丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒及其检测方法

摘要

本发明公开了一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒，包括包被有HCV嵌合抗原及HCV单克隆抗体的微孔板、样品稀释液、HCV抗原抗体联合检测酶工作液、HCV抗体酶工作液、HCV抗原酶工作液、底物A液、底物B液、20倍浓缩洗涤液及终止液。本发明同时公开了本试剂盒中关键组份如HCV嵌合抗原及HCV单克隆抗体的微孔板、样品稀释液、酶工作液的稀释液的配制及其使用。本发明公开的试剂盒及其检测方法既可以同时检测HCV抗原和抗体，也可以单独检测丙型肝炎早期、急性感染期及在抗体产生之前或已经形成抗原-抗体复合物时HCV抗原的情况，或单独检测抗体产生后HCV抗体的情况，可用于HCV的早期检测及治疗评价，为指导临床提供重要的检测评价指标。

说明书

技术领域

本发明属免疫检测技术领域，具体来说涉及一种丙型肝炎病毒（HCV）抗原抗体联合检 测试剂盒及其检测方法。

背景技术

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）感染而引起的一种的全球性传染病。 据估计，目前全世界有1.7亿丙肝病毒感染者，我国的丙肝感染率大约为3.2%，目前至少有 4000－6000万丙肝患者。丙型肝炎的慢性化发生率明显高于乙型肝炎，且较乙型肝炎易早期 出现肝硬化，导致肝癌,病死率较高，尤其是HCV的早期诊断对于筛查HCV的传染源、指导 临床治疗和预后判断有重大意义。因此，有必要寻找一种简易的、准确的、价格低廉的和可 以普遍推广的方法来实现对HCV的检测，对发展中国家尤其如此。

HCV病毒属于黄病毒科，其基因组为单股RNA，约9.4kb,易变异。HCV基因组由一个 大的开放阅读框（ORF）组成，编码10余种结构和非结构（NS）蛋白。编码一个3010～3 033氨基酸的多聚蛋白，排列顺序为5′UTR--C2--E1--E2--NS2--NS3--NS4--NS5--3′UTR, 其中C为核心蛋白,E1和E2为囊膜蛋白,NS为非结构蛋白.NS5B蛋白是RNA依赖RNA聚 合酶，为HCV复制所需，是抗病毒治疗的重要靶位。在开放阅读框上游有一个341个核苷酸 的5’UTR区域是所有HCV基因型的基因组中最为保守的区域，不同基因型具有90%的相似 性，已成为HCV分子诊断技术的研究焦点。

目前丙型肝炎的主要检测方法均有一定局限性：

1、丙型肝炎抗体检测：是现在使用最广泛的检测方法，但其缺点一是存在“窗口期”，HCV 感染后至抗HCV抗体产生之前还有一段约40－70天的较长时期（平均66天），此时，献血 员已被感染并具有感染性，应用目前的抗体检测试剂不能检出，该阶段称为感染后血清阳转 前的窗口期（perseroconversion window phase,PWP）.PWP的存在是输血安全的重要威胁之一， 使受血者依然有经输入抗HCV筛选阴性的血液而感染HCV的危险。目前丙型肝炎的输血后 感染占肝炎病例的70%，而在丙型肝炎感染者中更有80-90%是属于输血后感染，这在很大程 度上鉴于上述原因。

2、HCV RNA检测：主要用于抗病毒治疗的选择与疗效监测，但它需严格按PCR操作规 程操作，检测人员需经专业培训并取得相应资质，且样本的质量控制要求高，要求采血后2 小时内低温条件下送检，无菌抽提RNA，容易因仪器、试剂、人员及环境等造成误差，产生 假阳性及假阴性。

3、丙肝抗原检测：在HCV RNA出现后的1-2d内即出现丙型肝炎病毒HCV抗原，且与 HCV RNA的水平相平行，可以作为HCV复制的标志。有研究表明，HCV抗原检测与抗体 检测相比，HCV抗原的检测可使检测的窗口期平均提前49天，缩短窗口期HCV感染的风险。

丙肝抗原抗体联合检测试剂盒可用于HCV的血源筛查同时检测丙肝抗原及抗体，既可提 高用血及输血安全，同时也提高了工作效率及节约成本；此外本试剂盒及其检测方法可区分 是HCV现症感染还是既往感染，可用于HCV的早期检测及治疗评价，为指导临床提供重要 的检测评价指标。

目前针对丙肝抗原抗体联合检测的相关专利如下：

（1）丙型肝炎病毒抗原抗体时间分辨免疫荧光分析法联合检测及检测试剂盒（申请号： 201210385472.4）。

（2）酶免疫分析法直接标记抗原检测丙型肝炎病毒抗原抗体及检测试剂 盒（申请号：201210391183.5）。

（3）化学发光法直接标记抗原检测丙型肝炎病毒抗原抗体及检测试剂盒（申 请号：201210376965.1）。

（4）一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测的方法（申请号：200810143274.0）。

（5）Methods for the simultaneous detection of HCV antigens and HCV antibodies(PCT/US02/19958).

上述专利均提出了丙肝抗原抗体联合检测的方法，并均提出采用互相不反应的HCV单 克隆抗体及HCV重组抗原作为包被原料，可实现丙肝抗原抗体联合检测的目的。其中申请号 为201210385472.4、201210391183.5和201210376965.1的专利分别提出了可以采用时间分辨 免疫荧光分析法、酶免疫分析法和化学发光法进行检测，但对如何实施的具体方法未详细介 绍。申请号为200810143274.0的专利介绍了如何制备用于包被和检测的HCV单克隆抗体和 HCV嵌合抗原及检测步骤，并提到了8条引物，并对这8条引物及由此制备的HCV单克隆 抗体和HCV嵌合抗原进行了保护，但也未详细介绍如何制备试剂盒的具体方法。

美国专利PCT/US02/19958详细的介绍了制备用于包被和检测的HCV单克隆抗体和HCV 嵌合抗原，并设计了37条不同的引物，制备出多个HCV单克隆抗体和HCV嵌合抗原，组 合出数十个可用于联合检测的抗原及抗体组合，并提到了一种丙肝抗原检测样品稀释液，详 细说明了其配制方法及效果。

但在上述专利的基础上仍有以下问题未解决：

1、包被问题：因同时将相对应的抗原和抗体包被于微孔板上即使互相之间不反应，便因 一蛋白会覆盖住另一蛋白或占优势，而使其中的另一种捕获能力大大减弱，使丙肝抗原抗体 同时检测的目标大大受到影响。再由于蛋白包被于微孔板上主要靠疏水键、离子键等。同时 包被抗原及抗体由于二者等电点相差远，很难做到二者均足够量且稳定的包被于微孔上。虽 然上述专利均有介绍包被方式，但均仍是传统的单一物种蛋白的包被方式，无法做到二者兼 顾。

美国专利PCT/US02/19958对其每一种组合原料的使用均介绍了其包被方式，但其介绍 的方法均为在微球上包被，再将不同的微球组合使用的方式，没有提到如何将同种的抗原和 抗体同时包被于聚苯乙烯微孔板这种固相载体上的方式。

2、丙肝抗体在血液中含量多，且丙肝抗体检测因用于检测的核心区抗原有很强的体内或 体外的同源及异源结合能力，易引起本底高直至假阳性（Mastumoto，M.等，Virology，218： P43-51，1996；Kunkel，M.等，Virology，294:P239-245，2002；Majeau，N.等，Journal of  General Virology，85：P971-981，2004）。因此用检测丙肝抗体时用的样本量要求非常少，目 前常见丙肝抗体检测试剂盒中样本量一般为10ul；而丙肝抗原在血液中含量非常少，检测样 本是对样本量的要求非常多，目前常见丙肝抗原检测试剂盒中样本量一般为100ul。因此二者 同时检测时对样本量要求上存在一定矛盾。

由于患者在感染丙肝病毒品约一段时间后（平均49天）会产生抗体，形成抗原抗体免疫 复合物，当产生抗原抗体免疫复合物后，因游离的抗原减少，使丙肝抗原的检出率大大降低。

虽然美国专利PCT/US02/19958介绍了一种丙肝抗原样品稀释液，从它的专利中可以看 出它可以使抗原的检出率大大提高。但是它含有大量的去垢剂和蛋白变性剂，如它例举的一 种释释液的组合为0.1M pH7.2的PB，0.01M EDTA，0.5M NaCL，2%SB-16，1.10%CTAB， 1.8%Triton-x100，2.5M Urea，1%BSA，2%mouse serum.其中的SB-16，1.10%CTAB等均已 达到或接近在溶液中的溶解度上限，可能会造成难以溶解。而且其适用于丙肝抗原检测，是 否适用于丙肝抗体检测并未提及。且CORE区抗原有很强的体内或体外的同源及异源结合能 力此结合能力会使用CORE区抗原或CORE嵌合抗原在检测样本时因异源结合造成高本底甚 至假阳性的情况。

3、如果检测出样本为阳性，因无法确认到底是丙肝抗原阳性还是丙肝抗体阳性或者是二 者双阳性，而需另外再配以其它独立的检测试剂盒进行检测。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种丙型肝炎病毒（HCV）抗原抗体联合检测试剂盒 及其检测方法。

本发明所述的丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒，包含如下组份：包被有HCV嵌合 抗原及HCV单克隆抗体的微孔板、样品稀释液、酶工作液，其特征在于：所述微孔板制备时 用含有离子表面活性剂和还原剂的包被缓冲液包被，其中离子表面活性剂选自十二烷基氨基 丙酸、十二烷基二甲基胺乙内酯或溴化十六烷基三甲基铵（CTAB），还原剂选自半胱氨酸、 二硫苏糖醇（DTT）、还原型谷胱甘肽或β-巯基乙醇，所述样品稀释液是含有还原剂、小鼠 IgG和蛋白沉降剂硫酸铵的溶液，其中还原剂选自半胱氨酸、二硫苏糖醇（DTT）、还原型谷 胱甘肽或β-巯基乙醇，所述酶工作液是包含有HCV抗原抗体联合检测酶工作液、HCV抗原 检测酶工作液和HCV抗体检测酶工作液的三个独立包装。

上述丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒中：所述离子表面活性剂为溴化十六烷基三 甲基铵（CTAB），使用浓度为0.01wt%～1.3wt%；所述还原剂为二硫苏糖醇（DTT），使 用浓度为0.01wt%～2wt%。

进一步优选的实施方式是：所述离子表面活性剂为溴化十六烷基三甲基铵（CTAB），使 用浓度为0.08wt%～0.5wt%；所述还原剂为二硫苏糖醇（DTT），使用浓度为0.05wt%～ 1.0wt%。

最优选的实施方式是：所述离子表面活性剂为溴化十六烷基三甲基铵（CTAB），使用浓 度为0.1wt%；所述还原剂为二硫苏糖醇（DTT），使用浓度为0.1wt%。

上述丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒中：所述样品稀释液中的还原剂为半胱氨酸， 使用浓度为20mM。

上述丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒中：所述样品稀释液中小鼠IgG的使用浓度 为1mg/ml。

上述丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒中：所述样品稀释液中蛋白沉降剂硫酸铵的 使用浓度为25wt%。

上述样品稀释液最优选的配方是：5mM EDTA，1%BSA，1mg/ml小鼠IgG，1%SB-12、 1%CTAB、1%Triton-X114，20mM的半胱氨酸，25%（NH₄）₂SO₄，2.5M Urea，0.01Proclin300， 1×PBS，PH5.8。

上述丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒中：所述酶工作液用如下配方的稀释液稀释： 5%山羊血清、1％硫柳汞、1%PVP、1%BSA、5%葡聚糖T2000、0.5%酪蛋白、10mg/ml庆 大霉素、0.01M pH7.4PBS。

本发明所述丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒的应用中：所述酶工作液中的HCV抗 原抗体联合检测酶工作液、HCV抗原检测酶工作液和HCV抗体检测酶工作液三个独立包装， 分别在联合检测HCV抗原和抗体、丙肝抗体及丙肝抗原检测三种不同情境下使用。

本发明提供一种新的包被工艺制备的丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒，它可以使 捕获用的丙肝嵌合抗原及单克隆抗体均足够量且稳定的包被于微孔上；本发明提供的样品稀 释液可适用抗原抗体联合检测，它既可以提高抗原检测的灵敏度，减少抗原检测时所需血浆 （或血清）量，又可以大大降低抗体检测时的本底；另外本发明提供了一种可使用一个试剂 盒随机组合以实现可随意检测抗原、抗体或抗原抗体同时检测的目的。

本发明公开的试剂盒及其检测方法既可以同时检测HCV抗原和抗体，也可以单独检测丙 型肝炎早期、急性感染期及在抗体产生之前或已经形成抗原-抗体复合物时HCV抗原的情况， 或单独检测抗体产生后HCV抗体的情况。本发明的试剂盒及其检测方法可用于HCV的血源 筛查同时检测丙肝抗原及抗体，既可提高用血及输血安全，同时也提高了工作效率及节约成 本；此外本发明公开的试剂盒及其检测方法可区分是HCV现症感染还是既往感染，可用于 HCV的早期检测及治疗评价，为指导临床提供重要的检测评价指标。

具体实施方式

实施例1 丙型肝炎病毒嵌合抗原及丙型肝炎病毒单克隆抗体的微孔板的制备

（1）通过对HCV的序列分析、嵌合体的设计重构HCV核心抗原和其它非结构蛋白的 嵌合抗原，克隆不同表位的单克隆抗体，使同时包被抗原抗体时两者不能相互结合，避免影 响待测样品中相应HCV抗体和HCV-cAg的结合。经序列分析及嵌合体设计好后，抗原及单 克隆抗体的制备方法参照《分子克隆》上的常规方法进行操作。

A、抗原的制备及纯化鉴定

①提取HCV病毒的总RNA；

②RT-PCR扩增分片段克隆NS-3，NS-4和Core的相应基因片段；

③克隆到表达载体pRSET上；

④外源基因在宿主细胞中的诱导表达，采用亲和层析纯化目标抗原；

⑤Western blot法鉴定活性。

B、杂交瘤细胞的建立

①免疫动物；

②细胞融合及克隆化；

③腹水制备；

④mAb的特性鉴定（ELISA法）。

（2）由于蛋白包被于微孔板上主要靠疏水键、离子键等。同时包被抗原及抗体由于二 者等电点相差远，由于蛋白包被于微孔板上主要靠疏水键、离子键等。同时包被抗原及抗体 由于二者等电点相差远，很难做到二者均足够量且稳定的包被于微孔上。

本发明通过在包被液中引入离子表面活性剂及还原剂，采用中性缓冲液的方式解决了上 述问题。

因为离子表面活性剂在包被液中会解离出阴离子及阳离子，分别与包被重组抗原及单克 隆抗体形成两种复合物，使复合物的电荷远远超过重组抗原及单克隆抗体，从而使二者与更 好的包被于微孔板上。

本发明实施方案中所述离子表面活性剂包括但不限于十二烷基氨基丙酸、十二烷基二甲 基甜菜碱、溴化十六烷基三甲基铵（CTAB）。本发明中包被液中的CTAB的浓度为0.01%～1.3%, 优选为0.05～1.0%，更优透为0.08～0.5%,最优选为0.1%。

表1 包被液中CTAB对HCV抗原抗体联合检测试剂盒灵敏度的影响

还原剂通过改变蛋白中的二硫键而改变蛋白构象，本发明中通过在包被液中加入还原剂, 使包被蛋白的折叠状态被打开，成为平展状态，更好更紧密的吸附于微孔板上。同时也使检 测位点因被打开而更好的暴露，使检测灵敏度大大提高。

此外HCV的主要抗原表位区段NS3抗原含有多个半胱氨酸残基（仅a.a1196-1473就有 7个Cys），当重组表达时，此蛋白可能形成错配的二硫键，从而改变天然的构锡，导致NS3 抗原活性降低，CORE抗原表位也因为暴露不充分而引起活性降低。我们在包被液中加入不同 浓度的DTT，结果显示还原剂在一定的程度上提高HCV抗原的活性，表明重组HCV抗原存在 着错配二硫键，而还原试剂的处理使错配二硫键能够重新打开，让HCV抗原恢复原来的构象。

本发明实施方案中所述还原剂包括但不限于半胱氨酸、二硫苏糖醇（DTT）、还原型谷 胱甘肽、β-巯基乙醇。本发明中包被液中的DTT的使用浓度为0.01%～2%，优选浓度为 0.05%～1%，最优选为0.1%。

表2 包被液中DTT对HCV抗原抗体联合检测试剂盒灵敏度的影响

表面活性剂、还原剂的选择和用量及包被的具体工艺如下：

（2）配制抗原抗体包被液的配制：1×PBS（PH7.2）将5ug/ml纯化的抗HCV单克隆抗体 和100ng/ml的HCV嵌合抗原用（1×PBS，0.1%的CTAB，0.1%DTT）稀释后以200ul/孔加入 微孔板中，4℃放置过夜，再经1×PBS（PH7.2）洗涤2次，加封闭液（2%海藻糖，1%BSA,1% 的酪蛋白钠盐及1%的色氨酸，1×PBS PH7.2）250ul/孔，4℃放置过夜后弃去孔内液体后于 室温，湿度<30%干燥4h±0.5h,干燥完全后真空封装2～8℃保存。

两种不同包被工艺处理的实验结果对比见表3。

表3两种不同包被工艺处理的实验结果对比

A组板与B组板配合相应酶标二抗经37℃考核3天，检HCV国家标准盘，结果见表4。

表4与中国药品生物制品检定所HCV国家标准盘比较

  A组 B组 阴性参考品符合率 30/30 30/30 阳性参考品符合率 30/30 26/30 精密度 3.34% 6% 结果 符合规定 不符合规定

实施例2 样品稀释液的配制

丙肝抗体在血液中含量多，且丙肝抗体检测因用于检测的核心区抗原有很强的体内或体 外的同源及异源结合能力，易引起本底高直至假阳性的因此用检测丙肝抗体时用的样本量要 求非常少，目前常见丙肝抗体检测试剂盒中样本量一般为10ul；而丙肝抗原在血液中含量非 常少，检测样本是对样本量的要求非常多，目前商品化的丙肝抗原检测试剂盒中样本量要求 均为100ul。因此二者同时检测时对样本量要求上存在一定矛盾。

本发明通过在样品稀释液中添加蛋白沉降剂及还源剂、去垢剂等使丙肝抗原更好的暴露 出来，提高灵敏度，同时降低本底的作用，而使丙肝抗原检测时血液需求量降低。由于人血 清中异常的IgG，如系统性红斑狼疮、多发性骨髓瘤等病症时或血清中的风湿小体和其它异 常IgG会引起本底升高或假阳性。本发明于样品稀释液中添加小鼠IgG。

表5 添加小鼠IgG浓度对本底控制及阴性样本的影响

样本 基础样本稀释液加小鼠IgG 基础样本稀释液不加小鼠IgG N1 0.023 0.123 N2 0.021 0.144 N3 0.029 0.156 N4 0.015 0.102 N5 0.051 0.256 N6 0.023 0.223 N7 0.021 0.119 N8 0.010 0.092 N9 0.017 0.267 N10 0.021 0.227

注：上述样本为类风湿因子或红斑狼疮阳性样本但丙肝抗原均为阴性的干扰性样本。

还原剂的处理使错配的二硫键打开，恢复HCV抗原的构象，提高检测的灵敏度，我们在 样品稀释液中加也还原剂也得到了同样的效果。我们在样品稀释液中使用的还原剂为半胱氨 酸。

为了验证所配制的样本稀释液是否同时适用于丙肝抗原抗体的联合检测，本发明在实施 方案中的阳性样本均采用10份抗原阳性样本加10份抗体阳性样本，计算20个样本的平均值 的方式进行统计比较。

表6样品稀释液中半胱氨酸对HCV抗原抗体联合检测试剂盒灵敏度的影响

注：所检测的阳性样本为10份抗原阳性样本加10份抗体阳性样本，计算20个样本的平 均值

为了进一步减少样本量的使用，我们研究发现在样本中加入（NH₄）₂SO₄及尿素（Urea）， 可以使样本中蛋白聚沉而更好地与包被于聚苯乙烯微孔板上的捕获蛋白反应而提高灵敏度， 使样本量的使用减少。

表7样品稀释液中（NH₄）₂SO₄对联合检测试剂盒灵敏度的影响

注：所检测的阳性样本为10份抗原阳性样本加10份抗体阳性样本，计算20个样本的平 均值

表8 样品稀释液中Urea对联合检测试剂盒灵敏度的影响

注：所检测的阳性样本为10份抗原阳性样本加10份抗体阳性样本，计算20个样本的平 均值

另外本发明对不同PH值的缓冲液比较发现，偏酸性的样品稀释液，对本样稀中SB-12、 25%（NH₄）₂SO₄，2.5M Urea、1%CTAB的溶解度更好，但不影响检出效果。

最终确定样品稀释液的具体配制如下：5mM EDTA，1%BSA，1mg/ml小鼠IgG，1%SB-12、 1%CTAB、1%Triton-X114，20mM的半胱氨酸，25%（NH₄）₂SO₄，2.5M Urea，0.01Proclin300， 1×PBS，PH5.8。

通过使用新的样品稀释液，最终检测时，所需样本量为50ul时即可实现丙肝抗原抗体同 时检测也均能达到很好的效果。

实施例3 酶工作液的制备及检测操作过程

（1）酶标蛋白的制备：取适量的辣根过氧化物酶（按1mg蛋白加1mg HRP量取），按5 mg HRP溶于1.0ml NaHCO₃溶液，充分溶解HRP。加入适量0.06M NaIO₄室温避光搅拌30 分钟。移入透析袋，用0.01M pH9.6碳酸盐缓冲液透析过夜。取纯化待标记的蛋白适量，用 0.01M NaHCO₃溶液充分溶解，与酶液混合，装入透析袋，用0.01M pH9.6碳酸盐缓冲液4℃ 避光透析20小时，中间换液3次。取透析后结合液，加入0.4%NaBH₄(按5mg HRP溶于0.2ml  NaBH4溶液计)搅拌30分钟后，4℃放置4小时。将酶结合物装入透析袋，用PH7.20.01M PBS 透析48小时。Sephadex G-200凝胶过滤：将透析液上Sephadex G-200层析柱，用PH7.2 0.01M  PBS洗脱，收集第一个的洗脱峰，再用PEG2000浓缩质测量浓缩液体积，取小样0.1ml，送 检。其余浓缩液加等体积甘油，－20℃保存备用。酶标抗体效价滴定：抗人IgG酶标记物采 用方阵滴定，以间接ELISA法测定效价不低于1：5000倍方可用于试剂盒的制备。

本试剂盒中检测用的酶标记单克隆抗体及酶标记重组抗原分别标记。

（2）酶稀释液的配制：为了配制可同时适用于丙肝抗原酶标蛋白+丙肝抗体酶标蛋白、丙 肝抗体酶标蛋白及丙肝抗原酶标蛋白的酶稀释液，制备出HCV抗原抗体联合检测酶工作液、 HCV抗原检测酶工作液和HCV抗体检测酶工作液。我们配制优化出了两组稀释液进行了比 较。

A、山羊血清(10%)

1％硫柳汞

BSA(1%)

酪蛋白(0.3%)

10mg/ml庆大

0.01MPBS(PH7.4)

B、山羊血清(5%)

1％硫柳汞

PVP(1%)

BSA(1%)

葡聚糖T2000(5%)

酪蛋白(0.5%)

10mg/ml庆大

0.01MPBS(PH7.4)

表9 A组酶标记物稀释液的确定试验

样本 HCV抗原抗体联合酶工作液 HCV抗原酶工作液 HCV抗原酶工作液 P1 1.765 1.102 0.305 P2 1.123 0.877 0.672 P3 1.321 0.987 0.573 P4 1.634 1.296 0.263

P5 2.110 1.291 0.189 N1 0.027 0.023 0.029 N2 0.018 0.021 0.022 N3 0.020 0.018 0.022 N4 0.029 0.026 0.025 N5 0.017 0.019 0.022

注：P1-P5样本为丙肝抗原抗体均为阳性的样本，N1-N5为丙肝抗原抗体均为阴性的样本。

表10 B组酶标记物稀释液的确定试验

样本 HCV抗原抗体联合酶工作液 HCV抗原酶工作液 HCV抗原酶工作液 P1 2.765 2.102 0.805 P2 2.345 1.830 1.072 P3 2.861 1.987 1.031 P4 3.034 2.296 1.263 P5 3.011 1.291 0.189 N1 0.030 0.033 0.029 N2 0.028 0.031 0.032 N3 0.030 0.028 0.032 N4 0.039 0.036 0.035 N5 0.047 0.049 0.052

注：P1-P5样本为丙肝抗原抗体均为阳性的样本，N1-N5为丙肝抗原抗体均为阴性的样本。

根据实验结果，选择组B配方为最佳酶稀释液。

（3）酶工作液

如果检测出样本为阳性，因无法确认到底是丙肝抗原阳性还是丙肝抗体阳性或者是二者 双阳性，而需另外再配以其它独立的检测试剂盒进行检测。

本方明通过将酶工作液分为三个独立包装（分别为HCV抗原抗体联合检测酶工作液、HCV 抗体酶工作液及HCV肝炎抗体酶工作液），分别在丙肝抗原抗体联合检测、丙肝抗体及丙肝 抗原检测时三种不同情境下使用，从而实现了使用一套试剂盒即可解决上述矛盾。

（4）检测操作过程：

①取出试剂，于室温平衡30分钟，包被板均需留空白、阴、阳性对照各双孔。空白孔加 100μl空白对照液，阴、阳性对照孔加50μl阴、阳性对照血清，其余孔加待测样品50μl，除 空白孔外，每孔加入50μl样品稀释液，混匀后37℃温浴60分钟。

②用1:20稀释后的洗涤液洗板6次，洗涤间隔应控制30秒，最后一次拍干。

③除空白孔外，每孔加100μl HCV抗原抗体联合检测酶工作液，37℃温浴30分钟，剩 余酶工作液4℃保存。

④洗板同②。

⑤先加入显色剂A液50μl再加入显色剂B液50μl，37℃温浴避光显色10分钟。

⑥每孔加50μl终止液。终止后10分钟内测OD值。

⑦结果判定：OD值≥参考值时，结果为阳性；OD值<参考值时，结果为阴性。

⑧对检测结果为阳性的样本复查时可采用本试剂盒中独立包装的HCV抗原检测酶工作 液、HCV抗体检测酶工作液进行区分是抗原阳性还是抗体阳性，其检测步骤同上述①—⑦， 但在第③步，检测抗原时改为加HCV抗原检测酶工作液，检测抗体时改为加HCV抗体检测 酶工作液。