SmCPS4蛋白及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了一种SmCPS4蛋白及其编码基因与应用。本发明公开的一种蛋白，为如下（1）或（2）所示：（1）SEQ ID No.3所示的蛋白；（2）将SEQ ID No.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。本发明公开的SmCPS4基因与丹参中另一个SmKSL2基因联合，介导催化形成丹参中一种新的半日花烷型二萜类化合物13-epi-manoyl oxide，这两个基因是首次发现的植物中能催化形成13-epi-manoyl oxide结构类型的二萜合酶基因，该合成途径的解析为利用合成生物学生产类似化合物，深入研究此类化合物的药理作用提供了重要的基础。

说明书

技术领域

本发明涉及一种SmCPS4蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

药用植物丹参（Salvia miltiorrhiza Bge.）为一味常用中药，素有“一味丹参， 功同四物”的美称，具有活血化瘀，理气止痛的功效，是众多复方、保健品的主要成 分。其中脂溶性的松香烷型丹参酮类化合物为丹参中主要的二萜类化合物。二萜合酶 基因是形成二萜类化合物的关键酶基因（Trapp SC,Croteau R.Genomic Organization  of Plant Terpene Synthases and Molecular Evolutionary Implications.Genetics, 2001,158:811–832）。在双子叶植物中，二萜类化合物大多通过两类二萜合酶：CPS （copalyl pyrophosphate synthase）和KSL（kaurene-like synthase）连续催化来 完成从直链前体牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP） 到二萜母核的环化。通过基因组序列分析（Ma,Y.M.,Yuan,L.C.,Wu,B.,Li,X. E.,Chen,S.L.,and Lu.S.F.(2012).Genome-wi.de identification and  characterization of novel genes involved in terpenoid biosynthesis in Salvia  miltiorrhiza.J.Exp.Bot.63:2809-2823.）发现丹参基因组内存在5个CPS和2个 KSL基因。其中SmCPS1和SmKSL1已被证实为参与丹参酮生物合成的关键酶基因（Gao,W., Hillwig,M.L.,Huang,L.Q.,Cui,G.H.,Wang,X.Y.,Kong,J.Q.,Yang,B., Peters,R.J.(2009).A functional genomics approach to tanshinone biosynthesis  provides stereochemical insights.Org.lett.11:5170-5173.）。在菊科植物 Grindelia robusta中发现的GrTPS1和GrTPS6能催化GGPP形成manoyl oxide（Zerbe,P., Hamberger,B.,Yuen,M.,Chiang,A.,Sandhu,H.,Madilao,L.,Nguyen,A., Hamberger,B.,Bach,S.S.,and Bohlmann,J.(2013).Gene Discovery of Modular  Diterpene Metabolism in Nonmodel Systems.Plant Physiol.162:1073–1091.）。

发明内容

本发明的目的是提供一种SmCPS4蛋白及其编码基因与应用。

本发明提供的一种蛋白，为如下（1）或（2）所示：

（1）SEQ ID No.3所示的蛋白；

（2）将SEQ ID No.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。

上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

上述编码基因中，所述编码基因为如下中至少一种：

1）SEQ ID No.1所示的DNA分子；

2）在严格条件下与1）限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

3）与1）或2）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述蛋白质的DNA 分子。

含有上述任一所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于 本发明的保护范围。

一种蛋白组合物也属于本发明的保护范围，由上述蛋白和SEQ ID No.4所示的蛋 白组成。

上述蛋白在合成(13E)-8α-hydroxylabden-15-yl diphosphate中的应用也属于 本发明的保护范围。

上述蛋白在催化牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成(13E)-8α-hydroxylabden-15-yl  diphosphate中的应用也属于本发明的保护范围。

(13E)-8α-hydroxylabden-15-yl diphosphate的化学结构式如图6中的LDPP 所示。

上述蛋白组合物在合成13-epi-manoyl oxide中的应用也属于本发明的保护范 围。

上述蛋白组合物在催化牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成13-epi-manoyl oxide中的 应用也属于本发明的保护范围。

上述蛋白或上述蛋白组合物在丹参中合成13-epi-manoyl oxide中的应用也属于 本发明的保护范围。

13-epi-manoyl oxide的化学结构式如图6中所示。

本发明提供的SmCPS4基因是丹参地上部分特别是花萼特异表达的基因，其与丹参 中另一个SmKSL2基因联合，介导催化形成丹参中一种新的半日花烷型二萜类化合物 13-epi-manoyl oxide，这两个基因是首次发现的植物中能催化形成13-epi-manoyl  oxide结构类型的二萜合酶基因，13-epi-manoyl oxide的该合成途径的解析为利用合 成生物学生产类似化合物，深入研究此类化合物的药理作用提供了重要的基础。

附图说明

图1为SmCPS4和SmKSL2与其他已知功能二萜合酶基因的分子进化树。

图2为丹参SmCPS4和SmKSL2基因的表达。

图3为丹参SmCPS4重组蛋白的纯化。

图4为丹参SmCPS4重组蛋白的酶促反应结果。

图5为丹参SmCPS4和SmKSL2重组蛋白的酶促反应和植株中13-epi-manoyl oxide 化合物的检测。

图6为SmCPS4和SmKSL2联合催化GGPP产生13-epi-manoyl oxide的反应过程。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

丹参（Salvia miltiorrhiza）在文献“崔光红，王学勇，冯华，赵静雪，黄璐 琦.丹参乙酰CoA酰基转移酶基因全长克隆和SNP分析.药学学报，2010，45(6): 785-790）”中公开过，公众可从中国科学院植物研究所获得。

SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit购自Clontech公司。

pMD19-T载体购自Takara公司。

LA Taq购自Takara公司。

Labdenediol购自云南西力生物技术有限公司，产品目录号为BBP02205，CAS号 为10267-31-9。

N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide（MSTFA）购自sigma公司， 产品目录号为394866，CAS号为24589-78-4。

吡啶购自sigma公司，产品目录号为437611，CAS号为110-86-1。

实施例1、丹参SmCPS4和SmKSL2全长cDNA序列的克隆

基因组序列分析显示，丹参的SmCPS4和SmKSL23’端均为完整序列（Ma,Y.M., Yuan,L.C.,Wu,B.,Li,X.E.,Chen,S.L.,and Lu.S.F.(2012).Genome-wide  identification and characterization of novel genes involved in terpenoid  biosynthesis in Salvia miltiorrhiza.J.Exp.Bot.63:2809-2823.），需要克隆 5’端形成完整cDNA序列。采用SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit扩增SmCPS4 和SmKSL2的5’末端，按照说明书进行操作。

一、设计并合成如下引物

CPS4-GSP1：5’-CCAAGCTGAAGAGCAGTGATGTGGGCTC-3’

KSL2-GSP1：5’-TTCCTGCCATGCTTGATTATGCCAGAGG-3’。

二、Trizol法提取丹参的总RNA，利用SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit试 剂盒中引物5’-CDS primer进行反转录得到cDNA。

以反转录得到的cDNA为模板，以UPM和CPS4-GSP1为引物进行PCR扩增，得到 SmCPS4基因的cDNA5’末端，目的产物为808bp，该序列包含SmCPS4基因的5’末端 完整序列。

以反转录得到的cDNA为模板，以UPM和KSL2-GSP1为引物进行PCR扩增，得到 SmKSL2基因的cDNA5’末端，目的产物为705bp,该序列包含SmKSL2基因的5’末端 完整序列。

5’-CDS primer和UPM引物为SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit自带。

PCR程序：94℃预变性5min；94℃30s，68℃30s，72℃3min，35个循环； 72℃延伸5min。

三、使用LA Taq采用LA-PCR方法，进行如下反应：

Trizol法提取丹参的总RNA，以SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒中 引物5’-CDS primer进行反转录得到cDNA为模板，CPS4F和CPS4R为引物进行PCR 扩增，得到SmCPS4基因的全长cDNA序列（如SEQ ID No.1所示）。

Trizol法提取丹参的总RNA，以SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒中 引物5’-CDS primer进行反转录得到cDNA为模板，KSL2F和KSL2R为引物进行PCR 扩增，得到SmKSL2基因的全长cDNA序列（如SEQ ID No.2所示）。

引物如下：

CPS4F：5’-GCGATATCATGTCATTTGCGTCCAACGC-3’；

CPS4R：5’-TGCGGCCGCCTAGACTATTTTTTCAAACAATAC-3’。

KSL2F：5’-GCGATATCATGGCGCTTCC TCTCTCCACTTG-3’；

KSL2R：5’-GGAAAGCGGCCGCTCAACCATGAAGCTTTGATAATCC-3’。

（下划线所示序列为酶切识别位点）

PCR程序：94℃预变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃3min，35个循环； 72℃延伸5min。

四、将SmCPS4基因的全长cDNA序列和SmKSL2基因的全长cDNA序列分别插入 pMD19-T载体中得到重组质粒pMD19T-SmCPS4和pMD19T-SmKSL2，将重组质粒进行双 向测序，并用于原核表达载体的构建。

五、SmCPS4和SmKSL2

SmCPS4基因（SEQ ID No.1所示），编码776个氨基酸残基（如SEQ ID No.3所示）。

SmKSL2基因（SEQ ID No.2所示），编码807个氨基酸残基（如SEQ ID No.4所示）。

实施例2、SmCPS4和SmKSL2的基因表达谱

为进一步探索SmCPS4和SmKSL2的功能，利用半定量RT-PCR对来源于丹参花期的 13个组织（依次为花期的木栓层，皮层，木质部，茎，叶，小花（花瓣短于花萼）， 待开放花（花瓣长于花萼，但未开放），盛开花，花瓣，花萼，雄蕊，雌蕊，未成熟种 子，编号依次为1-13）和发芽第三天的幼根（编号为14）和幼叶（编号为15）进行 基因表达谱的研究。编号对应的组织示意图如图2A所示，半定量RT-PCR结果如图2B 所示。

利用Trizol法提取各组织的总RNA，利用反转录试剂盒Transcript First-strand  cDNA Synthesis Super Mix（购自北京全式金生物技术有限公司）反转录得到cDNA。

以cDNA为模板，以CPS4-F1和CPS4-R1为引物进行PCR扩增，鉴定SmCPS4基因；

以cDNA为模板，以KSL2-F1和KSL2-R1为引物进行PCR扩增，鉴定SmKSL2基因；

同时以cDNA为模板，以actin-F和actin-R为引物进行PCR扩增，鉴定actin 基因，作为内参。

引物如下：

CPS4-F1：5’-CGGCTGGCTTGGGCTACAACAATA-3’；

CPS4-R1：5’-TCCCTGGTGACCTCCTCCTTCCCA-3’；

KSL2-F1:5’-TTAGTTTTGGAGGGCAAGAAGAGTGT-3’；

KSL2-R1:5’-CTCCTGTTTGGTCGTTGAGAAGAATA-3’；

actin-F:5’-AGGAACCACCGATCCAGACA-3’；

actin-R:5’-GGTGCCCTGAGGTCCTGTT-3’。

图2B中，CPS4和KSL2分别代表SmCPS4和SmKSL2。

图2B表明，SmCPS4基因在茎、叶以及花中均有表达，特别是花萼中有强烈表达。 在发芽3天的幼叶中也有明显表达，而在幼根及花期植物根中均无表达。SmKSL2基因 在不同组织中均有表达，没有显著的组织表达特异性。揭示SmCPS4基因为丹参地上部 分特异表达的基因，其有可能具有新的功能。

实施例3、SmCPS4和和SmKSL2的功能分析

一、大肠杆菌表达载体的构建

EcoRV和NotI双酶切pMD19T-SmCPS4，得到基因片段；EcoRV和NotI双酶切pET32a （+），得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒pET-SmCPS4；

EcoRV和NotI双酶切pMD19T-SmKSL2，得到基因片段；EcoRV和NotI双酶切pET32a （+），得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒pET-SmKSL2；

将pET-SmCPS4和pET-SmKSL2送测序，结果正确。

测序结果表明，pET-SmCPS4在EcoRV和NotI酶切位点间插入了SEQ ID No.1所 示的DNA分子；pET-SmKSL2在EcoRV和NotI酶切位点间插入了SEQ ID No.2所示的 DNA分子。

将pET-SmCPS4和pET-SmKSL2分别导入大肠杆菌表达菌株Tuner（DE3）（购自 Novagen公司）中，得到pET-SmCPS4重组菌和pET-SmKSL2重组菌。

同时用不含目的基因的pET32a（+）空载体转化大肠杆菌表达菌株Tuner（DE3） 作为对照菌。

二、蛋白的诱导表达

挑取pET-SmCPS4重组菌、pET-SmKSL2重组菌和对照菌分别接种于2mL的LB液 体培养基（含羧苄青霉素50mg/L）中，于37℃振荡培养过夜。次日按体积比1：100 稀释加入到200mL LB液体培养基（含羧苄青霉素50mg/L）中，37℃振荡培养至OD600 为0.6时转入16℃振摇1h，然后加入IPTG至终浓度0.5mM，继续于16℃摇床培养10 小时诱导目标蛋白表达。将菌液用10000rpm离心5分钟，弃上清，收集pET-SmCPS4 重组菌、pET-SmKSL2重组菌和对照菌菌体。将各菌体用20mL磷酸盐缓冲液（50mM 磷酸盐缓冲液，含有100mM KCl，10mM MgCl₂，体积百分含量10%甘油，2mM DTT） 溶解，在冰浴条件下用超声波处理，12000rpm，4℃离心15分钟，分别得到SmCPS4、 SmKSL2和对照上清备用。

三、重组蛋白SmCPS4的纯化

在SmCPS4上清中加入咪唑至终浓度为20mM。上清液使用0.45μm滤膜过滤。 滤液经HisTrap HP（1mL）纯化柱（购自GE Healthcare公司），用12mL Washing buffer （50mmol·L^-1Na₂HPO₄，300mmol·L^-1NaCl，100mmol·L^-1咪唑,10mmol·L^-1MgCl₂， pH7.4）梯度漂洗，用3mL Elution buffer（50mmol·L^-1Na₂HPO₄，300mmol·L^-1NaCl， 500mmol·L^-1咪唑，pH7.4）洗脱，得到洗脱液，将洗脱液用PD-10柱（购自GE Healthcare公司）进行脱盐处理，将缓冲液置换为50mM磷酸盐缓冲液（pH7.4,体 积百分含量10%甘油,2mM DTT,10mM MgCl₂），将脱盐处理的洗脱液经Bradford法 进行蛋白定量，得到浓度为280ng·uL^-1的纯化重组蛋白SmCPS4。

将对照上清、SmCPS4上清和纯化的SmCPS4进行SDS-PAGE，结果如图3所示。图 3中，CPS4代表SmCPS4。

图3表明，纯化后的SmCPS4大小约为95KD，大小与预期相符。

四、SmCPS4的酶促活性分析

（一）取步骤三纯化的SmCPS4和空载体对照进行酶促反应

实验组未脱磷反应：酶促反应总体系为400uL，其中浓度为280ng·uL^-1的SmCPS4 重组蛋白200uL，底物为1078ug·mL^-1浓度的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP）5uL， 余量为195uL50mM磷酸盐缓冲液（pH7.4,体积百分含量10%甘油,2mM DTT,10 mM MgCl₂），将体系在30℃放置3h后用正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干 待用。

空载体对照未脱磷反应：实验同上述的实验组未脱磷反应，将SmCPS4重组蛋白替 换为步骤二制备的对照上清。

实验组脱磷反应：将上述实验组未脱磷反应体系的水相（水相是指酶促反应总体 系为400uL，其中浓度为280ng·uL^-1的SmCPS4重组蛋白200uL，底物为1078ug·mL^-1浓度的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP）5uL，余量为195uL50mM磷酸盐缓冲液（pH 7.4,体积百分含量10%甘油,2mM DTT,10mM MgCl₂），将体系在30℃放置3h后） 按照95uL水相加入5uL碱性磷酸酶的比例进行脱磷处理。37℃放置过夜后，用正己 烷萃取3次，合并正己烷层用氮气吹干，待用。

空载体对照脱磷反应：实验同上述的实验组脱磷反应，将SmCPS4重组蛋白替换为 步骤二制备的对照上清。

将上述各组的提取物在上样检测前用80μL体积百分含量为98.5%的 N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide（MSTFA）和8μL体积百分含 量为98%的吡啶在80℃衍生化40min，得到衍生后的产物。

同时以Labdenediol为标准品，进行上述衍生实验。

（二）利用串联四极杆质谱GC-QqQ-MS进行目标化合物的检测

GC-QqQ-MS分析系统为Agilent7890A GC配备Agilent7000B triple quadruple  MS系统。衍生后的各组反应产物进样量1μL，splitless模式。气相色谱柱为DB-5ms (30m x0.25mm i.d.,0.25-μm film thickness,Agilent J&W ScientiWc,USA). 氦气流速1.0ml·min^-1。进样口温度280℃。升温程序为50℃min,程序升温20℃ min^-1到200℃,然后以5℃min^-1到300℃。质谱接口温度280℃。

GC-QqQ-MS分析结果如图4所示。

图4A为各组酶促反应的GC图谱。

图4A中，空载体对照（脱磷前）代表空载体对照未脱磷反应；空载体对照（脱磷 后）代表空载体对照脱磷反应；Sm-CPS4-（脱磷前）代表实验组未脱磷反应；Sm-CPS4- （脱磷后）代表实验组脱磷反应。

图4B为图4A中实验组脱磷反应产物中的峰1与标准品labdenediol加衍生化试 剂后的EI质谱图。

图4B表明，经GC-QqQ-MS分析，SmCPS4与GGPP反应后，在脱磷条件下产生一个 已知化合物labdenediol((13E)-labda-8α,15-diol)。Labdenediol被认为是以 GGPP为底物产生的反应产物(13E)-8α-hydroxylabden-15-yl diphosphate(LDPP) 的脱磷产物（Schalk,M.,Pastore,L.,Mirata,M.A.,Khim,S.,Schouwey,M., Deguerry,F.,Pineda,V.,Rocci,L.,and Daviet,L.(2012).Toward a  biosynthetic route to sclareol and amber odorants.Journal of the American  Chemical Society,134(46):18900-18903.）。而实验组未脱磷反应以及空载体对照 反应中均无此化合物，结果表明SmCPS4催化GGPP形成了LDPP。

SmCPS4催化GGPP形成LDPP这一功能与已鉴定的烟草中NtCPS2（Sallaud,C., Giacalone,C.,R.,Goepfert,S.,Bakaher,N.,S.,and Tissier, A.(2012).Characterization of two genes for the biosynthesis of the labdane  diterpene Z-abienol in tobacco(Nicotiana tabacum)glandular trichomes.Plant  J.72:1-17.），南欧丹参salvia sclarea中的SsLPS（Schalk,M.,Pastore,L., Mirata,M.A.,Khim,S.,Schouwey,M.,Deguerry,F.,Pineda,V.,Rocci,L., and Daviet,L.(2012).Toward a biosynthetic route to sclareol and amber  odorants.Journal of the American Chemical Society,134(46):18900-18903. ）和菊科植物Grindelia robusta中发现的GrTPS1（Zerbe,P.,Hamberger,B.,Yuen, M.,Chiang,A.,Sandhu,H.,Madilao,L.,Nguyen,A.,Hamberger,B.,Bach,S. S.,and Bohlmann,J.(2013).Gene Discovery of Modular Diterpene Metabolism  in Nonmodel Systems.Plant Physiol.162:1073–1091.）功能相同。

（三）SmCPS4和SmKSL2联合产生13-epi-manoyl oxide（13-epi-泪柏醚）

实验组：在步骤(一)的实验组未脱磷反应体系中加入300uL浓度200ng·uL^-1的步骤二制备的SmKSL2上清液后，将该体系30℃反应3h后，用正己烷萃取3次，合 并正己烷层并用氮气吹干，得到反应物（不需衍生化）。利用步骤（二）的GC-QqQ-MS 条件分析反应产物。

对照组：用步骤二制备的对照上清代替上述实验组中的SmKSL2上清液，进行同样 反应作为阴性对照。

图5A为实验组和对照组的酶促反应产物的GC图谱，可见SmCPS4和SmKSL2联合 反应生成两个产物，其中峰2为主产物。

图5C中从上到下第一个和第二个图分别为酶促反应产物中峰1和峰2的EI-MS 图谱，其中主要产物峰2与文献报导的13-epi-manoyl oxide质谱图一致，另一个微 量产物是其异构体manoyl oxide，两者最主要质谱图区别是离子275和257的丰度比 例不同（Demetzos,C.,Kolocouris,A.,and Anastasaki,T.(2002).A simple and  rapid method for the differentiation of C-13manoyl oxide epimers in  biologically important samples using GC–MS analysis supported with NMR  spectroscopy and computational chemistry results.Bioorg.Med.Chem.Lett.12: 3605–3609.），根据此特点可以得到准确的鉴别。

实施例4、植物材料中13-epi-泪柏醚（13-epi-manoyl oxide）的检测

取花期丹参植株的根、茎、叶、花萼和花瓣进行13-epi-manoyl oxide化合的检 测。具体步骤如下：将新鲜材料冻干48h后，研磨成粉，取各组织的粉末100mg，加 入2mL正己烷进行提取，同时加入内标正二十四烷0.8ug/mL。超声提取30min后， 离心，取各上清液用于GC-QqQ-MS检测（检测前不需衍生化）。GC-QqQ-MS检测方法与 实施例3中步骤四的（二）方法相同。

结果如图5B和5C中从上到下第三个图所示。

图5B表明，经GC-QqQ-MS检测，在丹参植株花萼，花瓣，叶和茎中均检出 13-epi-manoyl oxide，其花萼中的13-epi-manoyl oxide（花萼中峰2）的EI质谱图 （图5C中从上到下第三个图）与酶促反应体系（实施例3步骤四的（三）实验组）中 的峰2完全一致。其中花萼中13-epi-manoyl oxide含量最高，相对含量0.17ug·g^-1； 叶和花瓣中均为0.03ug·g^-1，茎中为0.02ug·g^-1，而根中没有检测到。该结果与实 施例2的SmCPS4的基因表达结果相吻合。表明该成分在丹参地上部分特别是花萼中特 异积累。同时在丹参已报道的80多种萜类化合物中，还没有半日花烷型二萜的报道。 因此，该化合物为通过基因功能挖掘而发现的丹参中含有的新化合物，通过体外酶促 和植株体内化合物的检测，证实丹参植物体内的确存在一条半日花烷型二萜的合成途 径。

SmCPS4与二萜类共同底物牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP）反应的产物为(13E)- 8α-hydroxylabden-15-yl diphosphate（LDPP），随后SmKSL2将其催化产生 13-epi-manoyl oxide，13-epi-manoyl oxide为半日花烷型二萜类化合物，反应如图 6所示，图6中，CPS4和KSL2分别代表SmCPS4和SmKSL2。