用于毒性检测生物传感器的生物膜的制备方法及其应用

摘要

本发明涉及一种用于毒性检测生物传感器的生物膜的制备方法，包括以下步骤：取活性污泥在培养基上接种，得到菌液；将聚乙烯醇和海藻酸钠加入到蒸馏水中，水浴加热，随后冷却至常温，得到聚乙烯醇凝胶；将菌液离心后,倒掉上清液，取得到的沉淀物与聚乙烯醇凝胶混合，再利用表面皿将混合物均匀涂成膜状；将膜状混合物进行干燥，使其成膜后，将膜放入预先配制好的交联固化溶液中，交联固化后，取出固化完成的膜，即得到用于毒性检测生物传感器的生物膜。本发明的制备方法，步骤简单方便，原料价格低廉，来源可靠无污染，低成本绿色环保，而且制得的生物膜具有较高是生化活性，可以用于水中生物毒性物质的快速定性及定量检测评估。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物膜的制备方法及其应用，尤其涉及一种用于毒性检测生物传感器的生物膜的制备方法及其应用，属于生物传感器领域。

背景技术

污水处理工艺中，生物反应单元是其核心；其中活性污泥中的微生物极易受到污废水中各种有毒有害物质的抑制，使得菌种活性降低，导致处理水不达标。严重时微生物的活性完全丧失，致使生物处理这一环节完全无法发挥作用，从而导致污水处理流程的整个瘫痪，因此对污废水进行毒性检测是必不可少的一步。

微生物传感器利用特定的微生物细胞作为传感器元素，能够快速、实时地对毒性物质做出反应，并且具有成本低，制备方法简单，操作简便，携带方便，灵敏度高，专一性强，可重复利用等优点。因此生物传感器已经越来越受到人们的重视。

生物传感器的核心部件是固定了微生物的生物膜，微生物的固定方法有很多，总体可分为共价法、结合法、交联法、吸附法和包埋法。其中，以包埋法应用最广。包埋法是利用一定的载体材料包埋固定微生物，制成膜状、小球。常用的包埋剂有天然材料如海藻酸钠(SA)、琼脂和人工合成聚合物如聚丙烯酰胺、聚氨基甲酰磺酸盐(PCS)、聚乙烯醇(PVA)，其中PVA和SA因其具有价格低廉，对微生物无毒的优点而受到广泛的欢迎。

包埋法中，利用PVA包埋固定菌，如果不利用交联剂进行固化，制成的膜和小球易产生溶胀，机械性能非常差，可利用性低。常用的交联剂有H₃BO₃、NaNO₃、CaCl₂、戊二醛，膜的使用大多是直接涂到电极上或者借助于多孔性膜(如聚碳酸酯膜等)包裹到电极，制成生物传感器。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于毒性检测生物传感器的生物膜的制备方法及其应用，解决了现有技术中的不足，可以得到不会溶胀、机械性能好、可利用性高的生物膜。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种用于毒性检测生物传感器的生物膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）取污水处理厂的活性污泥在培养基上接种，采用更代培养、连续曝气的方式进行培养，得到菌液；

（2）将聚乙烯醇和海藻酸钠加入到蒸馏水中，其中聚乙烯醇的质量浓度为8～15g/L，海藻酸钠的质量浓度为2～4g/L，水浴加热（40～100℃）0.5h，在电动搅拌机的搅拌下，使其完全溶解，随后冷却至常温，得到聚乙烯醇凝胶；

（3）将步骤（1）得到的菌液，经高速冷冻离心机在7000rpm/min下离心10min后,倒掉上清液，取得到的沉淀物与步骤（2）得到的聚乙烯醇凝胶以重量比1:4混合，再利用表面皿将混合物均匀涂成膜状；

（4）在20～25℃条件下，将步骤（3）得到的膜状混合物干燥0.5～2h，使其成膜后，将膜放入预先配制好的交联固化溶液中，交联固化1～2h，取出固化完成的膜，即得到用于毒性检测生物传感器的生物膜。

本发明中，制备生物膜的最佳条件为聚乙烯醇质量浓度为13%，海藻酸钠的质量浓度为浓度3%，干燥的时间为2h,干燥的温度为20～25℃，交联固化的时间为1h。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述步骤（1）中活性污泥的悬浮固体量为10248mg/L。

进一步，所述步骤（1）培养基的成分的组成为：葡萄糖：1000mg/L，NH₄CO₃：538.6mg/L，K₂HPO₄：17.86mg/L，MgCl₂·6H₂O：14.29mg/L，MnSO₄·4H₂O：2.143mg/L，CuSO₄·5H₂O：0.7143mg/L，CaCl₂·6H₂O：0.01786mg/L，FeSO₄·7H₂O：3.571mg/L。

进一步，所述培养基氨氮浓度为95mgN/L。

进一步，所述步骤（4）中交联固化溶液为H₃BO₃和CaCl₂的混合溶液，其中，H₃BO₃的质量浓度为4g/L，CaCl₂的质量浓度为1g/L。

本发明解决上述技术问题的另一技术方案如下：一种用于毒性检测生物传感器的生物膜在制作用于毒性检测的生物传感器上的应用。还有一种采用所述用于毒性检测生物传感器的生物膜制作出的用于毒性检测的生物传感器，及其制备方法。

所述制备方法的具体步骤为：将用于毒性检测生物传感器的生物膜紧贴于溶解氧电极的聚四氟乙烯膜上，并用固定套固定，组装成生物传感器。

本发明的有益效果是：本发明的制备方法，步骤简单方便，原料价格低廉，来源可靠无污染，低成本绿色环保，而且制得的生物膜不会溶胀、机械性能好、可利用性高，具有较高是生化活性。利用本发明的生物膜制备生物传感器能够快速、实时地对毒性物质做出反应，并且具有携带方便、灵敏度高、专一性强、可重复利用等优点，可以用于水中生物毒性物质的快速定性及定量检测评估。

附图说明

图1为本发明制得的生物传感器灵敏度测试的结果图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

菌种的富集培养采取更代培养，连续曝气的方式进行。取2L的锥形瓶加入700mL的培养基，用300mlρ(ss)为10248mg/L的活性污泥(取自烟台辛安河污水处理厂A2O工艺回流污泥）进行接种，其中，培养基的成分的组成为：葡萄糖：1000mg/L，NH₄CO₃：538.6mg/L，K₂HPO₄：17.86mg/L，MgCl₂·6H₂O：14.29mg/L，MnSO₄·4H₂O：2.143mg/L，CuSO₄·5H₂O：0.7143mg/L，CaCl₂·6H₂O：0.01786mg/L，FeSO₄·7H₂O：3.571mg/L。C源和N源分别由葡萄糖和碳酸氢铵提供。为保证在驯化富集后的菌中有较高比例的硝化细菌，培养液的氨氮浓度设定为95mgN/L。每3天更换一次培养基以保证最适的pH及充足的营养物质。经过7周更代培养后将富集的混合菌接种在固体培养基（牛肉蛋白胨）上以筛选优势菌。筛选出的优势菌分装于10个250mL的锥形瓶内，放置于恒温振荡培养箱内（28℃）振荡（150rpm/min）培养待用。

原接种活性污泥中细菌数量繁多，且细菌以菌胶团的形式存在，并存有大量的丝状菌。经过连续更代与富集培养后，丝状菌及杂质几乎不存在，细菌数量有所减少，在培养液中呈分散状态，有球形、椭圆和杆状。

将聚乙烯醇（PVA）和海藻酸钠（SA）加入到蒸馏水中，水浴加热，在电动搅拌机的搅拌下，使其完全溶解，随后冷却至常温，得到聚乙烯醇凝胶；将菌液经高速冷冻离心机在7000rpm/min下离心10min后,倒掉上清液，取得到的沉淀物与聚乙烯醇凝胶以重量比1:4混合，再利用表面皿将混合物均匀涂成膜状；将膜状混合物进行干燥，使其成膜后，将膜放入预先配制好的交联固化溶液中，交联固化后，取出固化完成的膜，即得到用于毒性检测生物传感器的生物膜。具体成分含量、反应条件、得到的结果见表1。

随着PVA浓度的增大，所得凝胶的粘稠度也随之增大，同时成膜性变差，且所得膜的厚度大。随着SA浓度的增加，成膜后，膜较易发生再次溶解的现象。本发明选取CaCl₂和H₃BO₃配成含H₃BO₄4%的饱和的交联固化剂溶液，因CaCl₂浓度越高得到的膜的机械强度越低，本发明选取1%CaCl₂，又H₃BO₃浓度越高对微生物的活性影响越大，所以本实验选取4%饱和H₃BO₃溶液。

所以本发明得到的最佳固定化膜制备条件为：PVA质量浓度13%，SA质量浓度3%，H₃BO₃质量浓度4%，CaCl₂质量浓度1%，干燥时间2h，交联时间1h,温度20～25℃。

将在最佳条件下制备的生物膜紧贴于雷磁DO-958型溶解氧电极的聚四氟乙烯膜上，并用固定套固定，组装成生物传感器。对生物传感器的灵敏度进行测试，结果如图1所示。

将没有安装生物膜的氧电极放入水中后，DO值迅速下降后稳定在4.3mgO₂/L。此值为水中溶解氧值。在1000秒时取出氧电极，并在其电极表面安装活性生物膜后，DO值出现一个峰值，接近饱和。这是由于在安装生物膜时，电极脱离水面接触到空气，造成所测DO值迅速上升。将组装生物膜后的电极重新放入水中，溶解氧值迅速下降至之前的4.3mg O₂/L，并继续下降至1.28mg O₂/L左右。此时的下降是由于所装生物膜自身携带了少量COD和氨氮（生物膜在培养基中保存），因为生物膜内菌的生化氧化，导致DO电极所测溶解氧浓度下降。在2800秒加入富含COD和氨氮的培养基，因为碳源和氮源的加入，使生物膜的内菌的生化氧化速度加快，导致DO电极表面所测DO值迅速下降直至到0mg O₂/L，在3500秒，向水中加入纯苯胺1mL，DO值经历0.5mg O₂/L的上升后重新下降为0。DO值的上升是由于苯胺对传感器生物膜中生物菌的毒性影响，导致生物呼吸速率停止。随后的重新下降可理解为生物膜对毒性的适应，活性恢复。在4000秒加入呼吸性毒物（硫脲），生物膜内细菌活性受到抑制，生化氧化部分停止，溶解氧不再被生物膜所消耗，传感器电极检测到的溶解氧值开始上升并稳定在2.7mg O₂/L。溶解氧浓度上升幅度与投入的毒性物质的量及浓度正相关。由此可见，采用本发明制备的生物膜组装的生物传感器，其生物毒性相应可达2.7mg O₂/L，表明制备的生物膜具有较高是生化活性，可以用于水中生物毒性物质的快速定性及定量检测评估。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。