一个来源于玉米的转录因子及其编码基因的新用途

摘要

本发明公开了一个来源于玉米的转录因子及其编码基因的新用途。本发明所提供的一种新用途是利用ZmNLP1;1的编码核酸分子培育转基因植物的方法。该方法是培育具有如下1）-4）中至少一种性状的转基因植物的方法，包括向受体植物中导入ZmNLP1;1基因的步骤：1）地上部分生物量高于所述受体植物；2）受硝酸盐诱导后，硝酸盐转运蛋白基因表达量高于所述受体植物；3）受硝酸盐诱导后，硝酸盐还原酶基因表达量高于所述受体植物；4）受硝酸盐诱导后，亚硝酸盐还原酶基因表达量高于所述受体植物；所述ZmNLP1;1基因编码SEQ ID No.2所示的蛋白质。实验证明，在以硝态氮（NO3-）为唯一氮源的条件下，转入ZmNLP1;1基因的拟南芥与受体拟南芥相比，其地上部生物量和总生物量明显增加。

说明书

技术领域

本发明涉及一个来源于玉米的蛋白质转录因子及其编码基因的新用途，特别涉及一个来源于玉米的与硝酸盐吸收利用相关的转录因子及其编码基因的新用途。

背景技术

氮素是植物必须的矿质营养元素之一，是合成蛋白质、核酸和许多生物活性物质的必需组分，与作物产量、品质有着密切的关系。氮肥在农业生产中的使用极大地提高了作物产量。当前全球每年施用大约8～9千万吨氮肥，经预测到2050年可增加至2.4亿吨（Ti lman et al.,1999,Proc Natl Acad Sci USA 96:5995-6000）。能源费用的提高导致了氮肥价格的不断上涨从而增加了农业生产成本，同时氮肥的流失也在逐步恶化生态环境。基于经济效益和环境保护的双重考虑，在现代农业生产中种植氮高效作物品种已日益重要。

硝态氮是植物的主要氮源，它既作为营养，又作为信号对植物的代谢和生长有重要的影响。土壤中根可利用的NO₃^-浓度是不稳定的,变化可达100倍(Lark等2004)。植物需要不同的硝酸盐吸收系统，以适应NO₃^-浓度的变化，从而更有效的利用土壤中的NO₃^-。植物有硝酸盐转运蛋白NRT1和NRT2两个硝酸盐转运蛋白基因家族。在拟南芥中，NRT1家族有53个基因，NRT2家族有7个基因。NRT1是低亲和性的硝酸盐转运系统(low-affinity transport system,LATS)中的组成成分，NRT2是高亲和性的硝酸盐转运系统(high-affinity transport system,HATS)中的组成成分。在AtNRT1家族的53个同源蛋白中，AtNRT1.1主要负责外部NO₃^-浓度为5mmol·L-1的NO₃^-吸收(Tsay等1993;Okamoto等2003)。AtNRT1.1是一个双亲和性的硝酸盐转运蛋白，AtNRT1.1能适应环境中硝酸盐的浓度而进行高亲和性和低亲和性的转换，由低亲和性转变为高亲和性是通过该蛋白质序列的第101位的苏氨酸(thereonine,Thr)的磷酸化进行调控(Martin等2008)。当外界硝酸盐浓度低时，Thr101磷酸化，促使AtNRT1.1具有高亲和硝酸盐吸收的活性;当外界硝酸盐浓度高时，Thr101去磷酸化，以致AtNRT1.1具有低亲和硝酸盐吸收的活性，这样的机制可导致植物能快速适应外界硝酸盐浓度的变化而改变硝酸盐的吸收方式。当生长介质中NO₃^-浓度（<1mmol·L-1)较低时，根系吸收主要依赖于高亲和吸收转运系统，高亲和NO₃^-转运体蛋白主要由NRT2家族编码，在根部特异表达，其转录受NO₃^-的诱导。AtNRT2.1在根部的表达最强，是高亲和力硝酸盐转运系统的主要成员。植物经硝酸盐转运系统吸收1个NO₃^-分子同时协同吸收2个H⁺，根系吸收的NO₃^-可暂时储藏在根细胞液泡内或随蒸腾流有木质部导管输送到地上部，也可在硝酸还原酶（NR）的作用下还原为亚硝酸根（NO₂^-），进入质体中还原为NH₄⁺，进入谷氨酰胺与天冬酰胺合成反应，进而合成植物所需的氨基酸。

玉米是重要的饲料、经济及生物能源作物，其在国际范围内的需求量与日俱增。在我国玉米生产中，氮肥的施用量过高，氮肥的生产率低下是普遍存在的现象（Ju etal.,2009,Proc Natl Acad Sci USA,106:3041-3046）。由于氮肥的大量施用，随之也带来了环境问题（张维理等，1995，植物营养与肥料学报1(2):80-87）。种植氮高效的玉米品种，是解决氮肥利用率低，降低生产成本，减小环境污染的有效途径，也是农业可持续发展和增强产品国际竞争力的基本要求，但传统选育新品种是个非常长期的过程，现如今基因工程，特别是玉米转基因技术的成熟，使得我们有可能通过基因工程的手段快速的获得氮高效品种。能否快速有效地获得转基因氮高效新品种在很大程度上取决于良好的功能基因。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供来源于玉米的一个蛋白质ZmNLP1;1及编码核酸分子的新用途，所述ZmNLP1；1是SEQ ID No.2所示的蛋白质。

本发明所提供的一种新用途是利用ZmNLP1;1的编码核酸分子培育转基因植物的方法。

该方法具体可为培育具有如下1）-4）中至少一种性状的转基因植物的方法，包括向受体植物中导入ZmNLP1;1基因的步骤：1）地上部分生物量高于所述受体植物；2）受硝酸盐诱导后，硝酸盐转运蛋白基因表达量高于所述受体植物；3）受硝酸盐诱导后，硝酸盐还原酶基因表达量高于所述受体植物；4）受硝酸盐诱导后，亚硝酸盐还原酶基因表达量高于所述受体植物；

所述ZmNLP1;1基因编码SEQ IDNo.2所示的蛋白质。

所述受硝酸盐诱导是指所述受体植物和所述转基因植物均受硝酸盐诱导。

所述硝酸盐诱导可为NO₃^-诱导。

所述地上部分生物量是指除根系以外的植株部分的生物量，所述总生物量是指整个植株（由地上部分和地下部分组成）的生物量；所述生物量以鲜重或干重表示。

其中所述ZmNLP1;1基因可先进行如下修饰，再导入受体植物中，以达到更好的表达效果：

1）根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述ZmNLP1；1基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；

2）修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

3）与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

4）与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

5）引入增强子序列，如内含子序列（例如来源于Adhl和bronzel）和病毒前导序列（例如来源于TMV,MCMV和AMV）。

本发明中所述ZmNLP1;1基因的编码序列具体为序列表中序列1的第355-3216位核苷酸。

所述ZmNLP1;1基因可通过ZmNLP1;1基因表达盒或含有所述ZmNLP1;1基因表达盒的ZmNLP1；1基因表达载体导入目的植物。

本发明中所述ZmNLP1；1基因表达盒均可含有所述ZmNLP1;1基因和启动所述ZmNLP1;1基因转录的启动子。本发明中所述ZmNLP1;1基因表达盒均指能够在宿主细胞中表达SEQ ID No.2所示的ZmNLP1;1的DNA，该DNA不但可包括启动所述ZmNLP1;1基因转录的启动子，还可包括终止所述ZmNLP1;1基因转录的终止子。进一步，所述ZmNLP1;1基因表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S;来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人（1999)Plant Physiol120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128（CN101063139B(中国专利200710099169.7)），种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子（Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子（NOS终止子）、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子（参见，例如：Odell等人（I⁹⁸⁵)Nature313:810；Rosenberg等人（1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141;Proudfoot(1991)Cell,64:671;Sanfacon等人Genes Dev.,5:141;Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人（1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。在本发明的实施例中，所述ZmNLP1;1基因表达盒中启动所述ZmNLP1;1基因转录的启动子为花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S，终止所述ZmNLP1;1基因转录的终止子为NOS。

可用现有的植物表达载体构建含有所述ZmNLP1;1基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pROKII、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb（CAMBIA公司）等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、抗生素的标记基因（如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因）或是抗化学试剂标记基因等（如抗除莠剂基因）、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。

在本发明的实施例中，所述选择标记基因为赋予对抗生素潮霉素抗性的潮霉素B磷酸转移酶（hph）基因hyg。在本发明的实施例中，所述ZmNLP1;1基因通过含有所述ZmNLP1;1基因表达盒的ZmNLP1;1基因表达载体导入目的植物。所述ZmNLP1;1基因表达载体是在pPTKan的BamHI位点插入潮霉素B磷酸转移酶（hph）基因hyg，在SpeI位点插入SEQ ID No.1的第355-3216位核苷酸所示的ZmNLP1;1编码序列得到的重组表达载体。

所述ZmNLP1;1基因表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞（Weissbach,1998，Method forPlant Molecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463;Geisersonand Corey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition)。

所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。当所述目的植物为拟南芥等双子叶植物时，所述转基因植物具有如下1）-5）中的至少一种特性：1）地上部分生物量高于所述受体植物；2）总生物量高于所述受体植物；3）硝酸盐转运蛋白基因表达量高于所述受体植物；4）硝酸盐还原酶基因表达量高于所述受体植物；5）亚硝酸盐还原酶基因表达量高于所述受体植物。

所述硝酸盐转运蛋白为AtNRT2.1，其氨基酸序列和基因序列如At1g08090（FilleurS,Daniel-Vedele F(1999)Expression analysis of a high-affinity nitrate transporter isolatedfrom Arabidopsis thaliana by differential display.Planta 207:461–469）；；；所述硝酸盐还原酶为AtNIA1，其氨基酸序列和基因序列如At1g77760（Gutierrez RA,GiffordML,Poultney C,Wang R,Shasha DE,CoruzziGM,Crawford NM(2007)Insights into thegenomic nitrate response using genetics and the Sungear Software System.J Exp Bot 58:2359-2367）；所述亚硝酸盐还原酶为AtNIR，其氨基酸序列和基因序列如At2g15620（Gutierrez RA,GiffordML,Poultney C,Wang R,Shasha DE,CoruzziGM,Crawford NM(2007)Insights into the genomic nitrate response using genetics and the Sungear SoftwareSystem.J Exp Bot 58:2359-2367）。

上述方法还包括在所述向受体植物中导入ZmNLP1;1基因后从导入所述ZmNLP1;1基因的植株中筛选表达ZmNLP1;1基因的植株得到所述转基因植物的步骤。

所述转基因植物理解为不仅包含将所述基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

本发明所提供的另一种新用途是ZmNLP1；1的应用。

本发明所提供的ZmNLP1；1的应用，为A至D中的至少一种：

A、调控受体植物地上部分生物量；

B、调控受体植物硝酸盐转运蛋白基因表达；

C、调控受体植物硝酸盐还原酶基因表达；

D、调控受体植物调控亚硝酸盐还原酶基因表达；

所述ZmNLP1;1是SEQ ID No.2所示的蛋白质。

本发明所提供的再一种新用途是与表达ZmNLP1;1的生物材料的应用。

本发明所提供的表达ZmNLP1;1的生物材料的应用为A至D中的至少一种：

A、调控受体植物地上部分生物量；

B、调控受体植物硝酸盐转运蛋白基因表达；

C、调控受体植物硝酸盐还原酶基因表达；

D、调控受体植物调控亚硝酸盐还原酶基因表达；

所述生物材料为1）或2）或3）：

1）编码ZmNLP1;1的核酸分子，所述ZmNLP1；1是SEQ ID No.2所示的蛋白质；

2）含有1）所述核酸分子的表达盒；

3）含有1）所述核酸分子的载体。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。所述核酸分子具体可为编码ZmNLP1;1的基因，所述基因的编码序列具体可为SEQ ID No.1的第355-3216位核苷酸。

上述应用中，2）所述的表达盒具体可为上述ZmNLP1;1基因表达盒，3）所述的载体具体可为上述ZmNLP1;1基因表达载体。

上述方法和上述应用中提到的所述ZmNLP1;1基因表达盒或所述ZmNLP1;1基因表达载体也属于本发明的保护范围。

导入上文所述ZmNLP1;1基因表达盒的重组微生物或导入上文所述ZmNLP1;1基因表达载体的重组微生物也属于本发明的保护范围。

其中，所述重组微生物具体可为细菌,酵母,藻和真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属（Escherichia）,欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属（Agrobacterium）、黄杆菌属（Flavobacterium）,产碱菌属（Alcaligenes）,假单胞菌属（Pseudomonas）,芽胞杆菌属（Bacillus）等。

实验证明，在以硝态氮（NO3^-）为唯一氮源的条件下，转入ZmNLP1;1基因的拟南芥与受体拟南芥相比，其地上部生物量和总生物量明显增加，硝酸盐转运蛋白基因表达量、硝酸盐还原酶基因表达量和亚硝酸盐还原酶基因表达量升高。

附图说明

图1为ZmNLP1;1基因在玉米不同组织部位的表达特性，利用荧光实时定量PCR（qPCR）分析ZmNLP1;1基因在玉米不同组织部位中的转录水平表达情况。

图中，从左至右依次为苗期玉米根部、苗期玉米地上部、授粉前新叶、授粉前老叶、授粉前穗位叶、授粉前雄穗、授粉前雌穗、授粉后15天新叶、授粉后15天老叶、授粉后15天穗位叶、授粉后15天穗轴样品。

图2为植物过表达载体pPT-Hyg的构建流程。

图3为pPT-ZmNLP1;1的构建流程。

图4为表达ZmNLP1;1基因的转基因系拟南芥植株的RT-PCR分子验证结果。

图5为在6mmol/L NO₃^-条件下进行水培培养42天收取样品时的照片。

图6为在6mmol/L NO₃^-条件下进行水培培养42天的地上部鲜重统计结果。

图7为表达ZmNLP1;1基因的转基因系硝酸盐吸收利用标志基因的表达情况。

其中，A为硝酸盐诱导后氮代谢重要关键基因硝酸盐转运蛋白基因NRT2.1的表达变化情况，B为硝酸盐诱导后氮代谢重要关键基因硝酸还原酶基因NIA1的表达变化情况，C为硝酸盐诱导后氮代谢重要关键基因亚硝酸还原酶基因NIR的表达变化情况。其中横坐标0min、30min、60min、120min为全营养液正常培养30天，缺氮5天后硝酸盐处理第0min、30min、60min、120min。

上述各图中，Col-0表示哥伦比亚生态型拟南芥；nlp7-1为拟南芥突变体nlp7-1；18-5，26-6和28-11为3个转pPT-ZmNLP1;1的纯合体株系。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的生物材料如下：

拟南芥突变体nlp7-1购自ABRC，网址是http://www.arabidopsis.org/servlets/TairObject?type=germplasm&id=4628722；大肠杆菌DH5α和根癌农杆菌GV3101（购自天根生化科技有限公司）；pGEM T-Easy克隆载体购自Promega公司；植物表达载体pPTKan和pCAMBIA1302(Sutter et al.,Selective Mobility and Sensitivity to SNAREs Is Exhibited by the ArabidopsisKAT1 K1 Channel at the Plasma Membrane，2006，Plant Cell 18:935-954)均从国外实验室免费获得，公众可从中国农业大学获得，以重复本申请实验。

2、工具酶及生化试剂

各种限制性内切酶购自Promega公司；cDNA文库构建试剂盒购自invitrogen公司；各种Taq酶和Trizol RNA小量提取试剂盒购自Takara公司；dNTP混合物购自上海生工；T4DNA连接酶购自Promega公司；氨苄青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）、壮观霉素（Spe)、利福平（Rif）购自欣经科公司。

实施例1、荧光实时定量PCR（Real-Time PCR）分析玉米ZmNLP1;1基因组织部位表达特性

选用玉米自交系B73（中国农业科学院作物所种质资源中心）。分别提取苗期玉米根部、苗期玉米地上部、授粉前新叶、授粉前老叶、授粉前穗位叶、授粉前雌穗、授粉前雄穗、授粉后15天新叶、授粉后15天老叶、授粉后15天穗位叶、授粉后15天穗轴、授粉后15天籽粒样品，提取总RNA。所得总RNA经过DNase I酶(TaKaRa公司)去除总RNA中的DNA污染后，用M-MLV反转录酶（Promega公司）和oligo d(T)₁₈反转录成cDNA第一链。利用Real-time PCR的方法，以引物P2-F和P2-R扩增玉米ZmNLP1;1基因，以P3-F和P3-R扩增玉米ZmTUB1基因作为内参对照，用同一样品中的ZmNLP1;1基因的表达量除以ZmTUB1基因的表达量作为ZmNLP1;1基因的相对表达量，研究ZmNLP1;1基因在玉米不同组织部位中表达特性。

其中，引物序列如下：P2-F:5'-ACCTGTTCGATGAAATGCCCTTAG-3'，P2-R:5'-CGATCTCTGGTATGATTGCTCGGT-3'；P3-F:5'-GCTATCCTGTGATCTGCCCTGA-3'，P3-R:5'-CGCCAAACTTAATAACCCAGTA-3'。

结果如图1所示，玉米ZmNLP1;1基因发现在玉米苗根、授粉前幼叶、授粉前老叶、授粉15天后老叶以及授粉15天后穗轴的表达量相对高。

上述的Real-Time PCR操作步骤：

1、提取不同样品中的总RNA；

2、取50μg总RNA，用DNase Ⅰ（TaKaRa公司，目录号:D2215）去除基因组DNA，方法如下：

反应体系（50μl）:

37℃反应30分钟；

加入150μl DEPC水，加入200μl苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），充分混匀；

4℃，12000rpm离心10分钟，取上层移入新的离心管中；

加入200μl氯仿/异戊醇（24：1），充分混匀；

4℃,12000rpm离心10分钟，取上层移入新的离心管中；

加20μl的3M NaAc（pH5.2），加500μl预冷无水乙醇，-20℃放置60分钟；

4℃，12000rpm离心15分钟，回收沉淀，70%预冷乙醇洗沉淀2次；每次4℃,7500rpm离心5分钟；

吹干，DEPC水重溶。

3、常规方法反转录合成cDNA第一链(方法同实施例2)。

4、Real-time PCR检测基因丰度，试剂选用TOYOBO公司的SYBR GreenRealtime PCR Master Mix（目录号91620F3），定量PCR仪器型号ABI7500，反转产物稀释10倍作为Real-time PCR模板

反应体系：

PCR反应程序：50℃2分钟，95℃10分钟，40个循环(95℃15秒，61℃15秒，72℃1分钟)；

融解曲线步骤：95℃15秒，以10秒钟一个循环，每个循环增加0.5℃的速度从60℃升温到95℃，进行70个循环；

以ZmTUB1为内参，采用相对定量算法计算ZmNLP1;1基因在玉米不同组织部位中的相对表达量。

实施例2、培育转ZmNLP1;1基因拟南芥

一、全长ZmNLP1;1基因cDNA的扩增

设计一对引物P1-F（5'-ATGGAGCAGGCGCCGCAGAC-3'）和P1-R（5'-TTACTGCATACAAACCAATCC-3'），其中P1-F恰好包含翻译起始密码子ATG，P1-R包含翻译终止密码子TAA；以玉米自交系B73根总RNA反转录的cDNA文库为模板，使用高保真Primer STAR酶扩增获得包含完整开放阅读框架的ZmNLP1;1基因片段（其核苷酸序列是序列1的自5′末端的第355位至第3216位核苷酸）。其中，反应体系如下：

PCR反应条件：98℃预变性2分钟；然后98℃10秒，65℃10秒，72℃3分钟30秒，30个循环；之后加入1μl Taq酶，72℃延伸和加尾20分钟。

取8μl PCR产物，于1.0%琼脂糖凝胶上电泳检测，回收目的条带，连接回收产物于pGEM T-Easy载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒并测序验证。测序结果表明，获得2862bp的开放读码框，比对发现这一序列与筛库得到的序列（3216bp）可以完全匹配。将含有序列表中序列1的第355-3216位核苷酸所示的ZmNLP1;1基因的重组载体命名为pGEM-ZmNLP1;1。ZmNLP1;1的cDNA基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示，其编码序列是序列表中序列1的第355-3216位核苷酸，其编码氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示的蛋白质ZmNLP1;1。

二、拟南芥表达载体的构建

1、植物过表达载体pPT-Hyg的构建

如图2所示,利用引物Hyg_F（5’-ACAGGATCCATGAAAAAGCCTGAACTCACC-3’）和Hyg_R：5’-ACAGGATCCCTATTCCTTTGCCCTCGGACG-3’），用Pfu高保真酶（Promega公司），以pCAMBIA1302载体(Sutter et al.,Selective Mobility and Sensitivityto SNAREs Is Exhibited by the Arabidopsis KAT1 K1 Channel at the Plasma Membrane,2006,Plant Cell 18:935-954)为模板扩增潮霉素抗性基因Hygromycin Bphosphotransferase的ORF序列，PCR反应条件：94℃预变性4分钟；然后94℃30秒，58℃30秒，72℃2分钟，25个循环。由于在引物Hyg_F和Hyg_R中加入了BamHI酶切位点，PCR扩增产物经BamHI酶切后，连入同样经BamHI酶切后的植物表达载体pPTKan(Sutter et al.,Selective Mobility and Sensitivity to SNAREs Is Exhibited bythe Arabidopsis KAT1 K1Channel at the Plasma Membrane,2006,Plant Cell 18:935-954)，经酶切和测序鉴定挑取Hygromycin抗性基因以正确方向连入的克隆，构建成含潮霉素抗性筛选标记的植物过表达载体pPT-Hyg。

2、玉米ZmNLP1；1基因植物过表达载体（pPT-ZmNLP1；1）的构建

用加酶切位点Spe Ⅰ的引物P1-Fs GGACTAGTATGGAGCAGGCGCCGCAGAC和P1-Rs GGACTAGTTTACTGCATACAAACCAATCC从pGEM-ZmNLP1;1中扩增ZmNLP1;1基因，回收目的片段，浓缩至10μl，并用Spe Ⅰ酶切，跑电泳回收，并浓缩为10μl；同时进行载体pPT-Hyg的Spe Ⅰ酶切，并且进行回收，然后进行载体的去磷酸化，具体操作为在一新离心管中加入：

PCR仪中进行以下程序：

取上步得到的磷酸化产物，加入100μl的Tris饱和酚和100μl三氯甲烷，混合摇匀；12000转离心10min。吸取上清与另一管中，加同体积的三氯甲烷，混合摇匀；12000转离心10min；吸取上清与另一管中，加1/10体积的3M醋酸铵，3倍体积的无水冷乙醇，混匀，-80℃沉淀1小时，4℃,12000转，离心10min，弃去上清，加700μl的70%乙醇洗一次，10μl水溶解。

取酶切后的目的片段和去磷酸化后的载体片段进行连接反应，反应体系（10μl）如下：

16℃连接16-20小时后，转入50μl DH5α感受态细胞中，涂布在含氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养12小时，收集所有菌体混匀，提取质粒DNA经酶切及测序验证，将在pPT-Hyg的Spe Ⅰ位点插入序列表中序列1的第355-3216位核苷酸所示的ZmNLP1;1基因的重组载体命名为pPT-ZmNLP1;1（图4），其携带有潮霉素抗性的筛选标记基因。

三、表达ZmNLP1；1基因的转基因拟南芥的培育及其表型鉴定

1、ZmNLP1;1基因转化拟南芥nlp7-1突变植株

A、重组表达载体pPT-ZmNLP1；1转化农杆菌感受态细胞

取200μl根癌农杆菌GV3101感受态细胞，加入1μgpPT-ZmNLP1;1质粒DNA，液氮中速冻1分钟，37℃水浴5分钟，再迅速冰浴2min（不能摇动），然后加入1ml YEB培养基，28℃慢速振荡培养4小时；1000rpm离心30秒，弃上清，重悬于0.1ml YEB培养基中，涂布于含有100μg/ml潮霉素和125μg/ml利福平的YEB平板上，28℃培养48小时。

B、转化农杆菌阳性克隆的PCR鉴定

挑取平板上长出的单菌落，接种于YEB液体培养液中（含50mg/l壮观霉素和125μg/ml利福平），28℃培养过夜。以菌液为模板用上述引物P1-Fs和P1-Rs进行PCR扩增鉴定。

C、拟南芥的转化

用重组表达载体pPT-ZmNLP 1;1转化拟南芥突变体nlp7-1。具体方法：取已经鉴定为阳性的农杆菌菌液0.5ml接种于500ml YEB液体培养基中，于28℃振荡培养至OD600到0.5。5000rpm 4℃离心15分钟收集菌体。用200ml的渗入缓冲液（1×MS大量元素，5%蔗糖）重悬菌体，加silwet L-77（GE公司，货号：S5505）至终浓度0.2‰。其中，1×MS大量元素含有1.65g/L NH₄NO₃,1.9g/L KNO₃，0.44g CaCl₂.2H₂O,0.37g/LMgSO₄.7H₂O和0.17g/L KH₂PO₄。将抽苔后刚刚开花的拟南芥的花浸于重悬液中侵染2min。用保鲜袋包裹植株，避光16℃下放置24小时，然后正常生长。

D、转基因阳性植株的筛选

由于转入pPT-ZmNLP1;1载体的拟南芥植株具有潮霉素抗性，所以在含有潮霉素的MS固体培养基上可以正常生长，而未转入基因的受体种子不能正常生长并死亡。转化当代转基因植株为T0代，由该T0代植株自交产生的种子及由它所长成的植株为T1代。混合收集T1代种子，播种于含50μg/ml潮霉素的MS固体培养基上，筛选能正常生长的植株移栽于盆内继续生长，单株收种。T2代种子再经过1次潮霉素抗性筛选后单株收获T3代种子。同样再经过一次抗性筛选，所有个体都能生长的为转pPT-ZmNLP1;1的纯合体植株，留下备用。

E、转基因拟南芥的分子检测

PCR检测：分别提取T3代转pPT-ZmNLP1；1基因拟南芥纯合植株的总RNA，在oligo(dT)引导下反转录成第一链cDNA，以上述P1-F和P1-R为引物进行PCR检测在转基因拟南芥中ZmNLP1；1基因的表达水平。结果如图4所示，最左侧为野生型（Col-0，哥伦比亚生态型拟南芥）；左边第二个为拟南芥突变体nlp7-1（转基因受体）；18-5，26-6和28-11为3个转pPT-ZmNLP1;1的纯合体株系。检测结果表明哥伦比亚生态型拟南芥和拟南芥突变体nlp7-1没有ZmNLP1;1基因的表达；18-5和26-6这两个转pPT-ZmNLP1；1株系中有ZmNLP1;1基因的表达，28-11这个转pPT-ZmNLP1;1株系检测不到ZmNLP1；1基因的表达。

2、表达ZmNLP1;1基因的拟南芥的表型鉴定

将哥伦比亚生态型拟南芥、拟南芥突变体nlp7-1、3个转pPT-ZmNLP1;1的纯合体株系18-5，26-6和28-11的种子分别在6mmol/L NO₃^-条件下进行水培培养42天，观察表型差异，并测定地上部生物量（鲜重）。其中，地上部分生物量是指除根系以外的植株部分的生物量，总生物量是指整个植株（由地上部分和地下部分组成）的生物量；该生物量以鲜重。

该实验中水培拟南芥用Hoagland营养液（成分K₂SO₄0.25mM,MgSO₄.7H₂O 1mM,KH₂PO₄1mM,CaCl₂.2H₂O 0.25mM,KNO₃6mM,H₃BO₃30μM,MnSO₄.H₂O 5μM,ZnSO₄.7H₂O 1μM,CuSO₄.5H₂O 1μM,Na₂MoO₄.2H₂O 1μM,NaFe-EDTA 0.1mM pH为5.8-6.0）培养。每3天换一次营养液。

结果如图5和6所示，在硝态氮（NO₃^-）为唯一氮源的条件下，表达ZmNLP1;1基因的株系18-5和26-6的长势和地上部生物量均显著高于拟南芥突变体nlp7-1（转基因受体），不表达ZmNLP1;1基因的株系28-11的长势和地上部生物量与拟南芥突变体nlp7-1均无显著差异。图6中，各个株系是两株植株的统计数据，用双尾T-test（成对）分析差异显著性，P≤0.05被认为差异显著，字母不同的株系间具有显著差异，具有相同字母的株系间无显著差异。

3、表达ZmNLP1;1基因的拟南芥中硝酸盐吸收利用标志基因的表达情况

将哥伦比亚生态型拟南芥、拟南芥突变体nlp7-1、3个转pPT-ZmNLP1;1的纯合体株系18-5，26-6和28-11的种子分别在全营养液（溶质为K₂SO₄0.25mM,MgSO₄.7H₂O1mM,KH₂PO₄1mM,CaCl₂.2H₂O 0.25mM,KNO₃6mM,H₃BO₃30μM,MnSO₄.H₂O 5μM,ZnSO₄.7H₂O 1μM,CuSO₄.5H₂O 1μM,Na₂MoO₄.2H₂O 1μM,NaFe-EDTA 0.1mM，溶剂为蒸馏水，pH为5.8-6.0）中进行水培培养30天，然后转入不含氮源的培养液（溶质为K₂SO₄0.25mM,MgSO₄.7H₂O 1mM,KH₂PO₄1mM,CaCl₂.2H₂O 0.25mM,H₃BO₃30μM,MnSO₄.H₂O 5μM,ZnSO₄.7H₂O 1μM,CuSO₄.5H₂O 1μM,Na₂MoO₄.2H₂O 1μM,NaFe-EDTA 0.1mM，溶剂为蒸馏水，pH为5.8-6.0））中培养5天，再转入Hoagland营养液（溶质为K₂SO₄0.25mM,MgSO₄.7H₂O 1mM,KH₂PO₄1mM,CaCl₂.2H₂O 0.25mM,KNO₃6mM,H₃BO₃30μM,MnSO₄.H₂O 5μM,ZnSO₄.7H₂O 1μM,CuSO₄.5H₂O 1μM,Na₂MoO₄.2H₂O 1μM,NaFe-EDTA 0.1mM，溶剂为蒸馏水，pH为5.8-6.0）培养0min、30min、60min、120min取样通过Real-Time PCR测定硝酸盐转运蛋白AtNRT2.1基因、硝酸盐还原酶AtNIA1基因和亚硝酸盐还原酶AtNIR基因表达。其中，所述硝酸盐转运蛋白为AtNRT2.1，其氨基酸序列和基因序列如At1g08090（Filleur S,Daniel-Vedele F(1999)Expression analysis of a high-affinity nitrate transporter isolated from Arabidopsisthaliana by differential display.Planta 207:461-469）；；；所述硝酸盐还原酶为AtNIA1，其氨基酸序列和基因序列如At1g77760（Gutierrez RA,GiffordML,Poultney C,Wang R,Shasha DE,CoruzziGM,Crawford NM(2007)Insights into the genomic nitrate responseusing genetics and the Sungear Software System.J Exp Bot 58:2359-2367）；所述亚硝酸盐还原酶为AtNIR，其氨基酸序列和基因序列如At2g15620（Gutierrez RA,GiffordML,Poultney C,Wang R,Shasha DE,CoruzziGM,Crawford NM(2007)Insights into thegenomic nitrate response using genetics and the Sungear Software System.J Exp Bot 58:2359-2367）。

其中，上述的Real-Time PCR操作步骤：

1、提取不同样品中的总RNA；

2、取50μg总RNA，用DNase Ⅰ（TaKaRa公司，目录号:D2215）去除基因组DNA，方法如下：

反应体系（50μl）:

37℃反应30分钟；

加入150μl DEPC水，加入200μl苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），充分混匀；

4℃，12000rpm离心10分钟，取上层移入新的离心管中；

加入200μl氯仿/异戊醇（24：1），充分混匀；

4℃,12000rpm离心10分钟，取上层移入新的离心管中；

加20μl的3M NaAc（pH5.2），加500μl预冷无水乙醇，-20℃放置60分钟；

4℃，12000rpm离心15分钟，回收沉淀，70%预冷乙醇洗沉淀2次；每次4℃,7500rpm离心5分钟；

吹干，DEPC水重溶。

3、常规方法反转录合成cDNA第一链。

4、Real-time PCR检测基因丰度，试剂选用TOYOBO公司的SYBR GreenRealtime PCR Master Mix（目录号91620F3），定量PCR仪器型号ABI7500，反转产物稀释10倍作为Real-time PCR模板

反应体系：

PCR反应程序：50℃2分钟，95℃10分钟，40个循环(95℃15秒，61℃15秒，72℃1分钟)；

融解曲线步骤：95℃15秒，以10秒钟一个循环，每个循环增加0.5℃的速度从60℃升温到95℃，进行70个循环；

以AtActin为内参，采用相对定量算法计算硝酸盐转运蛋白AtNRT2.1基因、硝酸盐还原酶AtNIA1基因和亚硝酸盐还原酶AtNIR基因表达基因在玉米不同组织部位中的相对表达量。

AtActin的引物为P4-F和P4-R；硝酸盐转运蛋白AtNRT2.1基因的引物为P5-F和P5-R；硝酸盐还原酶At NI A1基因的引物为P6-F和P6-R；亚硝酸盐还原酶At NIR基因的引物为P7-F和P7-R。这些引物的序列如下：

P4-F:5'-GACCAGCTCTTCCATCGAGAA-3'P4-R:5'-

CAAACGAGGGCTGGAACAAG-3'

P5-F:5'-AGTCGCTTGCACGTTACCTG-3'P5-R:5'-ACCCTCTGACTTGGCGTTCTC-3'

P6-F:5'-CCACTAGGGCACATCGAGTAC-3'P6-R:5'-

CCTTATGCTTACTAGCCCATCC-3'

P7-F:5'-CCGGTAGCCAGTTCTGCG-3'P7-R:5'-CCTATTCGTCCCCCGACGT-3'

结果表明在硝态氮为唯一氮源的条件下（受硝酸盐诱导后），表达ZmNLP1;1基因的株系的硝酸盐转运蛋白AtNRT2.1基因，硝酸盐还原酶AtNIA1基因和亚硝酸盐还原酶AtNIR基因的表达量均比转基因受体拟南芥突变体nlp7-1的表达量高。图7中，用双尾T-test（成对）分析差异显著性，P≤0.05被认为差异显著，字母不同的株系间具有显著差异，具有相同字母的株系间无显著差异。