一种鉴定烟草PVY抗性的分子标记

摘要

本发明属于分子生物学领域，是一种鉴定烟草PVY抗性的分子标记，该分子标记含有SeqIDNo.1所示序列。本发明还涉及扩增该分子标记的引物、该分子标记和引物在烟草抗病资源筛选和抗病育种辅助选择中的用途。本发明的分子标记将基因组DNA序列与烟草PVY抗性基因联系起来，有利于烟草分子标记育种辅助选择体系的建立；所述分子标记与烟草PVY抗性基因的紧密连锁，连锁距离为0.99cM。本发明的分子标记及分子标记扩增引物可以简便、快速、高通量地应用于烟草育种实践。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种分子标记，特别是涉及一种鉴定烟草PVY 抗性的分子标记。本发明还涉及扩增该分子标记的引物、该分子标记和引物在烟草 PVY抗病基因定位或烟草遗传育种中的用途。

背景技术

马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）能侵染34个属170多种植物，对茄科作物 （如：烟草、马铃薯、辣椒、番茄等）危害较重。PVY侵染烟草的病害又称为烟草脉 斑病，是一种世界性的流行病害，由于缺乏抗病主栽品种和综合防治措施难以落实， 在我国烟区危害严重。PVY的侵染可使烟草产量减少7%-18%，产值减少11%-80%。1989 年，烟草脉斑病导致加拿大烟草业直接经济损失达100万美元。1993年脉斑病在我国 山东烟区开始流行，到1998年成为第一大烟草病害。PVY在河南、陕西、黑龙江、辽 宁、安徽、贵州和云南的局部烟区的危害严重，给烟叶生产带来较大损失。

选育抗PVY的烟草品种是防治该病最经济有效的方法。美国G.Koellent对栽培 种Virgin A的变种Virgin A Mutant(VAM)的研究后发现VAM的PVY的抗性主要 是由隐性单基因（va）控制的，对PVY的多个株系、特别是坏死株系具有抗性。 Noguchis S.等对VAM遗传位点的研究后发现VAM对PVY的抗性是由于大段染色体 缺失造成的。这个发现与VAM来源于X-射线突变体相吻合。是由于对PVY感病的基 因缺失造成的。烟草育种利用的PVY抗性重要来源之一为VAM。

为选育抗病品种，国内外鉴定出多个抗PVY的种质资源，如VAM、V.SCR等， 并育成抗病白肋烟品种TN86、TN90和烤烟品种NC55、NC102等。大部分抗源的 抗性表现为隐性基因（va）控制，是由于对PVY感病的基因缺失造成的。并开发出 与Va位点相关的分子标记（RAPD、SCAR）（Noguchi S.,Mol Gen Genet,1999,262: 822-829;Julio et al.,Theor Appl Genet.2006,112(2):335-346.）。烤烟种质RY5对PVY 坏死株系（PVY^N）的抗性符合孟德尔一对隐性基因控制的质量性状的遗传模型，已 报道与抗病基因对应的显性等位基因位点（Va）紧密连锁的RAPD标记O12V3₆₉₅与 SCAR标记PVY ME1（王贵等，分子植物育种,2012,10(1):97-103）。文献报道的RAPD 标记和SCAR标记，与PVY抗性的连锁距离分别为2.10cM和2.52cM。与PVY抗 性的连锁距离较远，将导致利用标记数据判断抗性表型误差较大。RAPD标记存在 扩增产物的特异性不高，非目标条带干扰结果判断、PCR扩增需要循环数多达45个 循环等不足。

发明内容

为克服现有分子标记的不足，本发明提出一种鉴定烟草PVY抗性的分子标记， 采用与PVY隐性抗病基因本身序列及其侧翼序列，开发的分子标记与PVY的抗性连 锁距离更近；PCR扩增条件更简便。因此，利用本发明的分子标记判断抗性表型更 的准确性更高。利用本发明的烟草PVY隐性抗病基因的分子标记进行辅助选择育种， 对加快育种进程和提高我国烟草育种水平起到促进作用。

本发明的另一目的是提供一种可用于PCR扩增与烟草PVY隐性抗病基因紧密连 锁的分子标记的引物对，以及由该引物对扩增获得的分子标记。

本发明的再一目的是提供上述分子标记在烟草PVY隐性抗病基因检测的用途以 及在烟草育种辅助选择中的用途。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种鉴定烟草PVY抗性的分子标记，所述分子标记含有SeqID No.1所示序列； 优选的所述分子标记具有Seq ID No.1所示序列。

本发明还公开了一种扩增与鉴定烟草PVY抗性的分子标记的引物对，所述引物对 的CF2含有Seq ID No.2所示序列，GR11含有Seq ID No.3所示序列；优选的所述CF2 具有Seq ID No.2所示序列，GR11具有Seq ID No.3所示序列；

Seq ID No.2：5’-TTTGGTTTGATAATCCTATGGCT-3’；

Seq ID No.3：5’-GAAGGCAAGATATTCAGGAGCT-3’。

本发明还公开了一种与烟草PVY隐性抗病基因紧密连锁的分子标记，所述分子 标记是由上述的引物对以感PVY烟草基因组DNA为模板经PCR扩增得到的。

优选的由上述引物对扩增得到的分子标记含有Seq ID No.1所示序列。

在本发明的一个实施方案中，所述分子标记(含有Seq ID No.1所示核苷酸序 列的DNA片段)为烟草基因组中含有Seq ID No.1所示核苷酸序列的DNA片段，即 包含的SeqID No.1的5’端和/或3’端以外的核苷酸序列，优选的，为烟草基因组 中Seq ID No.1的5’端和/或3’端的上下游序列。本领域技术人员可以理解，只要 扩增或者检测感PVY的烟草基因组DNA中的该分子标记，必然能够检测或扩增到含有 SeqID No.1所示的序列。Seq ID No.1的5’端和/或3’端的上下游序列的长度为 适当长度，并不特别限定，例如，满足分子标记的长度小于10,000bp、小于5,000bp、 小于2,000bp、小于1,200bp、小于1,200bp、小于1,000bp、或者小于800bp。

本发明还公开了本发明的分子标记的制备方法，包括下述步骤：使用感PVY的 烟草的基因组DNA作为模板，以上述引物对进行PCR扩增，得到的446bp扩增产物 即含有所述分子标记；优选地，还包括将PCR扩增产物进行纯化和测序的步骤。

对本领域技术人员而言，可以理解，也可以DNA化学合成的方法得到本发明的 分子标记。

本发明还公开了所述分子标记的检测方法，包括步骤：根据含有上述分子标记 的核苷酸序列设计引物，以被检测烟草基因组DNA为模板进行扩增，并判断扩增产 物中是否存在该分子标记。优选的，所述引物为上述分别含有Seq ID No.2和Seq ID  No.3的引物对。

例如，可以以被检测烟草的基因组DNA为模板，以上述引物(Seq ID No.2和 SeqID No.3)进行PCR扩增，得到扩增产物。可以将得到的扩增产物进行测序或者 凝胶电泳。

本发明还公开了所述的分子标记在烟草种质PVY抗性鉴定中的用途。所述方法包 括检测本发明的分子标记或使用本发明中扩增分子标记的引物对的步骤。

本发明还公开了所述的分子标记在烟草育种辅助选择中的用途。

本发明的分子标记可用于分子标记育种辅助选择中，本领域技术人员可以理解， 比如通过检测是否存在本发明的分子标记来筛选烟草是否抗PVY(例如，可以参考， 高蓝，DNA分子标记在番茄遗传育种研究中的应用，遗传，2003，25（3）：361-366)。 所述检测可以是PCR检测的方法，具体地，可以使用上述的本发明的扩增分子标记 的引物对。所述检测还可以通过测序方法进行。该烟草育种辅助选择方法具有简便、 快速、高通量的优点。

由于采用以上技术方案，使本发明具备的有益效果在于：

本发明提供了与烟草PVY隐性抗病基因紧密连锁的分子标记，该分子标记将基 因组DNA序列与烟草PVY隐性抗病基因联系起来，有利于烟草分子标记育种辅助选择 体系的建立；所述分子标记与烟草PVY隐性抗病基因的遗传紧密连锁距离为0.99cM。 与文献已报道的相关分子标记相比，本发明所述分子标记是与特异抗病基因连锁的 分子标记，具有连锁距离更近，检测操作简便，结果稳定可靠等优点。本发明的分 子标记及分子标记扩增引物可以简便、快速、高通量地应用于烟草育种实践和资源 及品种鉴定。

附图说明

图1为引物CF2GR11在抗感品种间的多态性：分子标记引物(Seq ID No.2和Seq ID  No.3)对6个PVY抗性明确单株的扩增结果。其中：泳道M为Marker，其为100bp DNA  Ladder；其分子量包括：1200bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、200bp、 400bp、300bp、200bp以及100bp。泳道阴性对照为水。

具体实施方式

本发明公开了一种引物对以及与烟草PVY隐性抗病基因紧密连锁的分子标记 PVY01。利用本发明的引物对，以烟草基因组DNA为模板进行PCR，可以得到与烟草PVY 隐性抗病基因紧密连锁的分子标记，该分子标记在本发明中命名为分子标记PVY01。 需要指出的是，本领域技术人员可以理解，除了通过上述PCR扩增获得本发明的分 子标记外，还可以通过化学合成获得本发明的分子标记。

本发明的引物对分别含有序列表Seq ID No.2和Seq ID No.3所示序列，

Seq ID No.2：5’-TTTGGTTTGATAATCCTATGGCT-3’；

Seq ID No.3：5’-GAAGGCAAGATATTCAGGAGCT-3’。

本领域技术人员熟知，在上述Seq ID No.2和Seq ID No.3所示序列中，可在 其5’端或3’端分别增加1～10个碱基，所增加的碱基类型可根据烟草基因组DNA 上与Seq IDNo.2和Seq ID No.3相匹配区域的碱基类型并依据碱基配对原则来确定， 由此得到的引物对与Seq ID No.2和Seq ID No.3的扩增产物基本相同(上游和下 游引物之间的DNA序列相同)。因此，上述在Seq ID No.2和SeqID No.3的5’端或 3’端分别增加1～10个碱基并能扩增得到基本相同DNA片段的引物对，均包括在本 发明的引物对中。在本发明具体的实施方式中，本发明的引物对优选为Seq ID No.2 和Seq ID No.3所示序列。

优选的PVY01分子标记开发方法如下：

烟草品种NC55、NC102、K326PVY和TN90为抗PVY材料，Coker176、云烟87、中 烟100、红花大金元和K326为感PVY材料，公众可从云南省烟草农业科学研究院获得。 本发明将抗PVY的父本NC55和感PVY的母本Coker176的纯合子杂交，获得F1代，再以 F1代自交产生F2代群体，共101个单株。

pCR-BluntII-TOPO载体、农杆菌GV3101购自Invitrogen公司。质粒DNA提取 试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DNA片段纯化试剂盒购自QIAGEN公司。大肠 杆菌(Escherichia coli)JM109；；反转录试剂盒、5’端RACE试剂盒、DNA Marker、 Taq DNA聚合酶、T4DNA聚合酶及T4DNA连接酶均购自大连宝生物公司。RNA提取 试剂盒Trizol购自Invitrogen公司。其他化学试剂均为市售产品。

据文献报道番茄和辣椒中eIF4E家族基因与PVY抗性相关，烟草与辣椒/番茄同 属茄科作物，因此我们推测烟草中的eIF4E基因也与PVY抗性相关。根据已发表文 献、Genbank数据库的综合分析，初步获得烟草eIF4E家族7个基因成员的编码序列， 并进行系统进化分析。根据保守序列设计简并引物，正向引物DegenerateP_F： 5’-TGGACWTTYTGGTWYGATAA-3’，反向引物DegenerateP_R： 5’-TCCTTCCAYTKYYTACCAATGC-3’。以NC55（染色体未知片段缺失赋予PVY抗性） 和中烟100（感PVY材料）的cDNA作为模板扩增eIF4E家族基因。结果表明，eIF4E-1 基因的转录本仅在中烟100样本中出现，这表明eIF4E-1基因可能与PVY抗性有关。 由于eIF4E基因家族的成员较多，直接利用eIF4E-1基因的编码区序列，不能设计 特异扩增eIF4E-1的片段。本发明根据eIF4E-1基因的部分序列，通过5’端RACE 获得eIF4E-1基因起始密码子上游的序列，包含本发明的分子标记(Seq ID No.1)。 根据eIF4E-1的基因组序列和eIF4E家族成员的序列，设计特异引物CF2GR11，检测 已知抗性的烟草材料的基因组DNA，验证抗性是否与本发明的分子标记(Seq ID No.1) 有无吻合。结果表明：感病品种K326、云烟87和红花大金元的eIF4E-1目标片段检 测为阳性，而抗病品种NC102、NC55、K326PVY的eIF4E-1目标片段检测为阴性。6 个品种对PVY的抗性与CF2GR11的PCR检测结果吻合。因此，将CF2GR11特异扩增 的eIF4E-1基因片段作为获选分子标记，用于在抗性分离群体中验证。

利用CF2GR11的引物对，对F2群体的101个单株进行PCR检测和PVY抗性鉴定，得 到基因型分型数据和PVY抗性数据，统计分析后，用Map Maker3.0软件进行遗传图 谱绘制，得到本发明所述的与PVY隐性抗病基因紧密连锁的分子标记与抗性的遗传距 离。利用引物对进行抗PVY烟草育种辅助选择和抗PVY烟草种质筛选。

下面通过具体实验例并结合附图对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅仅 对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。

实施例1：分子标记的制备

一、烟草RNA提取：

（1）取100mg幼嫩叶片放入用DEPC水处理过的研钵；

（2）加入1ml Trizol研磨成均浆，转移至DEPC水处理过的EP离心管中，室温静 置5min；

（3）加入0.2ml氯仿（三氯甲烷），振荡15sec，静置3min；

（4）12000rcf，4℃，离心15min；

（5）转移上清液（最多400ul）至新的EP管；

（6）向上清液中加入0.5ml异丙醇，静置10min；

（7）12000rcf，4℃，离心10min；

（8）弃异丙醇，用移液枪将残余的异丙醇吸出丢弃，加入1ml75%的乙醇清洗底部 残留物；

（9）7500rcf，4℃，离心2min；

（10）弃乙醇，用移液枪将残余的乙醇吸出丢弃，室温干燥2-3min；

（11）加入30ul DEPC H₂O溶解沉淀块，若不易溶解则放入55℃水浴锅中水浴10min；

(12）-20℃短期保存，-80℃长期保存待用。

二、cDNA第一链的合成

使用Reverse Transcriptase M-MLV（Takara）进行模板cDNA的合成，取植物 总RNA约0.1μg-5μg，oligo(dT)1550ng,10mM dNTP mix1μl,用DEPC处理水补足 至10μl，混匀后，短暂离心将之收集于管底，置于65℃加热5min，冰浴10min， 加入反应混合物9μl（5×reaction buffer4μl，25mM MgCl24μl，0.1M DTT2 μl,RNA酶抑制剂1μl），将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25℃保温 2min，加入1μl M-MLV Reverse Transcriptase，将上述混合物混匀，短暂离心将 之收集于管底，25℃保温20min，然后42℃保温70min，cDNA的合成完成，-20℃保 存备用。

三、DNA提取

用常规CTAB法分别提取烟草基因组DNA，方法为：（1）称取烟草叶片100mg 左右置于1.5mL离心管中，加液氮用特制研棒研磨至粉末状；（2）加入900μl预 热到65℃的2×CTAB缓冲液（Tris-HCl pH7.5100mM,EDTA20mM,NaCl1.4M,CTAB 2%），65℃度水浴20分钟后取出冷却；（3）加入200μl氯仿－异戊醇混合液（24： 1）摇匀，4℃离心10min（7200rpm）后转移上清至1.5mL EP管；（4）再次加入 200μl氯仿－异戊醇混合液（24：1）摇匀，4℃离心10min（7200rpm）；（5）取 出上清置于新的EP管中，加入1/10体积3M pH5.2醋酸钠和等体积异丙醇，摇匀后 4℃离心20min（12000rpm）；（6）弃上清，用75％乙醇清洗两次后，干燥，用含 RNase的TE缓冲液融解，放置－20℃保存备用。

四、PCR扩增

PCR反应体系如下：总体积为20μL，其中50ng/μL DNA样品2.5μL、10 ×PCR buffer2.0μL，dNTPs1.2μL，引物对(Seq ID No.2和Seq ID No.3) 各1.5μL，Ex-Taq DNA酶0.3μL，ddH2O12.6μL。所用试剂购自宝生物公司。

PCR反应程序如下：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒， 72℃延伸60秒，运行35个循环；最后72℃延伸5分钟。PCR扩增产物可以在4 ℃保存。

五、分子标记获得

在Genbank中搜索获得eIF4E基因家族成员的保守序列，根据烟草eIF4E基因 家族成员的保守序列设计简并引物，正向引物DegenerateP_F： 5’-TGGACWTTYTGGTWYGATAA-3’，反向引物DegenerateP_R： 5’-TCCTTCCAYTKYYTACCAATGC-3’。以NC55（染色体未知片段缺失赋予PVY抗性） 和中烟100（感PVY材料）的cDNA作为模板扩增eIF4E家族基因。将扩增获得约420bp 的片段割胶回收，克隆到pMD18-T载体中，获得重组载体。将该重组载体转化到大 肠杆菌JM109中。来源于NC55和中烟100的cDNA样品，分别挑选阳性单克隆50个， 培养获得重组细胞。从重组细胞中提取质粒，采用M13通用引物(序列信息参考 TaKaRa商品目录)对克隆片段进行测序，将所得序列在Genbank中进行BLAST比对。 结果显示，eIF4E-1基因的转录本仅在感PVY的中烟100样本中出现，eIF4E-1基因 的转录本抗PVY的NC55样本中缺失（表1），这表明eIF4E-1基因可能与PVY抗性有 关。

表1抗感PVY烟草材料的eIF4E家族基因的转录本检测

根据eIF4E-1基因的部分序列，通过5’端RACE获得eIF4E-1基因起始密码子 上游的序列，包含本发明的分子标记(Seq ID No.1)。

根据eIF4E-1的基因组序列和eIF4E家族成员的序列，设计特异引物CF2GR11， 检测已知抗性的烟草材料的基因组DNA，验证抗性是否与本发明的分子标记(Seq ID No.1)有无吻合。结果表明：感病品种K326、云烟87和红花大金元的eIF4E-1目标 片段检测为阳性，而抗病品种NC102、NC55、K326PVY的eIF4E-1目标片段检测为阴 性（图1）。6个品种对PVY的抗性与CF2GR11的PCR检测结果吻合。因此，将CF2GR11 特异扩增的eIF4E-1基因片段作为获选分子标记，用于在抗性分离群体中验证。

上述克隆、转化、培养、质粒提取、5’端RACE等步骤参考《分子克隆实验指南第 三版》，黄培堂等译，科学出版社2002年9月出版。对本领域技术人员而言，可以 理解，也可以通过DNA化学合成的方法得到该分子标记。

实施例2：扩增分子标记的引物对的开发

根据分子标记的序列(Seq ID No.1)，在Genbank （www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）中，采用BLAST方法，获得序列一致率高于80% 的烟草基因组序列。采用引物设计软件PRIMER5.0，设计特异扩增含有全部或部分 分子标记的序列(Seq ID No.1)的候选引物对。

利用抗PVY烟草品种NC55、和感PVY烟草品种Coker176、红花大金元的基因组DNA， 筛选候选引物对。

PCR反应体系如下：总体积为20μL，其中50ng/μL DNA样品2.5μL、10×PCR buffer2.0μL，dNTPs1.2μL，引物对(Seq ID No.2和Seq ID No.3)各1.5μL， Ex-Taq DNA酶0.3μL，ddH2O12.6μL。所用试剂购自宝生物公司。

PCR反应程序：94℃预变性5min；然后进入35个循环：94℃变性30s，55℃（退 火温度根据具体引物对的Tm值设定）退火30s，72℃延伸60s；循环结束后72℃延伸 5min；4℃保存。

PCR产物电泳检测：1.2％的琼脂糖凝胶120v电泳25min，EB染色10min，照胶 并记录。

按照如下的筛选标准进行候选引物对的筛选：NC55无扩增产物，并且Coker176 和红花大金元的扩增产物均只有一条明晰的带型。

筛选结果：根据上述筛选标准，从设计的3对引物中优选选出1对引物(Seq ID No.2 和Seq ID No.3)。

实施例3：分子标记与PVY抗性的遗传距离确定

一、烟草F2代分离群体的构建

父本：烟草品种NC55，抗PVY。母本：烟草品种Coker176，感PVY。F2群体构 建：父本和母本杂交得到F1代，F1自交得到F2种子。

二、烟草F2代个体的表型鉴定

播种父本、母本和F2种子。盆栽共得到父本单株30株、母本单株30株、F2代单 株101株。烟苗4-5片叶时，每株分别采集半片叶，-20℃保存，用于提取DNA。采样 完毕后，采用高压喷枪接种PVY病毒坏死株系ZT-5（公众可从云南省烟草农业科学研 究院获得）的病叶汁液40倍。接种后21天调查PVY症状。调查时无花叶、脉带和叶脉 坏死等PVY症状，记为抗病（R）。调查时表现花叶、脉带和叶脉坏死等PVY症状，记 为感病（S）。得到父本、母本和F2的101个单株的表型数据。

三、烟草F2代个体的基因型分型

父母本以及F2代个体基因组DNA的提取用常规CTAB法分别提取。

四、PCR扩增与检测

利用分子标记引物(Seq ID No.2和Seq ID No.3)，的F2代的101个单株DNA进 行的PCR扩增，PCR反应体系同实施例2。PCR反应程序：94℃预变性5min；然后进 入35个循环：94℃变性30s，51℃，退火30s，72℃延伸60s；循环结束后72℃延伸 5min；4℃保存。

对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到分子标记引物对101个单株扩增的结果。 扩增结果是：40株感PVY植株的PCR扩增产物均有446bp大小的条带，2株感PVY植株 PCR扩增产物均没有446bp的条带,59株抗PVY植株PCR扩增产物均没有446bp的条 带。并且经测序证明该446bp的片段的序列包含在Seq ID No.1中。可见，本发明 的分子标记(Seq ID No.1)为与烟草PVY隐性抗病基因紧密连锁的分子标记。

五、遗传距离计算

将全部电泳结果进行数据统计分析，具体方法如下：将F2群体单株扩增条带为 父本型的记为a，扩增条带为母本型的记为b，带型模糊或者缺失记为-，相当于数据 缺失，最终得到F2群体101个个体的CF2GR11引物扩增的基因型数据。所得即为该 F2群体的基因型数据。用MapMaker3.0软件(Constructing genetic maps with  MAPMAKER/EXP3.0，SLincoln，M Daly，E Lander-Cambridge，MA：Whitehead  Institute，1992)对101个单株的表型数据和基因型数据进行遗传连锁图谱绘制， 得到遗传连锁图。从该得到的遗传连锁图上确定供试引物与烟草PVY隐性抗病基因的 遗传距离。本发明分子标记CF2GR11与烟草PVY隐性抗病基因的遗传距离为0.99cM， 小于文献报道的分子标记RAPD标记O12V3₆₉₅和SCAR标记PVY ME1的遗传距离。文 献报道的RAPD标记O12V3₆₉₅和SCAR标记PVY ME1与PVY抗性的连锁距离分别为 2.10cM和2.52cM（王贵等，分子植物育种,2012,10(1):97-103）。

实施例4：分子标记在烟草育种辅助选择中的用途

对抗感PVY的亲本配制的杂交自交后代（如F2）或者回交自交后代(如BC1F2， BC2F2)种子，常规方法育苗，烟苗3-4片叶时，采用CTAB法提取基因组DNA，以已知 抗PVY的烟草品种NC55和已知感PVY的烟草品种Coker176为对照。采用实施例3中的方 法，采用分子标记引物对(Seq ID No.2和Seq ID No.3)，进行的PCR扩增，PCR反 应体系和PCR反应程序同实施例3。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，照胶并记录。

抗病对照无446bp扩增产物，感病对照有446bp扩增产物。表明PCR扩增正常。然 后按照如下的标准判断烟草种质的PVY抗性：无446bp扩增产物，初步判断该F2单株 抗PVY，有446bp扩增产物，初步判断该F2单株感PVY。结果表明：抗PVY的烟草品种 NC55无446bp扩增产物；感PVY的烟草品种Coker176有446bp扩增产物。筛选出的抗PVY 的F2单株供进一步育种利用。表明该分子标记可用于鉴定烟草种质资源的抗性。与 常规苗期接种PVY抗性鉴定方法相比，利用分子标记鉴定抗性具有以下优点：减少人 为接种病害对其他实验材料的污染；减少人为接种病害对温室条件的需求；同一个 F2单株的DNA，可用于其他分子标记的检测，可用于其他性状的分子标记辅助选择。 实施例5：分子标记在烟草种质PVY抗性鉴定中的用途

按照常规方法育苗，烟苗4-5片叶时，采用CTAB法提取待鉴定烟草种质TN90和云 烟87的基因组DNA，以已知抗PVY的烟草品种NC55和已知感PVY的烟草品种Coker176为 对照。采用分子标记引物对(Seq ID No.2和Seq ID No.3)，进行的PCR扩增，PCR 反应体系和PCR反应程序同实施例3。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，照胶并记录。

抗病对照无446bp扩增产物，感病对照有446bp扩增产物。表明PCR扩增正常。然 后按照如下的标准判断烟草种质的PVY抗性：无446bp扩增产物，初步判断该种质抗 PVY，有446bp扩增产物，初步判断该种质感PVY。结果表明：抗PVY的烟草品种TN90 无446bp扩增产物；感PVY的烟草品种云烟87有446bp扩增产物。表明该分子标记可用 于鉴定烟草种质资源的抗性。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本 发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于 本发明的保护范围。

本发明中的各分子标记的核苷酸序列如下：

Seq ID No.1:

TTGGTTTGATAATCCTATGGCTAAATCTAGACAAGCTGCTTGGGGCAGTTCCCTTCGCGAACTTTACA CTTTTTCCACTGTCGAAGATTTTTGGGGGTAAGTTATTTCATATTCCCTCGGTTCCAATTTAGGTTACAGTC TTTCCTTTTTAGTCAACTTTTAGTCTCCTTAAATGATATATTTCTATATTTAGTAATAATTTAATATTTATA GTGACACAAATGTATCACTCATTTTAGATGAATTTTTTTTTTCTTAAACTCCGTACCAAATCAAACACTACT AATGTAAATTGGGACGAAGCGAGTATTATATTTCGTGTTAAGCTGTTGTGTTCTTTGGTTGTAAATAAATCA TGGGGTTTTATTTTACTGTTCAAGAATTTTGTGGGTGCTGTAGGATTTTGTTGAATTATGGTTTTGAATAGC TCCTGAATATCTTGCCTTC；

Seq ID No.2(CF2):

TTTGGTTTGATAATCCTATGGCT；

Seq ID No.3(GR11):

GAAGGCAAGATATTCAGGAGCT。