一种阿魏酸脱羧酶晶体结构及其解析方法

摘要

本发明公开了一种阿魏酸脱羧酶晶体结构及其解析方法，属于酶工程技术领域。本发明提供的阿魏酸脱羧酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，分子量为112KDa，晶体结构由8个不对称单体组成，其中单体A（1）和单体H（8）组成二聚体、单体B（2）与单体F（6）组成二聚体、单体C（3）和单体E（5）组成二聚体、单体D（4）与其不对称伴侣组成二聚体、单体G（7）与其不对称伴侣组成二聚体，晶胞参数为本发明所提供的阿魏酸脱羧酶的结构信息可用于提高苯乙烯产量、提高酶活性、改变底物特异性、提高酶pH和热稳定性、构建阿魏酸脱羧酶突变体库、生产反式肉桂酸相似体、去除反馈抑制阻碍物以及降低扩散和中间产物的积累等方面。

说明书

技术领域

本发明涉及一种阿魏酸脱羧酶晶体结构及其解析方法，属于酶工程技术领域。

背景技术

现今，每年大约有10%的化石燃料被用于生产诸如塑料，橡胶和树脂等材料。由于大约 70年前塑料的发明，使这些“万能的”材料已经被用于现代生活的各个方面。然而，由于化石 燃料的不可再生性以及人们对二氧化碳积累所带来的环境问题关注度的提高，寻找能够替代 诸如石油，天然气和煤炭等化石燃料的可再生能源变得越来越重要。本领域的研究直接关系 着经济竞争力和国家安全。发展制备这些聚合物的新技术是目前世界学术研究和工业应用的 当务之急。

苯乙烯是多聚物生产中产量最大和最重要的石油化学品和多聚物单体之一。现在，每年 苯乙烯的产量在三千万吨以上。苯乙烯单体可以转化成聚苯乙烯（PS），苯乙烯-丁二烯橡胶 （SBR），丙烯腈丁二烯苯乙烯塑料（ABS），苯乙烯-丙烯腈树脂（SAN）。另外，苯乙烯还 被广泛地用于油漆，燃料和合成药剂复合物。据估计，大约有1.3%的石油和天然气被直接或 间接用于生产苯乙烯和苯乙烯衍生物。目前，农产品，尤其是农产品的副产物是最广泛的可 再生生物材料的来源。因此，利用农产品副产物生产苯乙烯以及一个有效的生物合成方法具 有重要的经济价值。

现有技术将过量表达苯丙氨酸氨基裂解酶（PAL，来自拟南芥）和FDC（来自酿酒酵母） 基因导入过量生产L-苯丙氨酸的大肠杆菌宿主菌，从而实现苯乙烯的生产。阿魏酸脱羧酶可 以催化反式肉桂酸生成苯乙烯。

酶的晶体结构通常被用于解释酶的催化机理以及酶活性与催化位点的关系。目前为止， 只有报道了一种来自肠杆菌属（Enterobacter sp.）的FDC晶体结构(Gu et al.,“Structural basis of  enzymatic activity for the ferulic acid decarboxylase(FADase)from Enterobacter sp.Px6-4,”PLoS One,2011,6:e16262).)。然而，Enterobacter sp.Px6-4FDC的氨基酸序列（168个氨基酸残基） 与酵母FDC（503个氨基酸残基）只有19.0%的同源性，并且序列较短。因此，来自肠杆菌 属的FDC的结构与来自于酵母的FDC不具有可比性，并且不能用于鉴定酵母来源FDC的底 物连接残基。

因此，为了研究苯乙烯的生物合成，FDC晶体结构的获取是不可或缺的。

发明内容

本发明提供了一种阿魏酸脱羧酶的晶体结构，采用技术方案如下：

所述阿魏酸脱羧酶晶体结构由8个不对称单体组成，分别为：单体A（1）、单体B（2）、 单体C（3）、单体D（4）、单体E（5）、单体F（6）、单体G（7）和单体H（8）；含有一个 3-羟基肉桂酸配体；

晶体结构参数为：

空间群C121；

晶胞参数

所述阿魏酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述阿魏酸脱羧酶晶体结构由8 个不对称单体组成，分别为：单体A（1）、单体B（2）、单体C（3）、单体D（4）、单体E （5）、单体F（6）、单体G（7）和单体H（8）；含有一个3-羟基肉桂酸配体；

晶体结构参数为：

空间群C121；

晶胞参数

所述阿魏酸脱羧酶分子量为112KDa。

所述阿魏酸脱羧酶晶体结构中单体A（1）和单体H（8）组成二聚体、单体B（2）与单 体F（6）组成二聚体、单体C（3）和单体E（5）组成二聚体、单体D（4）与其非对称伴侣 组成二聚体、单体G（7）与其不对称伴侣组成二聚体。

所述阿魏酸脱羧酶晶体结构中，单体B（2）和单体F（6）组成的二聚体是通过两个α- 螺旋中的氨基酸残基的相互作用来维持，通过盐桥和疏水相互作用调节结构。

所述单体的多肽链折叠成一个三结构域结构，N端部分的结构是由两个结构域构成，C 端是由一个侧面的α-螺旋结构组成；N端结构是由四个绳状结构，三个螺旋和一个310-螺旋 组成，中间结构域主要由β-结构元素构成，包含7个β-折叠，8个反平行β-折叠，C端结构 域与中间结构域相连，其核心包含5个β-折叠及两侧面的两个α-螺旋构成。

所述晶体的空间群C121的参数为：本发明还提供了一种阿魏酸脱羧酶晶体结构的解析方法，是通过冷冻液氮从培养液中结晶出 单一晶体，利用X射线源获取的晶体数据。

所述方法的具体步骤如下：

1）从母液中可以获得晶体，利用液态氮气流快速冷冻，在100K下利用X射线源获得的 晶体数据；

2）晶体结构可借助于基于类似芳香酸脱羧酶结构的相位器和I-TASSER模型利用分子替 代法定向；

3）根据Matthew参数，一个不对称单位中含有八个单体，相位器中的溶液的最高LLG 为497.9，最高TFZ为28.7，Rcryst为55.9%；利用Phenix和COOT软件对结构数据 进行修正，获得Rcryst因子达到36.3%，Rfree因子达到46.4%的模型；

4）初始相关模型单体可用于获得MR的第二数据集合，同时，在不对称单位中发现八个 蛋白质单体，初始模型可以根据步骤3）所述方法进行数据修正，结构模型可以通过 TLS Motion Determination Server分析，再利用eight TLS groups进行数据细化，获得 一个Rcryst因子为17.4%,Rfree因子为23.0%的模型，利用CCP4程序SFCHECK和 PROCHECK对最终模型进行检查。

本发明的有益效果：

本发明能够用于提高苯乙烯产量，提高酶活性，改变底物特异性，提高稳定性（pH和热 稳定性），构建FDC突变体库，生产反式肉桂酸相似体，去除反馈抑制阻碍物以及降低扩散 和中间产物的积累。

附图说明

图1为FDC不对称结构的连续剖面图。

图2为FDC生物活性二聚体结构的示意图。

图3为FDC单体结构的示意图。

图4为FDC四级结构的示意图。

图5为1σ水平上的电子密度地图的示意图。

图6为一个表征FDC单体静电电势四级表面结构的示意图。

图7为带有3-羟基肉桂酸的FDC四级表面结构的示意图和活性位点的封闭视图。

图8为苯乙烯生物合成的代谢途径和HPLC检测。

图9为不同反应条件和反应时间下不同来源的酶促反应能得到的苯乙烯产量。

具体实施方式

本发明主要涉及FDC的晶体结构及其解析方法。一方面，本发明在分子水平的基础上进 一步解析了FDC的晶体结构。晶体结构及其衍生出的信息适用于设计和鉴定新底物，适用于 设计具有高稳定性和底物特性的突变酶，适用于设计具有高催化活性的酶。本发明可用于诸 如，改善苯乙烯产量，提高酶活性，改变底物特异性，提高稳定性（pH和热稳定性），构建 FDC突变体库，生产反式肉桂酸相似体，去除反馈抑制阻碍物以及降低扩散和中间产物的积 累。

另一方面，本发明提供了解析FDC晶体结构的方法。通过该方法成功获得了阿魏酸脱羧 酶晶体结构。

所述的晶体是含有一个配体的FDC的晶体结构。配体可以包括任何与FDC酶相连的分 子。因此，配体可以包括但也不限于FDC酶的底物。

所述的晶体结构信息可以通过X-射线衍射数据，并对数据进行分析处理后获得。晶体结 构可以通过假定芳香酸脱羧酶结构逐步定向（see,e.g.,Jacewicz et al.,“Structural insights into  the UbiD protein family from the crystal structure of PA0254from Pseudomonas  aeruginosa,2013,PloS One.9:e63161”）。

本发明公布的FDC晶体结构信息可用于解释基于构效关系的FDC催化机制。本发明可 以用于设计和/或修改FDC以提高酶的催化活性，提高稳定性以及调节底物特异性。

下面通过实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

实施例1阿魏酸脱羧酶的结构测定

在100K下直接冷冻蒸汽流动的液态N2，可以从带有母液中可以直接获得两个单一晶体， 利用Argonne美国国家实验室的配有CCD探测器（ADSCQUANTUM315r）的X射线源 191Dbeamline可以直接获得在412.87mm和378.90mm下的晶体数据。在,0.3°和1.0° 振幅指示(P1211and C121)和用HKL3000(Minor et al.,2006)测量可获得晶体图片 （600frames和180frames）。表1列出了归纳获得的单位小室晶体的参数和数据细化统计信息。 本例的FDC来自酵母菌Saccharomyces cerevisiae（strain ATCC204508/S288c）。

初始FDC（P121，）结构可借助于基于假定芳香酸脱羧酶（PDB：4IWS）结构（Jacewicz  et al.,“Structural insights into the UbiD protein family from the crystal structure of PA0254from  Pseudomonas aeruginosa,”2013,PLoS One.9:e63161）的相位器（McCoy et al.,2007,“Phaser  crystallographic software,”J.Appl.Cryst.,2007,40:658-674）和I-TASSER模型（Zhang, “I-TASSER server for protein3D structure prediction,”BMC Bioinformatics,2008,9:40;Roy et al., “I-TASSER:a unified platform for automated protein structure and function prediction,”Nature  Protocols,2010,5:725-738）利用分子替代法（MR）定向。

根据Matthew参数，四个蛋白质单体预测处在不对称单位中。相位器中的溶液的最高LLG 为497.9，最高TFZ为28.7，Rcryst为55.9%。利用Phenix软件（Adams et al.,“PHENIX:a  comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution,”Acta Crystallog.Biol. D.,2010,66:213-221）进行数据细化，根据Rfree算法（Brünger et al.,“Crystallography&NMR  system:A new software suite for macromolecular structure determination,”Acta Crystallog.Biol. Crystallog.D,1998,54:905-921）排除10%数据。模拟退火和对原始方案B因子的细化会产生 一个在范围内，Rcryst达到36.3%，Rfree达到46.4%的模型。在这一阶段，可采用 COOT（Emsley et al.,“Coot:model-building tools for molecular graphics,”Acta Crystallog.Biol. Crystallog.D,2004,60:2126-2132）进行人工拟合。

初始FDC模型单体可用于获得MR的第二数据集合（C121and），同时，在不对 称单位中发现八个蛋白质单体。初始模型（top LLG of35680,top TFZ of21.5and an Rcryst of  40.5%）可以根据上述方法进行细化。结构模型可以通过TLS Motion Determination Server （Painter et al.,“Optimal description of a protein structure in terms of multiple groups undergoing  TLS motion,”Acta Crystallog.Biol.Crystallog.D,2006,62:439-450）进行分析，利用eight TLS  groups进行细化，获得一个Rcryst17.4%,Rfree23.0%的模型。最终模型可以利用CCP4程序 SFCHECK和PROCHECK（Collaborative Computational Project,1994;Vaguine et al., “SFCHECK:a unified set of procedures for evaluating the quality of macromolecular  structure-factor data and their agreement with the atomic model,”Acta Crystallog.Biol.Crystallog. D,1999,55:191-205;Laskowsky et al.,“Main-chain bond lengths and bond angles in protein  structures,”J.Mol.Biol.1993,231:1049-1067）进行分析。表1中列出了数据收集和结构修正 参数。

表1.酿酒酵母FDC晶体结构的数据统计

实施例2FDC蛋白质的晶体空间结构特征

如图1所示，FDC晶体的不对称单位是由八个单体组成。其中，六个单体按序组成三个 二聚体（即单体A与单体H，单体B与单体F，单体C与单体E），另外两个单体与分别与 其对应的不对称分子伴侣形成二聚体。实验图谱证明了上述蛋白质分子结构的合理性。

在FDC晶体中的不对称单位中可以鉴别出一个二聚体（图2）。这个二聚体的组合主要 通过隶属于两个α-螺旋亚单元中氨基酸残基的相互作用来维持。二聚体的调节通过盐桥和疏 水相互作用来完成。利用Sephacryl S-200对凝胶层析的结果进行分析，并结合SDS-PAGE的 结果可知FDC为一个由56KDa亚基组成的分子量为112.0KDa的二聚体蛋白。结合晶体图像 分析可知，FDC在溶液和晶体状态下都是以二聚体组装体的形式存在的。

本发明还鉴定了FDC的单体结构。如图3所示，单体多肽链折叠成一个三结构域结构。 N端部分的结构是由两个结构域构成，C端是由一个α-螺旋结构组成。具体为，N端结构是 由四个绳装结构，三个螺旋和一个310-螺旋组成。中间结构域（N端的第二结构域）主要是 由β-结构元素构成。该结构域的核心由7个β-折叠，8个反平行β-折叠构成。这一结构域在 反向末端有4个α-螺旋结构。C端结构域与中间结构域相连，其核心由两个侧面被α-螺旋包 裹的5个β-折叠结构组成。

图4是FDC结构中的一个典型的2Fo-Fc示意图。图5是一个1σ水平下，底物3-羟基肉 桂酸电子密度示意图。只有C端单体对于改善底物表现为合理水平。图6为FDC晶体的四级 表面结构。图7为FDC活性位点的四级表面结构。底物连接位点的封闭上视图显示蛋白质带 负电荷的氨基酸残基的羧基与羟基形成了氢键（图7B）。在蛋白质疏水集团中苯环和丙烷尾 相连。

FDC晶体结构涵盖了酶活性位点及其表面特性的细节信息，这对于提高苯乙烯的产量， 提高酶活性，改变底物特异性，提高稳定性（pH和热稳定），产生FDC突变体库，生产反式 肉桂酸同源体，去除反馈抑制阻碍物和降低扩散和中间产物的积累都有重要作用。

实施例3阿魏酸脱羧酶的应用

在生产丁香酸的体系中，引入丁香酸脱羧酶（Cinnamic Acid Decarboxylase,CDC；亦称 阿魏酸脱羧酶，Ferulic Acid Decarboxylase,FDC）,可以获得苯乙烯。

在产苯丙氨酸的大肠杆菌中导入苯丙氨酸解氨酶(PAL)和丁香酸脱羧酶（CDC）基因，成 功实现苯乙烯的生物合成，上述方案证明以可再生的生物质为原料可以生产苯乙烯。

图8显示的人工设计的合成途径主要由三部分组成。第一，通过过量表达三个关键酶， 实现了从葡萄糖到苯丙氨酸的高效转化，在细胞中积累了大量的苯丙氨酸(phenylalanine)。第 二，通过过量表达植物的苯丙氨酸解氨酶，将多余的苯丙氨酸转化成了丁香酸(cinnamate)。 最后，通过过量表达不同种类的丁香酸脱羧酶，将丁香酸转化成了苯乙烯(styrene)，产量为 120mg/L。

进一步地，对第三步反应进行优化。丁香酸脱羧酶是非常不稳定的蛋白，在得到纯化酶 后，对其酶学性质进行了研究，找到了关键的催化反应辅助因子。同时从不同物种中克隆了 四个同源酶，依次进行了酶学分析。酿酒酵母中的PAD1和FDC，黑曲霉中的AnPADA1和 AnOHBA1都对底物有一定的活性，但催化效率相差很大（图9，其中“O”是从黑曲霉中得到 的CDC，“F”是从酿酒酵母中得到的CDC；不同浓度的底物丁香酸也产生了不同浓度的产量）。 酵母的PAD1几乎没有产物积累。在后续实验中选择酿酒酵母中的FDC。最佳的产率在摇瓶 中达到100-120mg/L，在发酵罐中能达到800-1000mg/L。比最初产量增加了8倍左右。

实施例4.FDC的酶活性测定

（1）FDC的酶活性测定方法

本发明采用的酶学测定方法非常精确、重现性极好，能够在低浓度底物的条件下测定FDC 的酶活性。

将5mM DTT,1.4mM tCA和0.5mg酶液溶解在1.0ml，25mM磷酸钾缓冲液（pH=6.5）中， 于30℃培养5min，加入等体积异丙醇，最后加入24μl冰醋酸（17.4N）终止反应。苯乙烯的 含量通过HPLC的方法测定，使用二极管矩阵探测器（UV/Vis）和Acclaim120C18柱（2.1x150 mM Dionex USA）的Dionex Ultimate3000UHPLC。10μl样品进样量，使用梯度洗脱，流动相 A为0.15%乙酸，流动相B为乙腈，并在流速为1ml/min的条件下，逐渐增加流动相B的浓 度，0-4min，5%；4-5min，5-40%；5-7min，40-45%；7-8min，45-85%；8-12min,85-95%； 12-14min，95-5%。酶特异活性用U(nmol苯乙烯).mg-1.min-1来表示。

（2）FDC的pH稳定性

不同pH值缓冲溶液也会影响FDC的稳定性和反应速率。将586μL粗酶液加至112μL， 500mM，pH值分别为5,6,7,8,9,10和11的缓冲溶液中，于30℃培养30min。将42mg不 同pH处理的蛋白加至含有5mM DTT,1.4m tCA的2mL，100mM，磷酸钾缓冲液（pH6.5） 中，在温度为30℃时间8min时，分别测定不同pH值下的酶活性，以相同条件下不含底物的 反应体系作为实验的阴性对照。结果表明FDC在pH=6-10的范围是稳定的。FDC在宽泛的 pH范围内活性稳定，能够被用来工业化生产苯乙烯。

（3）温度对FDC活性的影响

温度能够影响FDC的稳定性和反应速率。使用阿伦尼乌斯方程表示温度对反应速率的影 响。通常，温度每增加10℃反应速率会增加两倍或者三倍左右。

为获得FDC的最适温度，分别在温度为25℃，30℃，32℃，35℃，40℃，50℃和60℃ 下，培养30min。取13mg不同处理的酶液加入含有5mM DTT，1.4mM的1mL，25mM磷酸 钾缓冲液（pH6.5）中，在温度为30℃时间8min时，分别测定不同处理下的酶活性。以相同 条件下不含底物的反应体系作为实验的阴性对照。结果表明FDC的最适温度为50℃。

发明人发现FDC的最大酶活性温度高于其他酵母提取酶，这一发现对于工业化生产苯乙 烯非常有用，因发酵相关的大量费用都用于冷却发酵系统温度。FDC在更高温度仍具有活性， 这样可以在一个温度范围来控制条件，从而增加收益并减少冷却费用。

（4）FDC的耐热性

为研究FDC的耐热性，测定FDC在50℃的稳定性，将粗酶提取物置于50℃下，分别培 养10min，30min，60min和120min。在不同时间的处理之后，将42mg不同处理的蛋白加至 含有5mM DTT,1.4m tCA的2mL，100mM，磷酸钾缓冲液（pH6.5）中，在温度为30℃时间 8min时，分别测定不同处理下的酶活性。以相同条件下不含底物的反应体系作为实验的阴性 对照。FDC在50℃的耐受性为2h。结果表明在反应少于2h，FDC都具有100%的活性。FDC 的热稳定性对于工业化生产苯乙烯非常有用。

（5）辅酶因子对FDC活性的影响

为了测定辅酶因子对FDC活性的影响，发明人选择多种辅酶因子，包括硫胺素焦磷酸盐 (TPP)，生物素（biotin）和吡哆醛磷酸盐(PLP)来测试它们对FDC的活性影响。将0.5mg不同 处理的酶液加至含有5mM DTT，1.4m tCA的1mL，100mM磷酸钾缓冲液（pH6.5）中，在 温度为30℃时间30min时，分别测定不同处理下的酶活性。以相同条件下不含辅酶因子的反 应体系作为对照实验。以相同条件下不含底物的反应体系作为实验的阴性对照。

结果表明，没有辅酶因子的反应体系增加了FDC的活性，相反，添加这些辅酶因子降低 了FDC的活性。因此，FDC不需要添加任何常用的辅酶因子。

（6）金属离子对FDC活性的影响

为研究金属离子对FDC活性的影响，测定了多种金属离子存在条件下FDC的酶活，包 括ZnS04，FeCl3，MnCl2，MgS04，CaCl2，MnS04和FeS04。将0.5mg不同处理的酶液加 至含有5mM DTT，1.4m tCA的1mL，100mM磷酸钾缓冲液（pH6.5）中，在温度为30℃时 间5min时，分别测定不同处理下的酶活性。以相同条件下不含金属离子的反应体系为对照实 验。以相同条件下不含底物的反应体系作为实验的阴性对照。结果表明Ca2+，Mg2+，Zn2+ 和Fe3+增加了FDC的活性。

使用EDTA法进一步检测Zn2+和Fe3+对FDC活性的影响。将1.4mM tCA,5mM DTT,10mM金属离子，10mM EDTA，0.5mg酶液加至1ml，25mM，磷酸钾缓冲溶液（pH6.5） 中，在温度30℃下培养5min。以相同条件下不含金属离子或EDTA的反应体系为对照实验。 以相同条件下不含底物的反应体系作为实验的阴性对照。含有金属离子和EDTA的反应体系 与对照相比具有相同的活性，结果表明Zn2+和Fe3+增加了FDC的活性，对于工业化生产 苯乙烯，包含金属离子的培养基有益于苯乙烯的生物合成。

（7）底物特异性

为鉴定FDC对底物tCA是否具有高度特异性或底物多样性，使用tCA及其底物类似物， 如阿魏酸，2-甲基肉桂酸，2-羟基肉桂酸，3-羟基肉桂酸，4-羟基肉桂酸，3,4-二甲氧基肉桂 酸和2,5-二甲氧基肉桂酸。将1.4mM tCA，5mM DTT,0.2mM底物和0.5mg酶液加至1ml， 25mM磷酸钾缓冲溶液（pH6.5）中，在温度为30℃时间5min时，分别测定不同处理下的酶 活性。以相同条件下不含底物的反应体系作为实验的阴性对照。底物为阿魏酸，2-甲基肉桂 酸和4-羟基肉桂酸的酶活性分别为57%，35%和68%。FDC没有出示对底物tCA严格特异性， 相反，FDC对底物阿魏酸，2-甲基肉桂酸和4-羟基肉桂酸都具有一定的活性。

底物特异性的分析有助于阐释底物结合位点和酶活性机理，此外，作用底物范围表明可 以通过相同的发酵体系来生产不同的工业单体。除了可以用肉桂酸生产苯乙烯，现在还可以 利用阿魏酸生产4-羟基，3-甲氧基-苯乙烯（又称为4-乙烯基邻甲氧基苯酚，4VG）；利用2- 甲基肉桂酸生产2-甲基苯乙烯、4-羟基肉桂酸生产4-羟基苯乙烯（又称为4-乙烯基苯酚）。