猪平均日增重相关基因Resistin的分子标记及其应用

摘要

本发明涉及猪分子标记制备领域，具体地指一种猪平均日增重相关基因Resistin的分子标记及其应用。本发明利用Resistin基因序列中包含一个SNP位点，位于核苷酸序列SEQ ID NO.1的第861bp处，该位点为T/C的碱基突变，导致Alw26I-RFLP多态性。这个碱基突变位于Resistin基因第3内含子中，不改变其翻译的氨基酸序列。故在Resistin基因序列的SNP位点附近设计引物，得到分子标记序列SEQ ID NO.1，从而鉴定猪平均日增重性状。本发明利用现有的PCR-RFLP技术，在Resistin基因第861bp处发现一个T-C突变，且发现此多态位点与平均日增重性状显著相关，对猪生长性状的研究有一定帮助。

说明书

技术领域

本发明涉及猪分子标记制备领域，具体地指一种猪平均日增重相 关基因Resistin的分子标记及其应用。

背景技术

畜牧业在现代农业发展中占据着非常重要的地位，其在农业生产 中所占有的比值通常用来衡量一个国家和地区发展程度的重要指标。 猪肉作为我国最主要的肉类来源，生猪养殖产业在我国畜牧业中占据 着举足轻重的地位。在20世纪80年代中期，我国肉类产量约2000 万吨，猪肉约占85%，2012年猪肉产量达到了5335万吨，约占肉类 总量63.63%。虽然猪肉所占比重逐渐下降，但其始终占据主导地位。

在养猪行业中，饲料成本占养猪总成本的65-75%。因此，降低生 猪养殖中的饲料消耗，提高饲料利用效率，降低饲料成本关系到养猪 企业发展乃至生存。研究发现，猪的饲料转化效率同采食量、平均日 增重、肌内脂肪等经济性状显著相关（赵克斌，提高生长育肥猪饲料 转化率降低饲料成本的策略.猪业科学，2008，60-63）。因此，影响猪 采食量、平均日增重、肌内脂肪等性状的基因可作为研究猪饲料转化 效率的候选基因。

抵抗素Resistin被美国宾夕法尼亚大学Steppan等（Steppan CM, Bailey ST,Bhat S,Brown EJ,Banerjee RR,Wright CM,Patel HR,Ahima  RS,Lazar MA.″The hormone resistin links obesity to diabetes″[J].Nature, 2001,409(6818):307–312）在成熟的脂肪细胞中发现。同年，Kim等 利用基因芯片分离技术分离得到鼠的Resistin基因（Sung-Eun Kim,He  Huang,Ming Zhao,Xinjun Zhang,Aili Zhang.Wnt Stabilization of  β-Catenin Reveals Principles for Morphogen Receptor-Scaffold  Assemblies[J].Science,Published Online April112013）。随后，Rajala 等运用差减筛选文库分离脂肪细胞在不同分化阶段表达的基因时，也 分离出了Resistin基因（Rajala MW,Lin Y,Ranalletta M,Yanq XM, Qian H,Ginqerich R.Cell type-specific expression and coregulation of  murine resistin and resistin-like molecule-alpha in adipose tissue[J].Mol  Endocrinol,2002,16:1920–30）。潘颖斌等采用PCR-SSCP方法发现 Resistin基因的启动子、外显子、内含子中均发现多态位点（潘颖斌， 刘艳芬，刘铀，高志杰，王群，何万娟，谭敏静.六个品种猪胰岛素 抵抗素基因单核苷酸多态性分析.农业生物技术学报，2008，16(3)： 402-406）。

范红旗通过对胰岛素敏感靶组织-骨骼肌细胞糖摄取功能的研究 表明Resistin能显著抑制肌细胞对葡萄糖摄取（范红旗.Resistin对骨 骼肌细胞糖摄取功能的影响及其机制分析.[硕士学位论文]，南京：南 京医科大学，2007年）。Solana等研究表明小鼠Resistin基因能与受 体酪氨酸激酶样孤儿受体1（ROR1）在ROR1细胞外特定区域结合， 介导3T3-L1前体脂肪细胞分化和葡萄糖摄取（Beatriz  Sánchez-Solana,Jorge Laborda,Victoriano Baladrón.Mouse Resistin  Modulates Adipogenesis and Glucose Uptake in3T3-L1Preadipocytes  Through the ROR1Receptor[J].Molecular  Endocrinology,2012,26(1):110-127）。刘峰等通过进一步研究发现过表 达Resistin减缓胰岛β细胞RINm5F增殖，表明Resistin能够对胰岛 素分泌产生抑制作用（刘峰，邱洁，张春梅，季晨博，郭锡熔.Resistin 基因对胰岛β细胞RINm5F增殖的影响.中国当代儿科杂志，2010， 43-46）。

同时Resistin可作为信号分子调节脂肪生长发育与分布沉积。陈 小东对食物限制及饱食的猪脂肪中一些脂肪分解相关的参数进行了 检测，发现猪的脂肪组织中Resistin显著表达，且Resistin表达水平 同脂肪沉积呈正相关（陈小东.脂肪细胞因子TNF-α与resistin的表达 及其对猪脂肪代谢的调控作用.[博士学位论文]，武汉：华中农业大学， 2004年）。Cieslak发现在波兰大白猪群体中，Resistin基因同背膘厚 显著相关（Cieslak J,Nowacka-Woszuk J,Bartz M,Fijak-Nowak H, Grzes M,Szydlowski M,Switonski M.Association studies on the porcine  RETN,UCP1,UCP3and ADRB3genes polymorphism with fatness  traits[J].Meat Science,2009,83(3):551-554）。

以上研究表明，Resistin能通过对胰岛素作用，调节体内血糖含 量，同时与体内脂肪细胞的增殖、分化及同脂肪的沉积水平有密切联 系，通过调节Resistin表达量，可以控制体内能量代谢平衡。

由于猪的生长性状与体内糖代谢及脂肪沉积有密切关系，因此可 以研究Resistin基因是否对猪生长性状产生影响。由于Resistin在调 节脂类代谢、胰岛素抗性、能量平衡、采食量、炎症等方面起着重要 作用（杨在清，周磊，甘莉，雷霆，陈小冬.Resistin基因的表达及调 控研究.全国动物生理生化第十次学术交流会论文摘要汇编，2008 年），研究Resistin与猪的能量代谢、采食量之间的关系，对于改良 猪的经济性状有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题就是提供一种猪平均日增重相关基 因Resistin的分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种用于获得所述分子标记的引物对，所述引物 对为：

正向引物：5′-CCCTCAGGTGAGTACAGAACT-3′；

反向引物：5′-AAGCCTGCAAGTGGGAATGAG-3′。

本发明还提供了一种分子标记的获得方法，以具有Resistin基因 的猪基因组DNA为模板，采用以下引物对：

正向引物：5′-CCCTCAGGTGAGTACAGAACT-3′；

反向引物：5′-AAGCCTGCAAGTGGGAATGAG-3′。

进行PCR扩增，其所获得的分子标记为SEQ ID NO.2。

本发明还提供了一种分子标记鉴定猪高的平均日增重性状的方 法，以待测猪的基因组DNA为模板，采用以下引物对：

正向引物：5′-CCCTCAGGTGAGTACAGAACT-3′；

反向引物：5′-AAGCCTGCAAGTGGGAATGAG-3′；

进行PCR扩增，其中，具有349bp条带的猪，其具有Resistin 基因，如SEQ ID NO.1。

本发明还提供了一种分子标记在猪部分生长性状及饲料转化效 率性状相关分子标记辅助育种中的应用。

本发明还提供了一种分子标记的引物对在猪部分生长性状及饲 料转化效率性状相关分子标记辅助育种中的应用。

一种鉴定含有Resistin基因的猪的方法，包括以下步骤是：

1）引物对：

正向引物：5′-CCCTCAGGTGAGTACAGAACT-3′；

反向引物：5′-AAGCCTGCAAGTGGGAATGAG-3′；

2）PCR扩增条件

PCR反应总体积10μl，其中待测猪基因组DNA模板1μl，正反 向引物各0.2nmol/μl，PCRmix5μl，最后加入去离子水至总体积10μl；

3）PCR反应条件为：95℃预变性5min后，循环30次95℃变性 30s、58℃退火30s、72℃延伸40s；最后72℃延伸5min；PCR产物 经2％W/V琼脂糖凝胶电泳检测；

4）RFLP检测

PCR产物酶切反应体积是10μl，其中PCR产物5μl，去离子水 3.5μl，10×buffer1μl，限制性内切酶Alw26I为0.5μl(10U/μl)，

将样品混匀后离心，37℃培养箱放置12h，用3.5%W/V琼脂糖 凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照；

酶切产生三种基因型，TT基因型只有349bp一条带，CC基因型 有183bp和166bp两条带，杂合子TC基因型有349bp、183bp和166bp 三条带。

本发明原理

Resistin基因序列中包含一个SNP位点，位于核苷酸序列SEQ ID NO.1的第861bp处，该位点为T/C的碱基突变，导致Alw26I-RFLP 多态性。这个碱基突变位于Resistin基因第3内含子中，不改变其翻 译的氨基酸序列。故在Resistin基因序列的SNP位点附近设计引物， 得到分子标记序列SEQ ID NO.1，从而鉴定猪平均日增重性状。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种与猪部分生长性状及饲料转化效率性状相关的分子标记的 获得：

1）猪Resistin基因的引物设计与部分DNA序列扩增

用猪Resistin基因序列信息(GenBank收录号： ENSSSCG00000013575)作为引物设计的模板序列，利用生物学引物 设计软件Oligo7.0设计引物，引物序列如下：

正向引物：5′-CCCTCAGGTGAGTACAGAACT-3′；

反向引物：5′-AAGCCTGCAAGTGGGAATGAG-3′；

2）PCR扩增反应：

利用TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒（购自美国invitrogen公 司）从纯种美系大白阉割猪实验群体（该群体来源于湖北金林育种 场，）（屠宰测定与采样分成21个批次进行，测定个体数量共计236 头，全部为美系纯种大白阉割公猪）耳组织中提取基因组DNA，具 体操作方法参照TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒说明书进行。

PCR反应：反应总体积为30μl，其中猪DNA模板3.0μl，PCRmix 15μl，正向引物和反向引物各0.6nmol/μl，最后加去离子水至总体积 30μl。PCR反应条件为：95℃预变性5min后，循环30次95℃变性 30s、58℃退火30s、72℃延伸40s，最后72℃延伸5min。PCR产物 经1%(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测，获得了部分Resistin片段，长度为 349bp，其序列为SEQ ID NO.2所示。

3）PCR产物的纯化、测序

PCR产物的纯化：在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的 片段的凝胶，放入1.5ml离心管中，然后用PCR产物纯化试剂盒（购 自北京百泰克公司）纯化PCR产物。将纯化后的DNA溶液送至上海英 骏公司正反向测序。

用引物扩增猪基因组DNA得到了349bp特异性扩增片段，如图 2所示，正反向测序结果发现该片段所在的Resistin基因（SEQ ID  NO.1所示）的第861位发现一个T-C转换（如图3所示），造成一个 Alw26I酶切位点。

一种基于与猪平均日增重相关的分子标记的检测方法，其步骤 如下：

1）引物序列

正向引物：5′-CCCTCAGGTGAGTACAGAACT-3′；

反向引物：5′-AAGCCTGCAAGTGGGAATGAG-3′；

该引物扩增片段长度349bp，其序列为SEQ ID NO.2所示。

2）PCR扩增条件

PCR反应总体积10μl，其中猪基因组DNA模板1μl，正反向引 物各0.2nmol/μl，PCRmix5μl，最后加入去离子水至总体积10μl。PCR 反应条件为：95℃预变性5min后，循环30次95℃变性30s、58℃退 火30s、72℃延伸40s；最后72℃延伸5min。PCR产物经2％（W/V） 琼脂糖凝胶电泳检测。

3）RFLP检测

PCR产物酶切反应体积是10μl，其中PCR产物5μl，去离子水 3.5μl，10×buffer1μl，限制性内切酶Alw26I为0.5μl(10U/μl)，将样 品混匀后离心，37℃培养箱放置12h，用3.5%（W/V）琼脂糖凝胶电 泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。

酶切产生三种基因型，TT基因型只有349bp一条带，CC基因型 有183bp和166bp两条带，杂合子TC基因型有349bp、183bp和166bp 三条带。

一种与猪平均日增重性状的分子标记在与猪部分生长性状及饲 料转化效率性状相关的分子标记辅助育种中的应用，步骤如下：

采集样品的平均日增重、采食量、预测采食量、剩余采食量、饲 料转化率及肌内脂肪6项指标。根据采集样品的群体结构，运用混合 模型来统计分析Resistin基因SNP位点的基因型效应及其与饲料转化 效率性状的关系：

Y_ij=μ+genotypei+ε_ij+G

其中，Y_ij为处理后性状值，μ为总体均值，εij为随机误差，G为 批次效应，假定服从N（0，σ²）分布。即可分析出基因型效应，完成 基因型效应的多重性比较。采用SPSS16.0软件（AsiaAnalytics China） 进行数据处理与统计分析。

统计分析发现该基因的T>C突变基因型，其中TT型与CC型的 不同与平均日增重显著相关（P=0.038），与采食量、预测采食量及剩 余采食量不显著相关。通过最小二乘均数对基因型为TT、CC、TC 的个体进行两两比较，结果表明TT型基因型平均日增重高于CC型 基因型个体，TC型基因型与其他两种基因型之间无显著差异。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明利用现有的PCR-RFLP技术，在Resistin基因第861bp处 发现一个T-C突变，且发现此多态位点与平均日增重性状显著相关， 对猪生长性状的研究有一定帮助。

附图说明

图1为本发明技术流程图。

图2为猪Resistin基因基因组扩增电泳结果示意图。

M：DL2000分子量标记；

图3为本发明中猪Resistin基因测序发现的T>C突变。

图4为猪Resistin基因外显子的Alw26I-RFLP的三种基因型(TT  CC TC)电泳结果示意图。

M：50bpDNA分子量标记；P：PCR产物。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明 的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

实施例1：

一种与猪平均日增重性状相关的分子标记的获得：

（一）猪Resistin基因的引物设计与部分DNA序列扩增

用猪Resistin基因序列信息(GenBank收录号： ENSSSCG00000013575)作为引物设计的模板序列，利用生物学引物 设计软件Oligo7.0设计引物，引物序列如下：

正向引物：5′-CCCTCAGGTGAGTACAGAACT-3′；

反向引物：5′-AAGCCTGCAAGTGGGAATGAG-3′；

（2）PCR扩增反应：

利用TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒（购自美国invitrogen公 司）从纯种美系大白阉割猪实验群体（该群体来源于湖北金林育种场） （屠宰测定与采样分成21个批次进行，测定个体数量共计236头， 全部为美系纯种大白阉割公猪）耳组织中提取基因组DNA，具体操 作方法参照TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒说明书进行。

PCR反应：反应总体积为30μl，其中猪DNA模板3.0μl，PCRmix 15μl，正向引物和反向引物各0.6nmol/μl，加入去离子水至总体积 30μl。PCR反应条件为：95℃预变性5min后，循环30次95℃变性 30s、58℃退火30s、72℃延伸40s，最后72℃延伸5min。PCR产物 经1（W/V）%琼脂糖凝胶电泳检测，获得了部分Resistin片段，长 度为349bp，其序列为SEQ ID NO.2所示。

（3）PCR产物的纯化、测序

PCR产物的纯化：在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的 片段的凝胶，放入1.5ml离心管中，然后用PCR产物纯化试剂盒（购 自北京百泰克公司）纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步 骤是按照100mg胶块加入400μl GS Buffer的比例加入GS Buffer，置 50℃温育10min，使琼脂糖胶块完全溶化，每两分钟颠倒混匀一次； 将溶化的胶液转入到离心吸附柱，并将离心吸附柱置于废液收集管 中，10000rpm离心30s，弃去废液；将离心吸附柱置回废液收集管中， 加入500μl Wash Buffer于离心吸附柱中，10000rpm离心30s，弃滤液。 以同样的方法再用500μl Wash Buffer溶液洗涤一次；将离心吸附柱置 会废液收集管中，最高速度离心1min；小心取出离心吸附柱，将其套 入一个无菌的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入30μl双蒸水，室温静 置2-10min后，最高速度离心1min；取出离心吸附柱，将1.5ml离心管 （DNA溶液）置于-20℃保存备用。将纯化后的DNA溶液送至上海英 骏公司正反向测序。

用引物扩增猪基因组DNA得到了349bp特异性扩增片段，如图2 所示，正反向测序结果发现该片段所在的Resistin基因（SEQ ID NO.1 所示）的第861位发现一个T-C转换（如图3所示），造成一个Alw26I酶 切位点

实施例2：

一种基于与猪平均日增重性状相关的分子标记的检测方法，其步 骤如下：

PCR-RFLP诊断方法建立

（1）引物序列

正向引物：5′-CCCTCAGGTGAGTACAGAACT-3′；

反向引物：5′-AAGCCTGCAAGTGGGAATGAG-3′；

该引物扩增片段长度349bp，其序列为SEQ ID NO.2所示。

（2）PCR扩增条件

PCR反应总体积10μl，其中猪基因组DNA模板1μl，正反向引 物各0.2nmol/μl，PCRmix5μl，最后加入去离子水至总体积10μl。PCR 反应条件为：95℃预变性5min后，循环30次95℃变性30s、58℃退 火30s、72℃延伸40s；最后72℃延伸5min。PCR产物经2％（W/V） 琼脂糖凝胶电泳检测。

（3）RFLP检测

PCR产物酶切反应体积是10μl，其中PCR产物5μl，去离子水 3.5μl，10×buffer1μl，限制性内切酶Alw26I为0.5μl(10U/μl)，将样 品混匀后离心，37℃培养箱放置12h，用3.5%（W/V）琼脂糖凝胶电 泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。

酶切产生三种基因型，TT基因型只有349bp一条带，CC基因型 有183bp和166bp两条带，杂合子TC基因型有349bp、183bp和166bp 三条带，如图4所示。

实施例3：

一种与猪平均日增重性状相关的分子标记在不同猪群体多态性 检测中的应用，其步骤是：

利用PCR-Alw26I-RFLP检测了纯种美系大白阉割猪实验群体（该 群体来源于湖北金林育种场）（236个美系纯种大白阉割公猪群体）。 该突变位点在实验群体中的基因型和基因频率如表1所示，检测结果 显示，Resistin基因在实验群体中存在三种基因型，其中TT型个体有 104头，TC型个体有112头，CC型个体有20头，酶切分型的检测 结果与测序结果相符,本发明的检测方法可靠。此结果表明Resistin 基因在纯种美系大白阉割猪实验群体中等位基因T占优势。

实施例4：

一种与猪平均日增重性状相关的分子标记与部分生长性状及饲 料转化效率性状的关联分析

本实施例的猪群来自本湖北金林育种场纯种美系大白阉割猪，屠 宰测定与采样分成21个批次进行，测定个体数量共计236头，全部 为美系纯种大白阉割公猪。

所分析的性状主要是部分生长性状及与饲料转化效率性状相关 的性状，包括：平均日增重、采食量、预测采食量、剩余采食量、饲 料转化率及肌内脂肪6项指标。根据采集样品的群体结构，申请人运 用混合模型来统计分析Resistin基因SNP位点的基因型效应及其与部 分生长和饲料转化效率性状的关系：

Yij=μ+genotypei+ε_ij+G

其中，Yij为处理后性状值，μ为总体均值，εij为随机误差，G为 批次效应，假定服从N（0，σ²）分布。即可分析出基因型效应，完成 基因型效应的多重性比较。采用SPSS16.0软件（软件来自于 AsiaAnalytics China）进行数据处理与统计分析。

对猪Resistin基因Alw26I-RFLP多态性位点与部分生长及饲料转 化效率性状进行关联分析，由表1知：在236个个体中TT型个体 有104头，TC型个体有112头，CC型个体有20头。

本实施例采用SPSS16.0软件中的广义线性模型对猪Resistin基因 的T>C突变位点的多态在美系大白阉割猪群体中对部分生长及饲料 转化效率性状进行了初步的关联分析。初步分析结果见表1。统计分 析发现该基因的T>C突变基因型，其中TT型与CC型的不同与平均 日增重显著相关（P=0.038），与采食量、预测采食量及剩余采食量不 显著相关。通过最小二乘均数对基因型为TT、CC、TC的个体进行 两两比较，结果表明TT型基因型平均日增重高于CC型基因型个体， TC型基因型与其他两种基因型之间无显著差异。

表1Resistin基因多态性位点基因型与部分生长性状及饲料转化效率性状的关联分析检测

注：表中的性状均值为平均数±标准差。

ADG：平均日增重；FI：日采食量；PFI：预测日采食量；RFI： 剩余采食量；FCR：饲料转化率；IMF：肌内脂肪。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明 做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实 施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施 例，这些实施例都属于本发明保护范围。