一组芽孢杆菌属(Bacillus)菌种检测探针

摘要

一组芽孢杆菌属（Bacillus）菌种检测探针，属于核酸检测领域。具体包括三条相互关联的寡核苷酸探针：用于特异性结合芽孢杆菌属的16SrRNA的分析探针、用于结合在载体上并与分析探针特异性结合的捕获探针以及用于与分析探针特异性结合的信号探针。分析探针具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；捕获探针具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，具有生物素标记；信号探针具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，在5′端有异硫氰酸(FITC)标记。在每毫升培养液B.subtilis菌体浓度在1.33×10

说明书

技术领域

本发明一组芽孢杆菌属（Bacillus）菌种检测探针，具体是针对传统发酵（白酒、酱油、醋等发酵）中芽孢杆菌属（Bacillus）实现定性与定量检测的特异性检测探针，属于核酸检测领域。 

背景技术

芽孢杆菌属细菌能在高温下生长，需氧或兼性厌氧，因此在白酒酿造过程中高温厌氧的特殊环境中芽孢杆菌能大量繁殖，并且芽孢杆菌具有一定的水解蛋白质和淀粉的能力，因此芽孢杆菌是白酒酿造过程中的优势菌种，且对于白酒独特风味形成有重要的贡献。因此，研究芽孢杆菌属在白酒发酵过程中的变化规律对于指导白酒生产有重要意义。由于白酒等传统发酵过程是多种微生物混合发酵的结果，研究特定属种的变化规律，需要定性定量的检测方法，目前常用平板分离，PCR技术、变性梯度电泳、测序等技术，各个方法均具有一定的优点和局限性，例如平板分离耗时耗力，仅能分析可培养微生物，定时定量PCR技术价格昂贵，对DNA纯化效率有很高的要求，重复性难等。 

国内有报道用改进的夹心杂交方法对海水中藻类、浸矿中功能菌进行定性定量检测，取得了较好的效果。如2004年上海交通大学李秀荣等根据尖刺拟菱形藻的rRNA的特异性序列设计了一组探针，实现了对该种藻的定性定量检测。 

但是由于白酒等传统发酵中微生物种类繁多，大曲及酒醅取样及处理困难，因此还未见用分子探针直接检测样品中芽孢杆菌属细菌的高效检测方法。 

因此，需要提供一种芽孢杆菌检测探针组合物，以快速定性定量检测白酒等传统发酵过程中芽孢杆菌属细菌，且检测方法操作简单、重复性好。 

发明内容

本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一组芽孢杆菌属（Bacillus）菌种检测探针，用于传统发酵（白酒、酱油、醋等发酵）行业中，特异性好、灵敏度高、稳定性高、定性定量。 

本发明的技术方案：为了实现上述目的，通过对NCBI Genbank中芽孢杆菌属（Bacillus）所有菌种的16S rRNA进行对比，找到7段属保守序列，将其进行Blastn比对，在915-975区域得到了芽孢杆菌属（Bacillus）的特异性序列。并根据这一特殊序列和夹心杂交方法设计出了一组芽孢杆菌属（Bacillus）菌种检测探针，具体包括三条相互关联的寡核苷酸探针：用于特异性结合Bacillus细菌的rRNA的分析探针，用于结合在载体上并与所述分析探针特异性结合的捕获探针，以及用于与所述分析探针特异性结合的信号探针；该检测探针在每毫升培养液芽孢杆菌属（Bacillus）细菌菌体浓度在1.33×10²~2.13×10⁵ 范围内与检测信号强度线性相关，R2 = 0.99741，而且特异性好、灵敏度高、稳定性高、定性定量，应用到白酒等传统发酵中芽孢杆菌属的实时监测。 

分析探针具有SEQ ID NO:1所示的寡核苷酸序列，长度为61nt，在进行生物信息学比对分析时，该分析探针仅与Bacillus属细菌的16S rRNA 915-975区域核苷酸互补，进行特异性结合，而与其他属的rRNA之间存在1个或1个以上核苷酸的连续错配或者缺失，不能很好地配对；与其它属无同源性，结合双特异性核酸检测方法，能够分辨16Sr RNA中探针结合部分仅差一个碱基的近缘属。 

捕获探针具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，长度为24nt，该捕获探针特异性结合于分析探针一端，在5'端标记有生物素，并通过生物素-链霉亲和素相互作用固定在所述载体上。 

信号探针具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，长度为26nt，该信号探针在3′端具有分析探针互补区，与分析探针互补结合，在5′端有异硫氰酸FITC标记。 

本发明的这组探针可用于以S1酶保护分析和夹心杂交技术检测样品中是否存在芽孢杆菌属（Bacillus）及其数量，所述的检测过程包括下列步骤： 

（1）将所述分析探针与所述rRNA杂交得到杂交产物：分析探针与rRNA分子杂交后形成DNA/RNA杂合体；

（2）在所述DNA/RNA杂合体产物中加入核酸S1酶消化处理得到消化产物：在S1酶的作用下，单链的DNA或RNA以及DNA/RNA杂合体的不匹配部分被消化，留下与目标RNA分子数量上相等的DNA/RNA杂合体；

（3）对所述消化产物进行变性处理得到变性产物：将DNA/RNA杂合体变性为DNA单链和RNA单链，变性方法可以采用该领域常用变性技术，例如热变性方法，由于单链RNA非常不稳定，很容易被RNA酶降解掉；

（4）将所述变性产物与固定在载体上的所述捕获探针杂交，然后洗涤；杂交后形成DNA/DNA杂合体，洗涤是为了除去非特异性吸附；

（5）加入所述信号探针与所述分析探针杂交，然后洗涤；杂交后形成夹心杂交复合体，洗涤同样是为了除去非特异性吸附；

（6）加入带酶标记的抗所述蛋白标记的抗体与所述蛋白标记进行杂交，然后洗涤；

（7）加入所述酶标记的底物以显色。

本发明的有益效果：该芽孢杆菌属（Bacillus）菌种检测探针设计巧妙，可以快速定性定量检测芽孢杆菌属（Bacillus）细菌，且检测方法操作简单、重复性好，适于大规模推广应用。 

（1）特异性好：由于传统发酵过程是多种微生物混合发酵的过程，对于特定菌种的检测就较为困难。本发明根据芽孢杆菌属（Bacillus）的16S rRNA序列中的特异序列作为靶序列，设计的一组探针，特异性高，对芽孢杆菌属（Bacillus）细菌的DNA相关序列具有高度专一性而对其他属细菌不具有同源性。 

（2）灵敏度好：本发明采用分析探针可以特异性识别靶序列，最后通过一系列反应显色，建立吸光度与菌浓之间的标准曲线，准确度可达90%以上，大大提高了检测精准度。最低检测限可达133个/mL。 

（3）稳定性高：由于检测过程中设计的分析探针会将菌体内不稳定的RNA信号转化为等量的DNA信号，将保证RNA分子在整个过程不被降解，其他步骤均是针对DNA进行的，从而大大提高了检测的稳定性。 

（4）定性定量：本探针对芽孢杆菌属（Bacillus）高度专一，并根据标准曲线得到对芽孢杆菌属（Bacillus）细菌的定量检测，打破传统方法的局限性，真正做到了对芽孢杆菌属（Bacillus）细菌的定性定量检测。 

附图说明

图1用本发明的检测探针检测白酒发酵中其他属细菌的检测结果比较。 

图2用本发明的检测探针检测芽孢杆菌属（Bacillus）细菌B.subtilis的标准曲线。 

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明，目的在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。在本实施例中，采用特异性探针对芽孢杆菌属（Bacillus）细菌进行检测，制作其标准曲线，并对其特异性进行验证。 

1.1芽孢杆菌属16S rRNA特定区域探针的设计与合成 

将Genbank中已有的芽孢杆菌属所有菌种的16S rRNA保守序列进行比对，找到芽孢杆菌属的保守序列，将其进行Blastn分析，确定915-975区域为芽孢杆菌属特异序列，而与其他属核苷酸无同源性，确定为特征区域，设计分析探针为：5’-AACGCTTGCC ACCTACGTAT TACCGCGGCT GCTGGCACGT 

AGTTAGCCGT GGCTTTCTGG T-3’（见SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列）；

根据上述探针设计合成检测所需其他探针：

捕获探针为5’-ACCAGAAAGC CACGGCTAAC TACG-3’ （见SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列），与分析探针的3'端互补，在5'端有生物素(Biotin)标记；

信号探针为5’-GCGGTAATAC GTAGGTGGCA AGCGTT-3’ （见SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列），与分析探针的5'端互补，在3'端有异硫氰酸（FITC）标记。

1.2准备阶段 

1.2.1链霉亲和素包被板制备：

链霉亲和素用包被液配成5μg/mL，向微孔板各孔内加入100pL，用封口膜封好后于4℃过夜，次日取出，用PBST洗涤液洗涤3次，再用0.1%BSA（0.01mol/L PBS pH7.2）250μL，在37℃下封闭60min，最后用PBST洗涤液洗涤3次，干燥后封好于4℃下保存待用，可保存2月。

1.2.2捕获探针固定化: 

100μL（500nM溶于pH7.2 PBS）捕获探针加入链霉素包被微孔板，于37℃下保温2h，并用洗涤液PBST冲洗3次，随后储存于4℃下。

1.2.3菌株胞内物质获取: 

取对数期裂解枯草芽孢杆菌（B.subtilis）显微镜计数计算菌浓，取2mL离心（2000r/min，2min），取上清液离心（12000r/min，10min），除去上清液，加2mL裂解缓冲液（80%甲酞胺，450mM NaCl，5mM Na₂EDTA，1mg/mL yeast tRNA，1% SDS，pH6.4）并超声破碎（50%占空比，共8min），收集滤液待用。

进行枯草芽孢杆菌的检测曲线分析时，将过滤收集到的枯草芽孢杆菌样品用含有S1酶保护分析探针的裂解液2倍逐级稀释11次共获得12个样品。 

进行芽孢杆菌的特异性验证时，将其他白酒发酵中细菌：葡萄球菌，假单胞菌、醋杆菌属细菌分别进行上述处理作为对照。 

1.3  RNA信号转化阶段 

1.3.1 分析探针与目标序列结合

加入100μL枯草芽孢杆菌样品，50μL矿物油，15μL 500nmol/L的分析探针（采用上述裂解缓冲液稀释），95℃水浴处理15min，37℃水浴处理1h。

1.3.2核酸S1酶消化处理 

加入100μL的核酸S1酶（100U于1.4M NaCl，22.5mM ZnSO₄、250mM CH₃COONa、pH 4.5），40℃水浴处理30 min。

1.3.3 DNA/RNA变性反应 

加入500μL终止缓冲液（62.5mM NaOH、30mM EDTA、0.5M PBS、pH7.2），95℃处理15 min，DNA-RNA杂合体变性形成单链DNA和单链RNA。与此同时，单链RNA被降解，因此溶液中仅含结合于靶序列的分析探针。

1.4夹心杂交阶段 

1.4.1捕获探针捕获分析探针

将100μL上述反应混合液分别移入到预固定有捕获探针的酶标板微孔中，50℃杂交1小时，然后用pH7.2、0.01mol/L的PBS缓冲液洗涤三次。

1.4.2形成夹心杂交 

每孔加入含有100μL 500nM连接探针的杂交缓冲液（4×SSC、10%甲酞胺、0.02%SDS、pH7.2），于50℃杂交30 min，用0.1mol/L，pH7.2 PBS洗涤三次。

1.5信号检测阶段 

1.5.1抗荧光素抗体结合信号探针

每孔加入100μL含有标记了辣根过氧化物酶的抗荧光素抗体（1:5000稀释于PBS，0.1%牛血清白蛋白），37℃保温30 min，然后用PBS洗4次。

1.5.2显色 

每孔加入TMB显色液（用无水乙醇，将TMB配成1%浓度，4℃保存半年以内使用。使用前，用pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲液9.9mL加入0.1mL 1% TMB液，再按每毫升TMB加入30 %的H₂O₂ 1μL，混匀后立即使用）100μL，37℃处理15 min后，每孔加入100μL 2mol/L硫酸终止反应。将酶标板置于读板机上于450nm和630nm测定光吸收值。

1. 6 结果 

检侧结果如图1和图2所示。

图1显示了用针对芽孢杆菌属的检测探针组合物探测各种白酒发酵中细菌的检测结果，证明了本发明方法具有极高的可行性和特异性。本实验所用菌种的探针对应序列比较见表1： 

         表1.   NPA探针及各菌种16S rRNA目标片段序列

底划线处表示与目标片段序列对应位置不同的核苷酸。

图2是采用本发明的芽孢杆菌检测探针组合物的一具体实施例对芽孢杆菌B.subtilis检测的标准曲线。 

得到标准曲线公式，即检测公式如下： 

y= -0.12738 + 0.25533x 

R2= 0.99741

x为样品中枯草芽孢杆菌数的对数，y为实际测定的OD450/630nm. R为相关系数。

因此，采用本发明的芽孢杆菌属检测探针组合物，可以对芽孢杆菌属细菌定性定量检测，首先提取16SrRNA靶序列，分析探针预期杂交，核酸S1酶去除错配以及单链DNA，变性后与以固定在孔上的捕获探针杂交，最后与带有荧光物质的信号探针杂交，通过蛋白大分子的特异性与抗体结合，最后在显色系统，如四甲基联苯胺，邻苯二胺等显色，然后读出检测信号，即可确定rRNA的种类和数量。 

综上所述，本发明的该芽孢杆菌属检测探针组合物设计巧妙，可以快速定性定量检测芽孢杆菌，且检测方法操作简单、重复性好，适于大规模推广应用。 

<160>  3    

 

<210>  SEQ ID NO:1

<211>  61

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)...(61)

<223>  特异性结合芽孢杆菌属的rRNA的分析探针的核苷酸序列

 

<400>  1

aacgcttgcc acctacgtat taccgcggct gctggcacgt agttagccgt ggctttctgg t      61                                                         

 

<210>  SEQ ID NO:2

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)...(24)

<223>  特异性结合分析探针的捕获探针的核苷酸序列

 

<400>  2

accagaaagc cacggctaac tacg     24

 

<210>  SEQ ID NO:3

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)...(26)

<223>  特异性结合分析探针的信号探针的核苷酸序列

 

<400>  3

gcggtaatac gtaggtggca agcgtt     26