图谱的建立方法还包括通过以下步 骤制备供试品溶液：取参芪扶正注射液，用0.22um微孔滤膜滤过，即得。

优选地，上述参芪扶正注射液指纹图谱的建立方法包括如下步骤：

（1）制备对照品溶液：取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品、黄芪甲苷对 照品适量，精密称定，加甲醇制成每ml各含毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.004mg、 黄芪甲苷0.006mg的溶液，即得；

（2）制备供试品溶液：取参芪扶正注射液，用0.22um微孔滤膜滤过， 即得；

（3）测定：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl注入超高压液 相色谱质谱联用仪，例如超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用仪， 根据以下条件进行测定，得到参芪扶正注射液指纹图谱：

其中，色谱条件包括：

色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18，2.1mm×100mm，1.8μm；

流动相：流动相A为0.1%体积的甲酸水溶液，流动相B为0.1%体积的 甲酸乙腈溶液；

采用梯度洗脱，洗脱程序如下，其中流动相比例均为体积百分比：

0~0.5min，流动相A为95%，流动相B为5%；

0.5~10min，流动相A为95%~75%，流动相B为5%~25%；

10~15min，流动相A为75%~45%，流动相B为25%~55%；

15~18min，流动相A为45%~0%，流动相B为55%~100%。

18~20min，流动相A为0%，流动相B为100%。

优选地，所述色谱条件还包括：

流速为0.35ml/min；

柱温为40℃；

优选地，质谱的条件包括：

离子源为ESI源，负离子方式检测；

雾化气压力：35psig；

干燥气温度：350℃；

干燥气流速：10L/min；

毛细管电压：3500V；

毛细管出口电压：135V。

优选地，上述参芪扶正注射液指纹图谱的建立方法还包括：对多个参芪 扶正注射液指纹图谱进行比较，选出共有特征峰，得到参芪扶正注射液特 征指纹图谱。

优选地，上述参芪扶正注射液指纹图谱的建立方法中，所述参芪扶正注 射液指纹图谱或参芪扶正注射液特征指纹图谱中包含18个特征峰，各特征 峰的保留时间如下：

峰1：7.1min、峰2：7.5min、峰3：8.1min、峰4：8.6min、峰5：9.2min、 峰6：9.9min、峰7：10.9min、峰8：11.3min、峰9：11.7min、峰10：12.7min、 峰11：13.4min、峰12：13.7min、峰13：14.4min、峰14：14.8min、峰15： 15.1min、峰16：15.5min、峰17：15.9min、峰18：16.3min。

优选地，上述参芪扶正注射液指纹图谱的建立方法中，所述参芪扶正注 射液指纹图谱或参芪扶正注射液特征指纹图谱中，以对照品黄芪甲苷为参 照峰，计算各特征峰的相对保留时间如下：

峰1：0.52、峰2：0.54、峰3：0.59、峰4：0.62、峰5：0.66、峰6：0.72、 峰7：0.79、峰8：0.82、峰9：0.85、峰10：0.92、峰11：0.97、峰12：1.00、 峰13：1.04、峰14：1.07、峰15：1.10、峰16：1.13、峰17：1.16、峰18： 1.19。

优选地，在参芪扶正注射液指纹图谱或参芪扶正注射液特征指纹图谱 中，峰2和峰12分别为毛蕊异黄酮葡萄糖苷和黄芪甲苷；优选地，毛蕊异 黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷峰面积与相应参照物峰面积比值在0.5～1.5之间。

本发明还提供一种参芪扶正注射液的鉴定方法，该方法包括将根据上述 方法建立待测样品指纹图谱或特征指纹图谱与根据上述方法建立的标准指 纹图谱或特征指纹图进行比较，以鉴别真伪。

在一个优选的实施方案中，本发明提供一种参芪扶正注射液指纹图谱 的建立方法，该方法包括以下步骤：

制备毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷的混合对照品溶液，浓度分别为 含毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.004mg/ml，含黄芪甲苷0.006mg/ml；

取参芪扶正注射液滤过液作为供试品溶液；

采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用仪分析上述对照品溶 液和供试品溶液，色谱条件为：

色谱柱为Agilent Zorbax Eclipse Plus C18，2.1mm×100mm，1.8μm；

流动相为0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液，

梯度洗脱；

流速为0.35ml/min；

柱温为40℃；

进样5μl；

得到参芪扶正注射液超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱指纹图谱 （总离子流图）；

所述梯度洗脱步骤为：0～0.5分钟，流动相乙腈-水为5:95；0.5～10 分钟，流动相乙腈-水由5:95渐变为25:75；10～15分钟，流动相乙腈-水 为25:75渐变为55:45；15～18分钟，流动相乙腈-水为55:45渐变为100:0； 18～20分钟，流动相乙腈-水为100:0。

根据指纹图谱（总离子流图）及从指纹图谱（总离子流图）中提取得 到的特征指纹图谱（提取离子流图），确定参芪扶正注射液特征指纹图谱， 以此监控参芪扶正注射液的质量。

所述梯度洗脱的步骤也可用表1表示：

表1梯度洗脱表

按照本发明的方法，通过对100批参芪扶正注射液的总离子流图（TIC） 分析比较，找出其共有特征峰，用这些共有特征峰离子质量数提取得到提 取离子流图（EIC），标出各共有特征峰的保留时间Rt，得到参芪扶正注射 液特征指纹图谱。

其共有特征峰为18个，其保留时间Rt值及质量数分别为7.1min （471.2083）、7.5min（491.1195）、8.1min（441.1919）、8.6min（309.1555）、 9.2min（187.0976）、9.9min（441.1766）、10.9min（593.1876）、11.3min （507.1508）、11.7min（463.1610）、12.7min（991.5119）、13.4min（991.5119）、 13.7min（829.4591）、14.4min（871.4697）、14.8min（871.4697）、15.1min （871.4697）、15.5min（913.4650）、15.9min（913.4650）、16.3min（913.4650）， 其中Rt值为7.5min、13.7min的色谱峰经确证为毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄 芪甲苷；与黄芪甲苷参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰的相对保留 时间，其相对保留时间应在规定值的±5%之内，规定值依次为0.52、0.54、 0.59、0.62、0.66、0.72、0.79、0.82、0.85、0.92、0.97、1.00、1.04、1.07、 1.10、1.13、1.16、1.19；毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷峰面积与相应参 照物峰面积比值应在0.5～1.5之间。

本发明建立的特征指纹图谱能够应用于鉴别参芪扶正注射液。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

参芪扶正注射液质量标准中，【指纹图谱】项采用高效液相色谱-紫外 检测法测定参芪扶正注射液的指纹图谱，在一定程度上达到了监控其质量 的目的，但其中占主要含量的皂苷类成分却在紫外基本无吸收；【含量测 定】项采用香草醛-冰醋酸紫外分光光度法测定总皂苷含量，采用高效液相 色谱-蒸发光散射检测法测定黄芪甲苷含量，但仍不能全面反映皂苷类各成 分情况，在企业内控中，通过增加高效液相色谱-蒸发光散射检测器检测指 纹图谱，可以对皂苷类成分进行监控，但需要增加样品前处理，分析时间 也很长。

故本发明方法建立的参芪扶正注射液超高效液相色谱-四级杆飞行时 间质谱特征指纹图谱技术标准，通过特征指纹图谱中共有峰的有无及特 征，快速有效地全面监控药品质量，保证质量的稳定、均一、可控。本发 明还具有方法先进、稳定性和重现性好等特点。

附图说明

图1是本发明的参芪扶正注射液总离子流图，图中从左到右的箭头所 指分别是特征峰1至18；

图2是参芪扶正注射液提取离子流图，图中从左到右的箭头所指分别 是特征峰1至18；

图3是混合对照品提取离子流图，图中峰号2、12依次指示为毛蕊异 黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷；

图4是本发明的参芪扶正注射液指纹图谱与伪品的对比图，图中1为 参芪扶正注射液正品，2为伪品（推测为丹参注射液），3为丹参滴注液。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。

实施例1

1仪器与试药

1.1仪器：安捷伦Agilent公司液质联用仪（1290UHPLC二元梯度泵、 内置真空脱气机、100位自动进样器、智能柱温箱、G6520B高精度四极杆 串联飞行时间质谱仪系统）；色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18（2.1 ×100mm，1.8μm）。

1.2试药：参芪扶正注射液，由丽珠集团利民制药厂提供。实验中所 用试剂乙腈、甲酸均为色谱纯，水为超纯水。

2方法与结果

2.1供试品溶液的制备：取参芪扶正注射液，用0.22um微孔滤膜滤过， 即得。

2.2混合对照品溶液的制备：取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品、黄芪甲 苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每ml各含毛蕊异黄酮葡萄糖苷 0.004mg、黄芪甲苷0.006mg的溶液，即得。

2.3色谱条件：色谱柱为Agilent Zorbax Eclipse Plus C18，2.1mm× 100mm，1.8μm；流动相为0.1%甲酸水溶液（A）、0.1%甲酸乙腈溶液（B）； 流速为0.35ml/min；柱温为40℃；进样5μl；采用表2的梯度洗脱方式：

表2梯度洗脱表

2.4质谱条件：离子源为ESI源，负离子方式检测；雾化气压力：35psig， 干燥气温度：350℃，干燥气流速：10L/min，Vcap毛细管电压：3500V， 毛细管出口电压：135V。

2.5测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5ul，注入液质 联用仪，测定，记录20分钟的图谱，即得。

2.6共有特征峰确定：通过对100批参芪扶正注射液的总离子流图分 析比较，找出其共有特征峰，具体见附图1，用这些共有特征峰离子质量 数提取得到提取离子流图，具体见附图2（具体是在在数据分析软件 Masshunter定性分析软件中，用提取离子功能，从图1中提取一系列目标 离子，从而得到图2），标出各共有特征峰的保留时间Rt，得到参芪扶正 注射液特征指纹图谱。其共有特征峰为18个，其保留时间Rt值及质量数 分别为7.1min（471.2083）、7.5min（491.1195）、8.1min（441.1919）、8.6min （309.1555）、9.2min（187.0976）、9.9min（441.1766）、10.9min（593.1876）、 11.3min（507.1508）、11.7min（463.1610）、12.7min（991.5119）、13.4min （991.5119）、13.7min（8294591）、14.4min（871.4697）、14.8min（871.4697）、 15.1min（871.4697）、15.5min（913.4650）、15.9min（913.4650）、16.3min （913.4650），其中Rt值为7.5min、13.7min的色谱峰经确证为毛蕊异黄酮 葡萄糖苷、黄芪甲苷，具体见附图3；与黄芪甲苷参照物峰相应的峰为S 峰，计算各特征峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5% 之内，规定值依次为0.52、0.54、0.59、0.62、0.66、0.72、0.79、0.82、0.85、 0.92、0.97、1.00、1.04、1.07、1.10、1.13、1.16、1.19；毛蕊异黄酮葡萄 糖苷、黄芪甲苷峰面积与相应参照物峰面积比值应在0.5～1.5之间。

2.7精密度试验：取同一个参芪扶正注射液供试品溶液连续进样6次， 提取特征峰，标出保留时间，以12号峰黄芪甲苷为S峰，计算其它各特 征峰相对保留时间，结果表明各特征峰相对保留时间RSD值均小于1%， 仪器的精密度良好。精密度结果见表3：

表3精密度结果

2.8稳定性考察：取同一个参芪扶正注射液供试品溶液，分别在0、1、 2、4、8、12小时进样，提取特征峰，标出保留时间，以12号峰黄芪甲苷 为S峰，计算其它各特征峰相对保留时间，结果表明各特征峰相对保留时 间RSD值均小于1%，供试品溶液在放置12小时内稳定。稳定性结果见 表4：

表4稳定性结果

2.9重复性试验：取同一批参芪扶正注射液6份，按照供试品溶液 制备方法制备，分别进样，提取特征峰，标出保留时间，以12号峰黄芪 甲苷为S峰，计算其它各特征峰相对保留时间，结果表明各特征峰相对保 留时间RSD值均小于1%，方法重复性好。重复性结果见表5：

表5重复性结果

2.10中间精密度：取同一批参芪扶正注射液，分别在不同日期、不 同分析人员等变动因素条件下，依法测定。

2.10.1不同分析时间：取同一批参芪扶正注射液，分别于不同日期 按供试品溶液制备方法制备，平行三份，进样，提取特征峰，标出保留时 间，以12号峰黄芪甲苷为S峰，计算其它各特征峰相对保留时间，结果 表明各特征峰相对保留时间RSD值均小于1%，结果见表6：

表6不同分析时间结果

2.10.2不同分析人员：取同一批参芪扶正注射液，不同人员按供试品 溶液制备方法制备，平行三份，进样，提取特征峰，标出保留时间，以12 号峰黄芪甲苷为S峰，计算其它各特征峰相对保留时间，结果表明各特征 峰相对保留时间RSD值均小于1%，结果见表7：

表7不同分析人员结果

实施例2参芪扶正注射液的鉴定

近年来，随着参芪扶正注射液在临床上使用的不断增加，一些不法分 子受经济利益驱使，利用其它品种假冒参芪扶正注射液进行销售，牟取暴 利，对参芪扶正注射液品牌造成很大的负面影响，给正规生产和销售参芪 扶正注射液的企业带来很大的经济损失。这些假冒的参芪扶正注射液从外 观上看，和正品几乎一模一样，难以辨别真伪。

本实施例采用实施例1的方法对参芪扶正注射液正品（由丽珠集团利 民制药厂提供）、疑似样品和丹参滴注液进行了检测，建立了相应的指纹 图谱，结果如图4所示，可以看出，疑似样品与正品参芪扶正注射液图谱 完全不同，利用质谱提供的精确分子量，对伪品中含有的成分进行推断， 基本锁定伪品成分来源于丹参。

由此可见，应用参芪扶正注射液超高压液相色谱质谱联用仪 （UHPLC-MS）建立的指纹图谱可以快速、准确地鉴别参芪扶正注射液的 真伪，还可以对伪品进行定性分析，基本锁定伪品来源，如有不法分子用 丹参注射液冒充参芪扶正注射液，用上述方法检测，将其与正品参芪扶正 注射液图谱相比较，再利用质谱提供的精确分子量，对伪品中含有的成分 进行推断，基本可以锁定伪品成分来源。

因此，应用参芪扶正注射液UHPLC-MS指纹图谱可以有效地避免产 品伪造，保证该品种的正常生产、流通秩序，维护厂家的合法权益。