三维网络结构的纳米碳纤维复合β-磷酸钙的制备方法

摘要

本发明公开了一种具有三维网络结构的纳米碳纤维复合β-磷酸钙的制备方法。涉及一种生物材料制备技术。包括：将细菌纤维素纯化处理并放入硝酸钙溶液中搅拌，缓慢加入磷酸氢二铵溶液并控制体系pH值，反应完毕后陈化12～24h，冷冻干燥，然后将干燥后的材料放入气氛炉加热，冷却后得到一种具有三维网络结构的碳纤维上均匀分布β-磷酸钙的复合材料。本发明制备工艺简单易行、操作方便，得到由β-磷酸钙功能化的纳米碳纤维且具有良好的空间三维网络结构、生物相容性好，有一定的生物活性和骨传导性，生物力学性能良好，可作为骨组织修复材料应用于生物医用领域。

说明书

技术领域

本发明涉生物材料领域，特别是指一种具有三维网络结构的纳米碳纤维复合β-磷酸钙的制备方法。 

背景技术

碳纤维是有机纤维经碳化处理后而得到的碳素纤维，具有超高的拉伸强度和拉伸模量，稳定的化学性能，高水平的耐腐蚀性，此外，碳纤维还具有无蠕变、耐疲劳性好、比热及导电性介于非金属和金属之间、热膨胀系数小、X射线透过性好等特点。随着科技的发展，碳纤维的应用领域与日俱增，它们除了广泛应用于航空航天等高技术领域，还可用在文体用品、纺织机械、医疗器械、生物工程、建筑材料、化工机械、运输车辆等方面。 

纳米碳纤维是指具有纳米尺度的碳纤维，在碳纤维的诸多性能基础上增加了纳米效应，使得纳米碳纤维具有高强轻质、导热性良好、高导电性等特性，能够有望应用于高容量电极材料，高性能复合材料，生物医用材料等高性能产品。特别是，纳米碳纤维良好的力学性能、化学稳定性，高比表面积使其能够与具有亲水性基团的生物材料相结合并应用于生物医用领域。研究表明，纳米碳纤维能够促进成骨细胞生长，同时降低成纤维细胞的黏附，为了增强纳米碳纤维与骨组织的相容性，减少植入材料因运动对骨组织周围的损伤，将生物活性材料与纳米碳纤维复合是一种非常有效的方法。 

β-磷酸钙（β-TCP）类似于人骨的天然无机构成，具有优于其他无机材料的生物相容性，植入后与机体骨接合良好，骨传导性好，β-磷酸钙在体内能够逐步降解，且降解产生的钙、磷离子能够被人体吸收，有助于新骨的形成。因此，β-磷酸钙是一种理想的骨组织修复材料，目前骨组织的修复材料已有二维构建发展到三维立体构建，将β-磷酸钙制备成三维支架材料有助于骨细胞的生长、扩增并模拟体内组织细胞的生长微环境，并有利于营养成分的传输。但β-磷酸钙的制备主要以粉末状为主，加工成型后生物力学强度不佳，脆性较大，不易成形，很难用于骨组织负荷部位的修复。 

综上所述，将β-磷酸钙与纳米碳纤维复合制备成具有三维网络结构的复合材料能够有效提高纳米碳纤维的生物相容性、生物活性，并且增强β-磷酸钙的力学性能，有望成为一种理想的骨组织修复材料。目前制备纳米碳纤维的主要方法有气相成长法、聚合物混掺熔融纺丝法和静电纺丝法。这些方法制备纳米纤维往往需要的非常复杂的设备，设定繁琐的制备参数，并且制备的纳米纤维仅有一维或两维结构，无法形成复杂的具有三维网络的纳米纤维。细菌纤维素是一种天然的生物高聚物，具有超精细网状结构，由直径3～4纳米的微纤组合成40～60纳米粗的纤维束，并相互交织形成发达的超精细网络结构。细菌纤维素的高纯度、高结晶度、高聚合度及分子高度取向的特性，使其具有成为纳米碳纤维前驱体的基本条件。 

本专利采用液相沉淀法利用细菌纤维素三维网络制备纳米磷酸三钙粉体，经特殊处理的细菌纤维素作为纳米碳纤维的前驱体，经高温加热处理，最终得到具有三维网络结构的碳纤维上均匀分布β-磷酸钙的复合材料。提高了纳米碳纤维的生物相容性、生物活性，并且增强β-磷酸钙的力学性能。本发明制备工艺简单易行、操作方便，得到由β-磷酸钙功能化的纳米碳纤维，且具有良好的空间三维网络结构、生物相容性好，有一定的生物活性和骨传导性，生物力学性能良好可作为骨组织修复材料应用于生物医用领域。 

发明内容

本发明的目的是提供一种具有三维网络结构的纳米碳纤维复合β-磷酸钙的制备方法。涉及一种生物材料制备技术。本发明制备工艺简单易行、操作方便，得到由β-磷酸钙功能化的纳米碳纤维材料且具有良好的空间三维网络结构，提高了纳米碳纤维的生物相容性、生物活性，并且增强了β-磷酸钙的力学性能，能够作为一种具有骨传导性的高强骨组织修复材料应用于生物医用领域。 

本发明公开了一种具有三维网络结构的纳米碳纤维复合β-磷酸钙的制备方法，包括：将细菌纤维素纯化处理并放入硝酸钙溶液中搅拌，缓慢加入磷酸氢二铵溶液并控制体系pH值，反应完毕后陈化12～24h，冷冻干燥，然后将干燥后的材料放入气氛炉加热，冷却后得到一种具有三维网络结构的碳纤维上均匀负载β-磷酸钙的复合材料。 

作为优选的技术方案： 

其中，如上所述的一种具有三维网络结构的纳米碳纤维复合β-磷酸钙的制备方法，所述的纯化处理是指，细菌纤维素经5～10wt%的氢氧化钠水溶液高温蒸煮0.5～1h，并用去离子水清洗至中性。经细菌发酵的细菌纤维素原材料中有大量的细菌残留体，这些残留物将材料在加热（碳化、石墨化）过程中形成局部缺陷，严重影响得到的纳米碳纤维的力学性能以及三维网络结构。氢氧化钠溶液蒸煮能够彻底去除菌体蛋白和粘附在纤维素膜上的残余培养基，保证细菌纤维素材料的纤维素高纯度。同时氢氧化钠溶液处理能够有效激活细菌纤维素纳米纤维上大量的羟基基团，有助于磷酸三钙粉体液相制备时钙离子在细菌纤维素纳米纤维上均匀沉积。

如上所述的一种具有三维网络结构的纳米碳纤维复合β-磷酸钙的制备方法，所述的硝酸钙溶液是指0.6～1mol/L的硝酸钙水溶液，所述的磷酸氢二铵溶液是指0.4～0.6mol/L的磷酸氢二铵水溶液，且体系中钙离子与磷酸根离子的投料比为1：1.5。硝酸钙与磷酸氢二铵反应可生成絮凝状非晶态磷酸三钙沉淀，在反应过程中钙离子首先与细菌纤维素纳米纤维上的羟基发生相互作用，通过静电力均匀分布在纳米纤维上；然后逐渐与磷酸氢二铵反应在纳米纤维网络的模板作用下生成纳米非晶态磷酸三钙颗粒。 

如上所述的一种具有三维网络结构的纳米碳纤维复合β-磷酸钙的制备方法，所述的缓慢加入是指磷酸氢二铵溶液以1～5ml/min的速率滴加，所述的控制体系pH值是指用氨水控制整个反应过程中体系的pH值为9.7～10.3。 

如上所述的一种具有三维网络结构的纳米碳纤维复合β-磷酸钙的制备方法，所述的冷冻干燥是指将纯化处理后的细菌纤维素在-20℃～-80℃下冷冻12～24h，然后真空干燥24～48h。冷冻干燥目的在于维持细菌纤维素湿态时的三维网络微观结构。 

如上所述的一种具有三维网络结构的纳米碳纤维复合β-磷酸钙的制备方法，所述的加热是材料在真空、氩气或氮气保护下，由室温升温至850℃～1100℃，其中100～300℃区间升温速率为1～3℃/min，300～500℃区间升温速率为3～5℃/min，500～800℃区间升温速率为5～7℃/min，800℃～1100℃区间升温速率为10℃/min，并保温1～2h。本专利中将升温区间分为四段控制，100～300℃区间主要为细菌纤维素失去物理吸附水、氢键结合水、以及分子间氢键、分子内氢键断裂分解；同时对沉淀在细菌纤维素纳米纤维表面的非晶态磷酸三钙颗粒高温煅烧处理，使磷酸三钙颗粒由非晶态向晶态转变。300～500℃区间主要为细菌纤维素碳链断裂分解，并生成少量挥发气体。这两个升温区间是材料碳化过程的关键，细菌纤维素碳化过程中质量会大幅度降低，并且体积会随着收缩。在这期间为了维持细菌纤维素原有的三维网络结构，必须严格控制碳化过程的升温速率，防止升温速率过快造成网络结构塌陷。500～800℃区间细菌纤维素碳化完成；磷酸三钙开始由磷灰石向β-磷酸钙转变。800℃～1100℃区间，碳化后的细菌纤维素纤维进行石墨化；磷酸三钙完全相变为β-磷酸钙，并且经过保温使晶格结构趋于完整。 

如上所述的一种具有三维网络结构的纳米碳纤维复合β-磷酸钙的制备方法，所述的冷却是指升温结束后的材料在气氛炉中缓慢冷却至室温。 

如上所述的一种具有三维网络结构的纳米碳纤维复合β-磷酸钙的制备方法，所述的复合材料是指具有三维网络空间结构的纳米碳纤维直径约为10～30nm，纤维上均匀分布有β-磷酸钙晶体。 

本发明的另一个目的是提供一种具有三维网络结构的纳米碳纤维复合β-磷酸钙，其特征是：包含细菌纤维素和β-磷酸钙。 

与现有技术相比，本发明的有益效果是： 

本专利采用液相沉淀法利用细菌纤维素三维网络制备纳米磷酸三钙粉体，经特殊处理的细菌纤维素作为纳米碳纤维的前驱体，经高温加热处理，最终得到具有三维网络结构的碳纤维上均匀分布β-磷酸钙的复合材料。在制备过程中最大限度的保持了细菌纤维素原有的三维网络空间结构，纤维碳化处理、石墨化处理与磷酸钙煅烧同时进行；通过合理的温度控制快速、高效制备出晶相可控的β-磷酸钙/纳米碳纤维复合材料。提高了纳米碳纤维的生物相容性、生物活性，并且增强了β-磷酸钙的力学性能。本发明制备工艺简单易行、操作方便，得到由β-磷酸钙功能化的纳米碳纤维且具有良好的空间三维网络结构、生物相容性好，有一定的生物活性和骨传导性，生物力学性能良好，可作为骨组织修复材料应用于生物医用领域。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 

实施例1： 

将细菌纤维素置于10wt%的氢氧化钠水溶液高温蒸煮1h，并用去离子水清洗至中性。纯化处理后的材料放入0.6mol/L的硝酸钙水溶液中搅拌，以5ml/min的速率缓慢滴加入0.4mol/L磷酸氢二铵水溶液并用氨水控制整个反应过程中体系的pH值为10.3，钙离子与磷酸根离子的投料比为1：1.5。反应完毕后陈化24h。

反应后的材料在-80℃下冷冻24h，然后真空干燥24h。然后将材料放入气氛炉中在氮气保护下由室温升温加热至850℃，其中100～300℃区间升温速率为1℃/min，300～500℃区间升温速率为3℃/min，500～800℃区间升温速率为5℃/min，800℃～850℃区间升温速率为10℃/min，并保温2h。升温结束后材料在气氛炉中缓慢冷却至室温得到具有三维网络空间结构的纳米碳纤维直径约为10nm，纤维上均匀分布有β-磷酸钙晶体。 

  

实施例2：

将细菌纤维素置于5wt%的氢氧化钠水溶液高温蒸煮1h，并用去离子水清洗至中性。纯化处理后的材料放入0.75mol/L的硝酸钙水溶液中搅拌，以2ml/min的速率缓慢滴加入0.5mol/L磷酸氢二铵水溶液并用氨水控制整个反应过程中体系的pH值为10.0，钙离子与磷酸根离子的投料比为1：1.5。反应完毕后陈化18h。

反应后的材料在-20℃下冷冻24h，然后真空干燥24h。然后将材料放入气氛炉中在真空下由室温升温加热至900℃，其中100～300℃区间升温速率为2℃/min，300～500℃区间升温速率为4℃/min，500～800℃区间升温速率为6℃/min，800℃～900℃区间升温速率为10℃/min，并保温2h。升温结束后材料在气氛炉中缓慢冷却至室温得到具有三维网络空间结构的纳米碳纤维直径约为30nm，纤维上均匀分布有β-磷酸钙晶体。 

实施例3： 

将细菌纤维素置于6wt%的氢氧化钠水溶液高温蒸煮0.6h，并用去离子水清洗至中性。纯化处理后的材料放入0.9mol/L的硝酸钙水溶液中搅拌，以3ml/min的速率缓慢滴加入0.6mol/L磷酸氢二铵水溶液并用氨水控制整个反应过程中体系的pH值为10.1，钙离子与磷酸根离子的投料比为1：1.5。反应完毕后陈化16h。

反应后的材料在-30℃下冷冻12h，然后真空干燥48h。然后将材料放入气氛炉中在真空下由室温升温加热至1000℃，其中100～300℃区间升温速率为3℃/min，300～500℃区间升温速率为5℃/min，500～800℃区间升温速率为7℃/min，800℃～1000℃区间升温速率为10℃/min，并保温1h。升温结束后材料在气氛炉中缓慢冷却至室温得到具有三维网络空间结构的纳米碳纤维直径约为20nm，纤维上均匀分布有β-磷酸钙晶体。 

实施例4： 

将细菌纤维素置于7wt%的氢氧化钠水溶液高温蒸煮0.8h，并用去离子水清洗至中性。纯化处理后的材料放入0.75mol/L的硝酸钙水溶液中搅拌，以4ml/min的速率缓慢滴加入0.5mol/L磷酸氢二铵水溶液并用氨水控制整个反应过程中体系的pH值为9.7，钙离子与磷酸根离子的投料比为1：1.5。反应完毕后陈化12h。

反应后的材料在-40℃下冷冻24h，然后真空干燥24h。然后将材料放入气氛炉中在氮气保护下由室温升温加热至1100℃，其中100～300℃区间升温速率为1℃/min，300～500℃区间升温速率为5℃/min，500～800℃区间升温速率为6℃/min，800℃～1100℃区间升温速率为10℃/min，并保温1h。升温结束后材料在气氛炉中缓慢冷却至室温得到具有三维网络空间结构的纳米碳纤维直径约为10nm，纤维上均匀分布有β-磷酸钙晶体。 

实施例5： 

将细菌纤维素置于10wt%的氢氧化钠水溶液高温蒸煮0.5h，并用去离子水清洗至中性。纯化处理后的材料放入0.6mol/L的硝酸钙水溶液中搅拌，以5ml/min的速率缓慢滴加入0.4mol/L磷酸氢二铵水溶液并用氨水控制整个反应过程中体系的pH值为9.8，钙离子与磷酸根离子的投料比为1：1.5。反应完毕后陈化24h。

反应后的材料在-80℃下冷冻12h，然后真空干燥48h。然后将材料放入气氛炉中在氮气保护下由室温升温加热至1050℃，其中100～300℃区间升温速率为3℃/min，300～500℃区间升温速率为3℃/min，500～800℃区间升温速率为7℃/min，800℃～1050℃区间升温速率为10℃/min，并保温2h。升温结束后材料在气氛炉中缓慢冷却至室温得到具有三维网络空间结构的纳米碳纤维直径约为10nm，纤维上均匀分布有β-磷酸钙晶体。 

  

实施例6：

将实施例1-5制备的三维网络结构的纳米碳纤维复合β-磷酸钙处理成厚度为3mm、直径为4mm的圆片，经75％(v/v)的乙醇和紫外线照射对进行灭菌处理后，置于96孔板内，用DMEM培养液浸泡4h，去除培养液后在每孔中种植5×10⁴个人成骨样细胞MG-63细胞，置于37℃、饱和湿度、5％CO₂的培养箱内孵育8h，待细胞贴壁后补加培养基，继续进行培养，每天更换新鲜培养液。另用一组正常培养的作对照，相同条件下培养。培养1、3和5天后，去除培养液，用磷酸盐缓冲液淋洗后用2.5％(v/v)戊二醛固定1h，再用梯度浓度酒精进行脱水处理，室温真空干燥两天或冻干，用于电镜观察。培养1、3和5天的细胞增殖情况（MTT法，在570nm测定OD值）见表1。由表1可知，MG-63细胞在该材料上生长良好，在培养第3天后，增殖生长更加明显，这表明本发明的三维网络结构的纳米碳纤维复合β-磷酸钙能支持细胞生长和促进细胞增殖，有很好的生物相容性和生物活性，可作为骨组织修复材料应用于生物医用领域。

表1 纳米碳纤维复合β-磷酸钙的细胞增殖实验（n=8） 

培养天数对照组实施例1实施例2实施例3实施例4实施例510.13±0.020.15±0.030.14±0.040.15±0.020.14±0.010.16±0.0330.20±0.020.28±0.05*0.29±0.06*0.27±0.01*0.30±0.02*0.31±0.04*50.28±0.050.57±0.10**0.60±0.07**0.55±0.11**0.56±0.09**0.59±0.10**

（注：* P<0.05，** P<0.01，与对照组比较。）

实施例7

根据GB1040-79分别将β-磷酸钙晶粒（对照组1），以及实施例1-5得到的三维网络结构的纳米碳纤维复合β-磷酸钙制成弯曲强度测试试样和拉伸强度测试试样。用Instron1341材料试验机对试样进行弯曲性能测试和拉伸强度测试。

弯曲性能测试的检测环境为：加载速度10mm/分钟，室温：25℃，湿度：65％。计算公式为：σ_f = 3pL/2bh²，其中σ_f为弯曲强度（MPa）；p为破坏载荷（N）；L为试样的跨距（mm）；b为试样宽度（mm）；h为试样厚度（mm）。具体测试结果见表2。 

拉伸强度测试的检测环境为：加载速度10mm/分钟，室温：25℃，湿度：75％。计算公式为：σt = p/ah，其中σt为拉伸强度（MPa）；p为破坏载荷（N）；a为试样的中间宽度（mm）；h为试样厚度（mm）。具体测试结果见表2。 

根据表2数据可以看出，本发明的三维网络结构的纳米碳纤维复合β-磷酸钙的弯曲强度和拉伸强度都得到了显著提高，表明该材料具有良好的生物力学性能。 

表2 纳米碳纤维复合β-磷酸钙的弯曲强度和拉伸强度测试（n=6） 

指标对照组1实施例1实施例2实施例3实施例4实施例5弯曲强度/MPa122±2163±5*168±4*166±8*170±7*167±4*拉伸强度/MPa35±456±4*57±3*61±5*55±2*59±6*

（注：* P<0.05，与对照组1比较。）

实施例8

对照组1：动物骨缺损无修复实验，在10周龄、SD（Sprague Dawley）雄性大鼠的股骨远端内侧、人工造成的骨缺损（直径3mm，深2mm）内，不填入任何材料，直接缝合。

对照例2：动物骨缺损修复实验，在10周龄、SD（Sprague Dawley）雄性大鼠的股骨远端内侧、人工造成的骨缺损（直径3mm，深2mm）内，把与骨缺损同样大小的β-磷酸钙人工骨（ACPC）填入骨缺损区内，缝合。 

实施例1-5组：动物骨缺损修复实验，在10周龄、SD（Sprague Dawley）雄性大鼠的股骨远端内侧、人工造成的骨缺损（直径3mm，深2mm）内，把与骨缺损同样大小的实施例1-5得到的三维网络结构的纳米碳纤维复合β-磷酸钙填入骨缺损区内，缝合。 

将对照组1、2以及实施例1-5组大鼠于术后15、30和90天，应用小动物活体研究用micro-CT的影像进行新生骨骨量和新生骨骨密度的动态测量比较（结果见表3），以及病理组织学切片（H.E染色）的观察分析。病理切片结果显示，与对照组1-2相比，实施例1-5组的大鼠在手术后90日，即恢复成正常骨形态，骨皮质表面平滑、骨质致密。 

 表3 纳米碳纤维复合β-磷酸钙的骨缺损修复实验（n=3） 

（注：* P<0.05，** P<0.01，与对照组1比较；# P<0.05，## P<0.01，与对照组2比较。）